Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Gli autori ringraziano Sophie Patrier e Marianne Parésy per aver condiviso il protocollo originale della citometria di flusso, e Promega e Qiagen per la fornitura di rifornimenti e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Réseau Québécois en Reproduction e dal Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) a R.S.

Questo studio di ricerca è stato approvato dal McGill Institutional Review Board. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso scritto per partecipare allo studio e per avere i loro prodotti FFPE di concepimento (POC) recuperati da vari reparti di patologia.
 NOT:</</c0> Mentre ci sono diversi metodi per la genotipizzazione e la determinazione ploidia per citometria di flusso, i protocolli qui forniti descrivono un metodo di analisi utilizzando una piattaforma per ciascuno....

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	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

Le HM sono gravidanze umane anormali con eziologie eterogenee e hanno diversi tipi istologici e genotypic, il che rende la loro classificazione e diagnosi accurate impegnative. La valutazione morfologica istopatologica è stata spesso dimostrata imprecisa ed è quindi inaffidabile da sola per classificare HM in CHM e PHM e distinguerli da aborti non molari. Pertanto, una diagnosi accurata di HM richiede l'uso di altri metodi come la genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex, l'analisi della ploidia per citometria...

Una talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da sviluppo embrionale anormale, iperproliferazione del trofoblasto e degenerazione ipicca di villi cirionico (CV). Storicamente, HM era diviso in due tipi, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM) basato solo sulla valutazione morfologica1. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica da sola non è sufficiente per classificare HM nei due sottotipi (CHM e PHM) e distinguerli da aborti non molori2,3,4.
Poiché CHM e PHM hanno diverse propensioni alle neoplasie, è quindi importante determinare con precisione il tipo genotypic di HM per fornire un adeguato follow-up e gestione ai pazienti. Di conseguenza, negli ultimi decenni, diverse metodologie sono state sviluppate ed evolute allo scopo di identificare il contributo dei genitori ai tessuti molari e raggiungere una corretta classificazione dell'HM. Questi includono l'analisi del cariotipo, il polimorfismo delle bande cromosomiche, la tipiagrafia sierologica dell'antigene leucocito umano (HLA), il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione, il numero variabile di ripetizioni tandem, la genotipizzazione dei microsatelliti, la citometria di flusso e il p57 immunohistochimica KIP2. Ciò ha permesso una suddivisione accurata delle concezioni HM in base al contributo dei genitori al loro genoma, come segue: CHM, che sono diploidi androgenetici o diploidi dispermiati, e PHM, che sono triploidi, dispermiche nel 99% e monospermico nell'1% dei casi5,6,7,8. Inoltre, c'è un altro tipo genotypic di HM che è emerso negli ultimi due decenni, che è biparentalo diploide. Quest'ultimo è per lo più ricorrente e può interessare un singolo membro della famiglia (casi simplex) o almeno due membri della famiglia (casi familiari). Queste talpe biparentali diploidi sono per lo più causate da mutazioni recessive in NLRP7 o KHDC3L nei pazienti9,10,11,12. Diploid biparentalHM in pazienti con mutazioni recessive in NLRP7 può essere diagnosticato come CHM o PHM da analisi morfologica e questo sembra essere associato con la gravità delle mutazioni nei pazienti13,14. Oltre alla classificazione della HM in base ai loro genotipi, l'introduzione e l'uso di diversi metodi di genotipizzazione hanno permesso la distinzione delle varie entità molare da aborti spontanei non molari, come le concezioni biparentali diploidi aneuploidi e altri tipi di concezioni5,15. Tali concezioni possono avere una certa proliferazione di trofoblasti e una morfologia villosa anormale che imitano, in una certa misura, alcune caratteristiche morfologiche di HM.
Lo scopo di questo articolo è quello di fornire protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e la citometria di flusso dei tessuti incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE), nonché analisi complete dei risultati di questi metodi e della loro integrazione con altri metodi per diagnosi corretta e conclusiva dei tessuti molari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

La talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da un'eccessiva proliferazione trofoblastica e da uno sviluppo embrionale anormale. Esistono due tipi di HM basati sulla valutazione morfologica microscopica, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM). Questi possono essere ulteriormente suddivisi in base al contributo dei genitori ai genomi molare. Tale caratterizzazione dell'HM, mediante morfologia e analisi del genotipo, è fondamentale per la gestione del paziente e per la comprensione fondamentale di questa patologia intrigante. È ben documentato che l'analisi morfologica dell'HM è soggetta ad ampia variabilità interosservante e non è sufficiente da sola per classificare con precisione HM in CHM e PHM e distinguerli dagli aborti idropici non molare. L'analisi della genotipizzazione viene eseguita principalmente su DNA e tessuti da prodotti di concezione incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE), che hanno una qualità inferiore a quella ottimale e possono quindi portare a conclusioni errate. In questo articolo vengono forniti protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e l'analisi della citometria di flusso dei tessuti molari FFPE, insieme all'interpretazione dei risultati di questi metodi, alla loro risoluzione dei problemi e all'integrazione con la valutazione morfologica , l'immunosofochimicap57 KIP2 e l'ibridazione in situ (FISH) della fluorescenza in situ per raggiungere una diagnosi corretta e robusta. Qui, gli autori condividono i metodi e le lezioni appresi negli ultimi 10 anni dall'analisi di circa 400 prodotti di concepimento.

La complessità dei tessuti molari e il fatto che possano avere vari genotipi richiede un'analisi rigorosa e l'uso di diversi metodi come la valutazione morfologica, l'immunohistochimica p57, la genotipizzazione microsatellite, la citometria di flusso e la FISH. Ad esempio, un paziente (1790) è stato riferito con due PHM che sono stati trovati triploide dall'analisi microarray solo dei POC. Al paziente è stato quindi diagnosticato un PHM ricorrente. La genotipizzazione microsatellite de...

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Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Le talpe idatidiformi sono gravidanze umane anomale con aeziologie eterogenee che possono essere classificate in base alle loro caratteristiche morfologiche e al contributo dei genitori ai genomi molare. Qui, i protocolli di genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex e citometria di flusso dei tessuti molari incorporati in paraffina fissati in formalina sono descritti in dettaglio, insieme all'interpretazione e all'integrazione dei risultati.

Pulitura del DNA microsatellite e citometria di flusso Ploidy Analisi dei tessuti molari Molari Molari Molar fissati di paraffino fissati in parina

