Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Forfatterne takker Sophie Patrier og Marianne Parésy for å dele den opprinnelige flyten flowcytometri protokollen, og Promega og Qiagen for å gi forsyninger og reagenser. Dette arbeidet ble støttet av Réseau Québécois no reproduksjon og Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) til R.S.

Denne undersøkelsen ble godkjent av McGill institusjonelle Review Board. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke til å delta i studien og å ha sine FFPE produkter av unnfangelsen (Pocer) Hentet fra ulike patologi avdelinger.
Merk: Mens det finnes flere metoder for genotyperingteknologi og ploidy bestemmelse ved flyt flowcytometri, protokollene gitt her beskriver en metode for analyse ved hjelp av én plattform for hver.
1. genotyperingteknologi
...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM er unormal menneskelige svangerskap med heterogene årsaker og har ulike histologiske og genotypisk typer, som gjør deres nøyaktige klassifisering og diagnose utfordrende. Histopathological morfologiske evalueringen ble ofte påvist unøyaktig og er derfor upålitelig på egen hånd for å klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra ikke-molar aborter. Derfor krever en nøyaktig diagnose av HM bruk av andre metoder som multiplex mikrosatellittmarkør DNA-genotyperingteknologi, ploidy analyse ved flyt flowcytometr...

En blæremola muldvarp (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av unormal embryoutvikling, hyperproliferation av trophoblast, og hydropic degenerasjon av humant Villi (CV). Historisk sett brukte HM å deles inn i to typer, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM) basert bare på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist seg at morfologiske evaluering alene ikke er tilstrekkelig til å klassifisere hm i de to under typer (chm og PHM) og skille dem fra ikke-molar aborter2,3,4.
Fordi CHM og PHM har forskjellige propensities til ondartet, er det derfor viktig å nøyaktig bestemme den genotypisk typen HM for å gi riktig oppfølging og behandling til pasientene. Følgelig, i de siste ti årene, flere metoder har blitt utviklet og utviklet for det formål å identifisere foreldrenes bidrag til molar vev og nå en riktig klassifisering av HM. Disse inkluderer Karyotype analyse, kromosom striper polymorfisme, Human leukocytter antigen (HLA) serologisk skrive, begrensning fragment lengde polymorfisme, variabel antall tandem gjentar, mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi, flyt flowcytometri, og P57 KIP2 immunhistokjemi. Dette har tillatt nøyaktig oppdeling av HM konsepsjoner basert på foreldrenes bidrag til deres genomer, som følger: CHM, som er diploid androgenetic monospermic eller diploid androgenetic dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% av tilfellene5,6,7,8. Videre er det en annen genotypisk type HM som oppsto i de siste to ti årene, som er diploid biparental. Sistnevnte er mest tilbakevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simplex tilfeller) eller minst to familiemedlemmer (familiær saker). Disse diploid biparental føflekker er hovedsakelig forårsaket av resessivt mutasjoner i NLRP7 eller KHDC3L i pasienter9,10,11,12. Diploid biparental hm hos pasienter med resessivt mutasjoner i NLRP7 kan diagnostiseres som chm eller PHM av morfologiske analyse og dette synes å være assosiert med alvorlighetsgraden av mutasjoner i pasientene13,14. I tillegg til klassifisering av HM i henhold til deres genotyper, innføring og bruk av flere genotyperingteknologi metoder tillot skillet mellom de ulike molar enheter fra ikke-molar aborter, slik som aneuploid diploid biparental konsepsjoner og andre typer konsepsjoner5,15. Slike forestillinger kan ha noen trophoblast spredning og unormal villous morfologi som etterligner, til en viss grad, noen morfologiske funksjoner av HM.
Hensikten med denne artikkelen er å gi detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev, og omfattende analyser av resultatene av disse metodene og deres integrasjon med andre metoder for korrekt og avgjørende diagnose av molar vev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Blæremola Mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av overdreven trofoblastiske spredning og unormal embryoutvikling. Det er to typer HM basert på en mikroskopisk morfologiske evaluering, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM). Disse kan videre deles basert på foreldrenes bidrag til molar genomer. Slik karakterisering av HM, ved morfologi og genotype analyser, er avgjørende for pasientbehandling og for den grunnleggende forståelsen av denne spennende patologi. Det er godt dokumentert at morfologiske analyse av HM er underlagt bred interobserver variasjon og er ikke tilstrekkelig på egen hånd for å nøyaktig klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra hydropic ikke-molar aborter. Genotyperingteknologi analyse er hovedsakelig utført på DNA og vev fra formalin-fast parafin-embedded (FFPE) produkter av unnfangelsen, som har mindre enn optimal kvalitet og kan følgelig føre til feil konklusjoner. I denne artikkelen, detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri analyser av FFPE molar vev er gitt, sammen med tolkningen av resultatene av disse metodene, deres feilsøking, og integrasjon med morfologiske evaluering , P57KIP2 immunhistokjemi og fluorescens in situ HYBRIDISERING (Fish) for å nå en korrekt og robust diagnose. Her forfatterne dele metoder og erfaringer i de siste 10 årene fra analysen av ca 400 produkter av unnfangelsen.

