Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

著者らは、元のフローサイトメトリープロトコルを共有してくれたソフィー・パトリアーとマリアンヌ・パレシー、および供給と試薬を提供するためのプロメガとキアゲンに感謝しています。この研究は、レソー・ケベコイス・アン・リオー殖とカナダ保健研究所(MOP-130364)によってR.S.に支援されました。

この研究は、マギル機関レビュー委員会によって承認されました.すべての患者は、研究に参加し、様々な病理学部門から受胎(POC)のFFPE製品を取得することに書面による同意を提供しました。
注:フローサイトメトリーによるジェノタイピングとプロディ決定にはいくつかの方法がありますが、ここで提供されるプロトコルは、それぞれに1つのプラットフォー...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HMは異種病因を有する異常なヒト妊娠であり、異なる組織学的および好奇数型を有し、正確な分類および診断を困難にする。ヒト病理学的形態学的評価はしばしば不正確であることが証明され、したがって、HMをCHMおよびPHMに分類し、非臼頭流産と区別するために単独で信頼性が低い。したがって、HMの正確な診断には、多重マイクロサテライトDNAジェノタイピング、フローサイトメトリーに?...

ヒダチジフォームほくろ(HM)は、異常な胚発生、栄養芽細胞の過剰増殖、絨毛絨毛性絨毛(CV)の水文変性を特徴とする異常なヒト妊娠である。従来、HMは形態学的評価1のみに基づいて完全なHM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類に分けられており、従来は2種類に分けられております。しかし、形態学的評価だけではHMを2つのサブタイプ(CHMおよびPHM)に分類し、非モル流産2、3、4と区別するには不十分であることが示されている。
CHMとPHMは悪性腫瘍に対する傾向が異なるため、患者に適切なフォローアップと管理を提供するために、HMのゲノムタイプを正確に決定することが重要です。その結果、過去数十年にわたり、モル組織に対する親の寄与を特定し、HMの正しい分類に達することを目的として、いくつかの方法論が開発され、進化してきました。これらには、核型分析、染色体バンディング多型、ヒト白血病抗原(HLA)血清、制限断片長多型、可変数のカンデム反復、マイクロサテライトジェノタイピング、フローサイトメトリー、およびp57が含まれます。KIP2免疫組織化学。これにより、ゲノムに対する親の貢献に基づくHM概念の正確な細分化が可能になりました:CHMは、ジプロイド・アンドロティック・モノスマティックまたはディプロイド・アンドロゲンティック・ディスパーミックであり、PHMは99%で、99%のディスパーミックであり、症例5、6、7、8の1%で単精子。さらに、過去20年間に出現した別のゲノムタイプのHMがあり、これは二重親である。後者は主に再発し、単一の家族(シンプレックス症例)または少なくとも2つの家族(家族の場合)に影響を与える可能性があります。これらの二重親モルは、主に患者9、10、11、12におけるNLRP7またはKHDC3Lの劣性変異によって引き起こされる。NLRP7における劣性変異を有する患者における二葉性双親HMは、形態学的分析によってCHMまたはPHMと診断され、これは患者13、14における変異の重症度と関連していると思われる。彼らの遺伝子型に従ったHMの分類に加えて、いくつかの遺伝子タイピング法の導入と使用は、異球体二親の概念のような非モル流産からの様々なモルエンティティの区別を可能にしました。概念の他のタイプ5,15.このような概念は、ある程度、HMのいくつかの形態学的特徴を模倣するいくつかの栄養芽細胞増殖および異常な絨毛形態を持ち込む可能性がある。
この記事の目的は、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の多重ゲノタイピングとフローサイトメトリーの詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果と他の方法との統合の包括的な分析を提供することです。モル組織の正しく、決定的な診断。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

ヒダチジフォームほくろ(HM)は、過剰な栄養芽細胞増殖および異常な胚発生を特徴とする異常なヒト妊娠である。顕微鏡形態学的評価に基づくHMには、完全HM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類があります。これらは、モルゲノムに対する親の寄与に基づいてさらに細分化することができる。HMのこのような特性化は、形態学および遺伝子型分析によって、患者管理およびこの興味深い病理の基本的な理解のために重要である。HMの形態学的解析は広い観察者間変動の影響を受け、HMをCHMおよびPHMに正確に分類し、水中非モル中絶と区別するには十分ではないことが十分に文書化されている。ジェノタイピング分析は、主に、最適な品質を持たないホルムリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)製品のDNAおよび組織に対して行われ、結果的に間違った結論につながる可能性があります。本稿では、FFPEモル組織の多重ゲノタイピングおよびフローサイトメトリー分析のための詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果の解釈、トラブルシューティング、および形態学的評価との統合を提供する。、p57KIP2免疫組織化学、およびその中の蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)は、正しく、堅牢な診断に達する。ここでは、約400の概念製品の分析から過去10年間に学んだ方法と教訓を共有する。