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Il vantaggio principale del nostro protocollo di genotipizzazione è che riduce al minimo la contaminazione con il DNA materno, che è la sfida principale quando si genotipizzano tessuti molari fissi alla formalina e incorporati nella paraffina. La citometria a flusso è un metodo veloce ed economico che facilita notevolmente la diagnosi di talpe idatidiformi. Per ogni sezione di paraffina fissa formalina, o FFPE, prodotto di concepimento, preparare una sezione di macchie di ematossilina ed eosina spessa quattro micron come descritto in questo video per la valutazione morfologica mediante microscopia.Posizionare i blocchi FFPE sul ghiaccio per 15 minuti per facilitare il sessatura. Regolare il microtomo per tagliare sezioni spesse quattro micron per una valutazione morfologica microscopica. Posizionare il blocco freddo nel microtomo e tagliare una sezione da ogni blocco per la colorazione H&E.Utilizzando le forcep, trasferire ogni sezione in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius. Raccogliere la sezione dal bagno d'acqua con una diapositiva caricata positivamente precedentemente etichettata con il numero di identificazione del campione utilizzando una matita. Posizionare le diapositive contenenti le sezioni in un forno a 65 gradi Celsius per consentire alle sezioni di aderire alle diapositive.Tenere gli scivoli nel forno per 25 minuti. Eseguire la colorazione H&E immergendo le diapositive nei barattoli di colorazione appropriati per il periodo di tempo corretto come tabulato nel protocollo di testo. Montare le sezioni di quattro micron per l'analisi morfologica con mezzo di montaggio.E coprire con slip di copertura in vetro. Utilizzando le diapositive H&E e un microscopio a luce, selezionare il blocco FFPE che ha la maggiore quantità di villi corionici. E se possibile, il blocco che ha villi corionici si separa e non si mescola con i tessuti materni.Regolare il microtomo per tagliare sezioni spesse 10 micron per l'estrazione del DNA. Tagliare da 10 a 30 sezioni, a seconda della quantità di villi corionici nel blocco. Dopo aver raccolto le sezioni con diapositive come prima, posizionare le diapositive contenenti le sezioni in un forno a 65 gradi Celsius per consentire alle sezioni di aderire alle diapositive.Tenere gli scivoli nel forno per 20 minuti. Eseguire la colorazione H&E immergendo le diapositive nei barattoli di colorazione appropriati per il periodo di tempo corretto come tabulato nel protocollo di testo. Lasciare gli scivoli sotto la cappa dei fumi per un minimo di tre ore affinché gli odori tossici di xilene si dissipano.Usando le forcep, strappare un piccolo pezzo di carta da una salvietta di carta inumidita. Sotto un microscopio stereo leggero, utilizzare le forcep e piccoli pezzi di salviette di carta inumidite ad acqua per raschiare tutti i tessuti materni indesiderati dalle macchie di H&E sezioni spesse 10 micron. La chiave per questo passaggio è la pazienza, soprattutto per i blocchi impegnativi.È anche importante che qualcun altro dia un'occhiata per garantire che non manchino tessuti materni. Ora, strappare un nuovo pezzo di carta dalle salviette di carta inumidite e usarlo per raccogliere i villi corionici. Mettere i pezzi di salviette di carta con i villi corionici attaccati in un tubo etichettato da 1,5 ml.Ridurre al minimo la quantità di salviette di carta utilizzate in questo passaggio in quanto troppo può ostruire la colonna di estrazione del DNA e di conseguenza ridurre la quantità finale di DNA raccolto. Seguire il protocollo di estrazione del DNA da un kit FFPE per eseguire l'estrazione del DNA. Utilizzando uno spettrofotometro di laboratorio, caricare 1 microlitro di DNA e misurare l'assorbanza a 216 nm per la quantificazione.Caricare 1 microlitro di DNA su un gel di agarosio al 2% ed eseguire l'elettroforesi del gel ad una tensione da 80 a 100 volt per la valutazione qualitativa. Sulla base dei risultati della valutazione del DNA, scegli il volume di DNA da utilizzare nell'amplificazione PCR a ripetizione tandem multipla corta. Mirare a utilizzare un minimo di 1000 nanogrammi di DNA.Procedere all'amplificazione PCR, all'elettroforesi capillare e all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. Per scegliere il blocco FFPE ideale, utilizzare diapositive H&E su un microscopio luminoso per selezionare un blocco FFPE che ha circa il 50-70% dei suoi tessuti composti da villi corionici. Per i blocchi che non hanno la quantità ideale di villi corionici, arricchiscono per i villi corionici man mano che viene eseguita la sezione.Per fare ciò, identificare quale lato delle sezioni appena tagliate contiene più villi corionici in base alla corrispondente diapositiva H&E. Quindi, utilizzare una lama per tagliare l'altra metà che deve essere scartata per arricchire i villi corionici. Per eseguire la sessatura del miglior blocco FFPE possibile, tagliare quattro sezioni