Kompleksiteten av molar vev og det faktum at de kan ha ulike genotyper nødvendiggjør strenge analyser og bruk av flere metoder som morfologiske evaluering, P57 immunhistokjemi, mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi, flyt flowcytometri og fisk. For eksempel, en pasient (1790) ble henvist med to PHM som ble funnet å være triploid av Microarray analyse av Pocer bare. Pasienten ble derfor diagnostisert med tilbakevendende PHM. Mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi av hennes to...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Blæremola føflekker er unormale menneskelige svangerskap med heterogene etiologi som kan klassifiseres i henhold til deres morfologiske funksjoner og foreldrenes bidrag til molar genomer. Her er protokoller av multiplex mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded molar vev beskrevet i detalj, sammen med resultatene ' tolkning og integrering.

Mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og Flow flowcytometri Ploidy analyser av formalin-fast parafin-embedded Blæremola molar vev

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Den primære fordelen med vår genotypingprotokoll er at den minimerer forurensning med mors DNA, som er hovedutfordringen når genotyping formalin-fast, parafin-innebygd molarvev. Flow cytometri er en rask og billig metode som i stor grad letter diagnosen hydatidiform mol. For hver formalin-fast parafin-innebygd, eller FFPE, produkt av unnfangelse, forberede en fire-mikron tykk hematoksylin og eosin flekk seksjon som beskrevet i denne videoen for morfologisk evaluering av mikroskopi.Plasser FFPE-blokkene på is i 15 minutter for å lette snittingen. Juster mikrotomen for å kutte seksjoner som er fire mikrometer tykke for mikroskopisk morfologisk evaluering. Plasser den kalde blokken i mikrotomen og kutt en del fra hver blokk for H&E-farging.Ved hjelp av tang, overfør hver seksjon til et 45 grader Celsius vannbad. Plukk opp delen fra vannbadet med et positivt ladet lysbilde som tidligere var merket med prøveidentifikasjonsnummeret ved hjelp av en blyant. Plasser lysbildene som inneholder seksjonene i en ovn på 65 grader Celsius slik at seksjonene kan holde seg til lysbildene.Oppbevar lysbildene i ovnen i 25 minutter. Utfør H&E-fargingen ved å senke lysbildene ned i de riktige fargekrukkene for riktig tidsperiode som tabulert i tekstprotokollen. Monter de fire mikron seksjonene for morfologisk analyse med monteringsmedium.Og dekk med glass deksel slips. Bruk H&E-lysbildene og et lett mikroskop, og velg FFPE-blokken som har den største mengden chorionisk villi. Og om mulig, blokken som har chorionic villi atskilt fra og ikke blandet med mors vev.Juster mikrotomen for å kutte seksjoner som er 10 mikrometer tykke for DNA-ekstraksjon. Klipp 10 til 30 seksjoner, avhengig av mengden chorionic villi i blokken. Etter å ha plukket opp seksjonene med lysbilder som før, plasserer du lysbildene som inneholder seksjonene i en ovn på 65 grader Celsius, slik at seksjonene kan holde seg til lysbildene.Oppbevar lysbildene i ovnen i 20 minutter. Utfør H&E-fargingen ved å senke lysbildene ned i de riktige fargekrukkene for riktig tidsperiode som tabulert i tekstprotokollen. La lysbildene stå under røykhetten i minst tre timer for at de giftige xylenluktene skal forsvinne.Bruk tang til å rive et