モル組織の複雑さと様々な形のゲノムを持つ可能性があるという事実は、形態学的評価、p57免疫組織化学、マイクロサテライトゲノタイピング、フローサイトメトリー、FISHなどのいくつかの方法の厳格な分析と使用を必要とします。例えば、1人の患者(1790)は、POCのマイクロアレイ分析によってのみ三脚であることが判明した2つのPHMと呼ばれた。したがって、患者は?...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

ヒダチジフォームほくろは、形態学的特徴およびモルゲノムへの親の寄与に応じて分類することができる異種性腸科を有する異常なヒト妊娠である。ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込みモル組織の多重マイクロサテライトDNAジェノタイピングおよびフローサイトメトリーのプロトコルを、結果の解釈および統合とともに詳細に説明する。

ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

当社のジェノタイピングプロトコルの主な利点は、ホルマリン固定のパラフィン埋め込みモル組織をジェノタイピングする際の主な課題である母体DNAとの汚染を最小限に抑える点です。フローサイトメトリーは、ヒダチジフォームのモルの診断を大幅に容易にする高速かつ安価な方法です。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)の各受胎物については、顕微鏡による形態学的評価のために、このビデオで詳述されているように、4ミクロンの厚いヘマトキシリンおよびエオシン染色セクションを準備する。FFPEブロックを氷の上に15分間置き、断面化を容易にします。顕微鏡形態評価のために4ミクロンの厚さのセクションをカットするようにミクロトームを調整します。コールドブロックをミクロトームに入れ、H&E染色のために各ブロックから1つのセクションを切ります。鉗子を使用して、各セクションを摂氏45度の水浴に移します。以前に鉛筆を使用してサンプル識別番号でラベル付けされた正に帯電したスライドで、ウォーターバスからセクションをピックアップします。セクションを含むスライドをオーブンに65°Cで置き、セクションをスライドに付着させます。スライドをオーブンに25分間保管します。テキスト プロトコルで表された正しい期間、適切な染色瓶にスライドをサブマージして H&E 染色を実行します。取り付け媒体と形態学的分析のための4ミクロンセクションを取り付けます。そして、ガラスカバースリップで覆います。H&Eスライドと軽顕微鏡を使用して、絨毛絨毛の最多量を有するFFPEブロックを選択します。そして、可能であれば、絨毛性絨毛を持つブロックは、母親の組織とは分離し、混ざり合っていない。DNA抽出のために10ミクロンの厚さのセクションをカットするようにミクロトームを調整します。ブロック内の絨毛絨毛の量に応じて、10〜30のセクションをカットします。以前のようにスライドでセクションをピックアップした後、セクションがスライドに付着できるように、65°Cでオーブンにセクションを含むスライドを配置します。スライドをオーブンに20分間保管します。テキスト プロトコルで表された正しい期間、適切な染色瓶にスライドをサブマージして H&E 染色を実行します。有毒なキシレン臭が消散するために、最低3時間は煙のフードの下にスライドを残します。鉗子を使用して、湿らせた紙の拭き取りから小さな紙を引き裂きます。軽いステレオ顕微鏡の下で、鉗子と水を湿らせた紙のワイプの小片を使用して、H&E染色10ミクロンの厚いセクションから不要なすべての母体組織を削り取ります。このステップの鍵は、特に挑戦的なブロックのための忍耐です。また、母親の組織が見逃されないように、他の誰かに目を向けしてもらうことも重要です。今、湿らせた紙のワイプから新しい紙を引き裂き、絨毛性絨毛を収集するためにそれを使用します。付属の絨毛絨毛絨毛を入れた紙の拭き取りを1.5mlチューブに入れ。このステップで使用される紙のワイプの量を最小限に抑え、DNA抽出カラムを詰まらせ、結果的に収集されたDNAの最終的な量を減らします。FFPEキットからのDNA抽出プロトコルに従って、DNA抽出を行います。実験室分光光度計を使用して、DNAの1マイクロリットルをロードし、定量のために216 nmで吸光度を測定する。2%アガロースゲルに1マイクロリットルのDNAをロードし、80~100ボルトの電圧でゲル電気泳動を実行して定性評価を行います。DNA評価結果に基づいて、マルチプレックス短タンデム繰り返しPCR増幅に使用するDNAの量を選択します。最低1000ナノグラムのDNAを使用することを目指してください。テキストプロトコルに記載されているように、PCR増幅、毛細管電気泳動、およびデータ分析に進みます。