dello spessore di 50 micron utilizzando un microtomo.Nel caso in cui non sia disponibile un blocco FFPE ideale, mirare a mantenere comunque il rapporto tra villi corionico e tessuto materno. Ad esempio, se solo il 30% del blocco è costituito da villi corionici, mentre il resto ha tessuti materni, rimuovere almeno la metà della sezione che contiene i tessuti materni e utilizzare più sezioni per compensare. Posizionare le sezioni in tubi etichettati da 15 ml.Per la deparaffinizzazione e la reidratazione, lavorare in una cappa aspirante per aggiungere ogni reagente e attendere il periodo di tempo appropriato come tabulato nel protocollo di testo. Quindi, rimuovere il reagente mediante aspirazione sottovuoto con una pipetta Pasteur. Successivamente, aggiungere quattro gradi Celsius soluzione di citrato ai tubi da 15 ml.Dopo aver posizionato in un bagno d'acqua di 80 gradi Celsius per due ore, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di citrato mediante aspirazione sottovuoto. Aggiungere sei millilitri di 1x PBS, vortice e attendere da uno a due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi sul fondo.Se necessario, centrifugare i campioni a 1000 giri/min per 30 secondi. Rimuovere il 1X PBS per aspirazione sottovuoto. Ora aggiungi un mL di soluzione di pepsina preriscaldata e posizionalo in un bagno secco di 37 gradi Celsius per 30 minuti.Vortice ogni 10 minuti. Preparare il propidio ioduro ribonucleasi Una soluzione negli ultimi 10 minuti di questa incubazione. Aggiungere altri sei mL di 1x PBS, vortice e attendere da uno a due minuti per consentire ai tessuti di depositarsi sul fondo.Ancora una volta, rimuovere il 1x PBS per aspirazione sottovuoto. Aggiungere 550 microlitri della soluzione propidio ioduro ribonucleasi Una soluzione e posizionare i campioni in un bagno secco di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzare le forcep per posizionare un pezzo di rete di filtrazione da 48 micron di cinque cm nella parte superiore dei tubi inferiori rotondi in polistirolo per l'uso con il citometro a flusso.Filtrare la soluzione tubazione del liquido attraverso la rete e nel tubo. I campioni sono ora pronti per essere eseguiti sul citometro a flusso. Tienili avvolti in un foglio fino a quando non sono pronti per essere eseguiti.Infine, eseguire la citometria del flusso e l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo. La genotipizzazione microsatellita di una talpa idatidiforme parziale, insieme al DNA della paziente e del suo partner, rivela che la talpa della paziente è triploide dispermica. Il primo primo marcatore mostra due picchi nel prodotto del concepimento.Il primo picco proviene dalla madre, poiché solo la madre ha un picco di queste dimensioni. Seguendo lo stesso ragionamento, il secondo picco proviene dal padre poiché condivide lo stesso allele. Si noti come il secondo picco sia molto più alto del primo, indicando che probabilmente ci sono due dosi dello stesso allele paterno in quel picco.La contaminazione materna è molto minima in questo prodotto del concepimento perché mostra un picco molto piccolo nella posizione del secondo allele materno. Il secondo marcatore mostra tre picchi nel prodotto del concepimento. Due di queste cime provengono dal padre e una dalla madre.Il terzo e il quarto marcatore sono simili al primo marcatore, e mostrano anche due alleli provenienti dal padre e uno dalla madre. Poiché tutti e quattro i marcatori mostrano costantemente tre alleli, due provenienti dal padre e uno dalla madre, si può concludere che questo prodotto del concepimento è triploide dispermico e conferma la diagnosi di talpa parziale. Per l'interpretazione dei risultati di genotipizzazione, è importante essere consapevoli del livello di contaminazione in base alle note prese durante le fasi di pulizia.Per alcuni casi, non siamo in grado di giungere a una conclusione seguendo questi due metodi. In questi casi, usiamo altri metodi come FISH, per scoprire i veri genotipi. La genotipizzazione microsatellita ha permesso una diagnosi molare accurata e ha spianato la strada a comprendere meglio i genotipi associati alle varie caratteristiche delle talpe idatidiformi.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Ricerca

Genetica

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Valutazione della contaminazione da DNA a RNA campioni basati sul DNA Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Sequenziamento di MicroRNA retrospettiva: Protocollo di preparazione libreria DNA complementare utilizzando campioni di RNA di paraffina-incastonato formalina-fisso

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Gene candidato test negli studi clinici di coorte con genotipizzazione multiplex e spettrometria di massa

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Misurazione di BK-poliomavirus Non-Coding Control Region Guidato Attività Trascrizionional Via Flusso Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...