lite stykke papir ut av en fuktet papirsletting. Under et lett stereomikroskop bruker du tang og små biter av vannfuktede papirservietter til å skrape av alle uønskede morsvev fra H&E-flekker 10 mikron tykke seksjoner. Nøkkelen til dette trinnet er tålmodighet, spesielt for utfordrende blokker.Det er også viktig å ha noen andre ta en titt for å sikre at ingen mors vev er savnet. Nå du et nytt stykke papir ut av de fuktede papirserviettene og bruker det til å samle den chorioniske villien. Legg papirserviettene med tilhørende chorionic villi i et merket 1,5 ml rør.Minimer mengden papirservietter som brukes i dette trinnet, da for mye kan tette DNA-ekstraksjonskolonnen og dermed redusere den endelige mengden samlet DNA. Følg DNA-ekstraksjonsprotokollen fra et FFPE-sett for å utføre DNA-ekstraksjon. Bruk et laboratoriespektrofotometer, last 1 mikroliter DNA og måler absorbans ved 216 nm for kvantifisering.Last 1 mikroliter DNA på en 2% agarose gel og kjør gel elektroforese med en spenning på 80 til 100 volt for kvalitativ evaluering. Basert på DNA-evalueringsresultatene, velg volumet av DNA som skal brukes i multipleks kort tandem gjenta PCR forsterkning. Mål å bruke minst 1000 nanogram DNA.Gå videre til PCR-forsterkning, kapillærelektroforese og dataanalyse som beskrevet i tekstprotokollen. For å velge den ideelle FFPE-blokken, bruk H&E-lysbilder på et lett mikroskop for å velge en FFPE-blokk som har ca. 50 til 70 % av vevet som består av chorionisk villi. For blokker som ikke har den ideelle mengden chorionic villi, berike for chorionic villi som snittingen utføres.For å gjøre dette, identifisere hvilken side av de nykuttede seksjonene inneholder mer chorionic villi i henhold til sin tilsvarende H & E lysbilde. Deretter bruker du et blad til å kutte av den andre halvdelen som må kastes for å berike for chorionic villi. For å utføre snitting av best mulig FFPE-blokk, kutt fire seksjoner som er 50 mikrometer tykke ved hjelp av en mikrotom.I tilfelle at en ideell FFPE blokk ikke er tilgjengelig, tar sikte på å opprettholde forholdet mellom chorionic villi til mors vev likevel. For eksempel, hvis bare 30% av blokken består av chorionic villi, mens resten har mors vev, fjern deretter minst halvparten av avsnittet som inneholder mors vev, og bruk flere seksjoner for å kompensere. Plasser seksjonene i merkede 15 ml rør.For deparaffinisering og rehydrering, arbeid i en røykhette for å legge til hver reagens og vente riktig tidsperiode som tabulert i tekstprotokollen. Fjern deretter reagensen ved vakuumsuging med en Pasteurpipette. Deretter legger du til fire grader Celsius citrate løsning til 15 ml rør.Etter å ha plassert i et 80 grader Celsius vannbad i to timer, la løsningen avkjøles til romtemperatur. Fjern citratløsningen ved støvsuging. Tilsett seks milliliter med 1x PBS, vortex, og vent ett til to minutter for å la vevet slå seg til bunns.Sentrifuger prøvene ved 1000 o/min om nødvendig i 30 sekunder. Fjern 1X PBS ved vakuumsuging. Legg nå til en ml forvarmet pepsinløsning og legg i et 37 grader Celsius tørt bad i 30 minutter.Vortex hvert 10. Forbered propidiumjodidrionukleen En løsning i de siste 10 minuttene av denne inkubasjonen. Tilsett ytterligere seks ml 1x PBS, vortex, og vent ett til to minutter for å la vevet slå seg til bunns.Igjen, fjern 1x PBS ved vakuumsuging. Tilsett 550 