理想的なFFPEブロックを選択するには、光顕微鏡上でH&Eスライドを使用して、絨毛膜絨毛から構成される組織の約50〜70%を有するFFPEブロックを選択する。絨毛性絨毛の理想的な量を有しないブロックについては、断面化が行われるように絨毛絨毛絨毛のために濃縮する。これを行うには、切りたてのセクションのどちら側に、対応するH&Eスライドに従って、より多くの絨毛絨毛が含まれているかを特定します。その後、絨毛性絨毛のために濃縮するために廃棄する必要がある残りの半分を切断するためにブレードを使用してください。最良のFFPEブロックの断面化を行うために、マイクロトームを使用して厚さ50ミクロンの4つのセクションを切断します。理想的なFFPEブロックが利用できない場合には、それにもかかわらず、母親の組織に対する絨毛絨毛絨毛の比率を維持することを目指す。例えば、ブロックの30%だけが絨毛性絨毛で構成されているが、残りは母親の組織を持っている場合、母体組織を含むセクションの少なくとも半分を取り除き、より多くのセクションを使用して補償する。15 mLチューブにセクションを配置します。脱パラフィンと水分補給のために、ヒュームフードで各試薬を添加し、テキストプロトコルで表されたように適切な期間を待ちます。次いで、パスツールピペットを用いて真空吸引により試薬を除去する。次に、15 mLチューブに摂氏4度のクエン酸溶液を加えます。摂氏80度の水浴に2時間入れた後、溶液を室温まで冷まします。真空吸引によりクエン酸溶液を除去します。1x PBS、渦の6ミリリットルを追加し、組織が底に落ち着くように1〜2分待ちます。必要に応じて、サンプルを1000 RPMで30秒間遠心します。真空吸引により1X PBSを取り外します。今、予熱ペプシン溶液の1 mLを追加し、30分間摂氏37度のドライバスに入れます。10分ごとに渦。このインキュベーションの最後の10分間にヨウ化リボヌクレアーゼA溶液のプロピジウムを調製する。さらに6mLの1x PBS、渦を加え、組織が底に落ち着くように1〜2分待ちます。再度、真空吸引によって1x PBSを取り除きます。550マイクロリットルのヨウ化プロピジウム・リボヌクレアーゼA溶液を加え、37°Cの乾燥浴に30分間サンプルを入れます。フォースを使用して、フローサイトメーターで使用するためにポリスチレンラウンドボトムチューブの上部に48ミクロンろ過メッシュの5 cm×5 cmの部分を配置します。液体をメッシュを通してチューブに入れ、溶液をフィルター処理します。これで、サンプルはフローサイトメーターで実行できます。彼らは実行する準備が整うまで、箔で包んだままにしてください。最後に、テキストプロトコルに記載されているように、フローサイトメトリーとデータ分析を行います。部分ヒダチフォームモグラのマイクロサテライト遺伝子型は、患者および彼女のパートナーのDNAと共に、患者のほくろが三重不定皮症であることを明らかにする。最初の第1マーカーは、受胎の産物における2つのピークを示す。最初のピークは母親だけにこの大きさのピークがあるので、母親に由来します。同じ推論に続いて、2番目のピークは、彼が同じアリエールを共有しているので、父親に由来します。2番目のピークが最初のピークよりもはるかに高い方法に注意してください, おそらくそのピークに同じ父性アレーレの2つの用量があることを示します.母親の汚染は、第2の母親のアレーレの位置に非常に小さなピークを表示するため、この受胎の製品では非常に最小限です。第2マーカーは、受胎の産物の3つのピークを示す。これらのピークのうちの2つは父親に由来し、1つは母親に由来します。3番目と4番目のマーカーは最初のマーカーに似ており、父親と母親から来た2つの対立分も示しています。4つのマーカーはすべて一貫して3つの対立アレスを示し、2つは父親から、もう1つは母親から来ているので、この受胎の産物は三分不定皮であると結論付けることができ、部分的なほくろの診断を確認する。ジェノタイピングの結果を解釈するには、洗浄工程で取られたメモに基づいて汚染のレベルを認識することが重要です。場合によっては、これら2つの方法に従って結論を出すことができません。このような場合、私たちは、真の遺伝子型を明らかにするために、FISHなどの他の方法を使用します。マイクロサテライトのジェノタイピングは、正確なモル診断を可能にし、ヒダチ型の様々な特徴に関連する遺伝子型をよりよく理解する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

リボソーム DNA に基づいて RNA サンプルの DNA 汚染の評価

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

補体受容体1長多型のための高分解能Melting PCR Genotyping：アルツハイマー病の遺伝子感受性評価のための革新的なツール

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...