mikroliter av propidiumjodidrionukleæren En løsning, og legg prøvene i et 37 grader Celsius tørt bad i 30 minutter. Bruk tang til å plassere en fem cm med fem cm stykke 48 mikron filtrering mesh i den øverste delen av polystyren runde bunnrør for bruk med strømningscytometeret.Filtrer oppløsningen ved å pipe væsken gjennom nettet og inn i røret. Prøvene er nå klare til å kjøres på strømningssytometeret. Hold dem innpakket i folie til de er klare til å kjøres.Til slutt utfører du flytcytometri og dataanalyse som beskrevet i tekstprotokollen. Mikrosatellitt genotyping av en delvis hydatidiform muldvarp, sammen med DNA fra pasienten og hennes partner, avslører at pasientens føflekk er triploid dispermic. Den første første markøren viser to topper i produktet av unnfangelse.Den første toppen stammer fra moren, siden bare moren har en topp av denne størrelsen. Etter samme resonnement stammer den andre toppen fra faren siden han deler samme allele. Legg merke til hvordan den andre toppen er mye høyere enn den første, noe som indikerer at det sannsynligvis er to doser av samme fars allele i den toppen.Maternal forurensning er svært minimal i dette produktet av unnfangelse fordi den viser en svært liten topp på posisjonen til den andre mors allele. Den andre markøren viser tre topper i produktet av unnfangelse. To av disse toppene stammer fra faren, og en fra moren.Den tredje og fjerde markøren er lik den første markøren, og viser også to alleler som kommer fra faren, og en fra moren. Siden alle fire markører konsekvent viser tre alleler, to som stammer fra faren og en fra moren, kan man konkludere med at dette produktet av unnfangelse er triploid dispermic og bekrefter diagnosen delvis muldvarp. For tolkningen av genotypingresultatene er det viktig å være oppmerksom på forurensningsnivået basert på notatene som ble tatt under rengjøringstrinnene.I noen tilfeller kan vi ikke nå en konklusjon etter disse to metodene. I slike tilfeller bruker vi andre metoder som FISH, for å avdekke de sanne genotypene. Mikrosatellitt genotyping har tillatt nøyaktig molar diagnose og banet vei for å bedre forstå genotyper som er forbundet med de ulike funksjonene i hydatidiform mol.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfeksjon og EMSA Analyser på nylig isolerte humane villøse Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering av DNA forurensning i RNA eksempler basert på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Høyoppløselig smeltende PCR for komplementreceptor 1 Lengdepolymorfisme Genotyping: Et innovativt verktøy for Alzheimers sykdomssesmerksvurdering

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulering av Ploidy i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv MicroRNA sekvensering: Komplementære DNA biblioteket forberedelse protokollen bruker Formalin-fast parafin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten Gene Testing i klinisk Kohortstudier multiplex genotyperingteknologi og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Høy gjennomstrømming DNA utvinning og genotyperingteknologi av 3dpf sebrafisk larver av Fin klipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Måling av BK-polyomavirus ikke-Coding Control region drevet Transcriptional aktivitet via Flow flowcytometri

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...