Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Авторы благодарят Софи Патриер и Марианну Пареси за совместное использование оригинального протокола цитометрии потока, а также Promega и Qiagen за поставки материалов и реагентов. Эта работа была поддержана Репродукцией Репродукции Репродукции Ребикуи и Канадским институтом исследований в области здравоохранения (MOP-130364) в Р.С.

Это исследование было одобрено Советом по институциональному обзору McGill. Все пациенты дали письменное согласие на участие в исследовании и на получение их продуктов FFPE зачатия (POCs) из различных патологических отделений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя существует несколько ме...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM являются ненормальные человеческие беременности с разнородными этиологии и имеют различные гистологические и генотипические типы, что делает их точной классификации и диагностики сложной задачей. Гистопатологическая морфологическая оценка часто оказывалась неточной и поэтому са...

Гиматидиформная родинка (Hm) является ненормальной человеческой беременности характеризуется аномальным эмбриональным развитием, гиперраспространением трофобласта и гидропикной дегенерацией хорионического вилли (CV). Исторически сложилось так, что HM раньше был разделен на два типа, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM) на основе только морфологической оценки1. Тем не менее, было показано, что морфологическая оценка сама по себе не является достаточной, чтобы классифицировать HM в два подтипа (CHM и PHM) и отличить их от немолярных выкидышей2,3,4.
Поскольку CHM и PHM имеют различные склонности к злокачественным новообразованиям, поэтому важно точно определить генотипический тип HM, чтобы обеспечить надлежащее наблюдение и управление пациентами. Следовательно, в последние десятилетия было разработано и разработано несколько методологий с целью выявления вклада родителей в моляровые ткани и достижения правильной классификации НМ. К ним относятся кариотипный анализ, хромосомный полостальный полиморфизм, антиген лейкоцита человека (HLA) серологический типизон, полиморфизм длины фрагмента ограничения, переменное количество тандемных повторов, микроспутниковая генотипирование, цитометрия потока и p57 KIP2 иммуногистохимия. Это позволило точное разделение HM концепций на основе родительского вклада в их геномы, а именно: CHM, которые являются диплоидных андрогенетических моноспермных или диплоидных андрогенетических диспермических, и PHM, которые являются триплоид, диспермические в 99% и моноспермный в 1% случаев5,6,7,8. Кроме того, есть еще один генотипический тип HM, который появился в последние два десятилетия, который является диплоидный biparental. Последнее в основном повторяются и может повлиять на одного члена семьи (простые случаи) или, по крайней мере, двух членов семьи (семейные случаи). Эти диплоидные дьюдетские родинки в основном вызваны рецессивными мутациями в NLRP7 или KHDC3L у пациентов9,10,11,12. Диплоид ный родитель HM у пациентов с рецессивными мутациями в NLRP7 может быть диагностирован как CHM или PHM морфологическим анализом, и это, как представляется, связано с тяжестью мутаций у пациентов13,14. В дополнение к классификации HM в соответствии с их генотипами, введение и использование нескольких методов генотипирования позволило различать различные молярые сущности от немолянных выкидышей, таких как анеплодоидные диплоидные двухродительские концепции и другие типы зачатий5,15. Такие концепции могут иметь некоторое распространение трофобластов и ненормальную злобную морфологию, которые в некоторой степени имитируют некоторые морфологические особенности Hm.
Целью данной статьи является предоставление подробных протоколов для мультиплексной генотипирования и цитометрии сфиксированными парафиновыми (FFPE) тканями, а также комплексный анализ результатов этих методов и их интеграция с другими методами правильный и убедительный диагноз моляровских тканей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform моль (HM) является ненормальной человеческой беременности характеризуется чрезмерным трофиобластным пролиферацией и аномальным эмбриональным развитием. Существует два типа HM на основе микроскопической морфологической оценки, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM). Они могут быть дополнительно подразделены на основе родительского вклада в моляровские геномы. Такая характеристика HM, морфологии и генотипа анализов, имеет решающее значение для управления пациентом и для фундаментального понимания этой интригующей патологии. Хорошо задокументировано, что морфологический анализ Hm подвержен широкой изменчивости межнаблюдателей и не является достаточным сам по себе, чтобы точно классифицировать HM в CHM и PHM и отличить их от гидропиковых немолярных абортов. Генотипный анализ в основном проводится на ДНК и тканях из формалино-фиксированных парафин-встроенных (FFPE) продуктов зачатия, которые имеют меньше, чем оптимальное качество и, следовательно, может привести к неправильным выводам. В этой статье предоставляются подробные протоколы для мультиплексного генотипирования и цитометрии потока, а также интерпретация результатов этих методов, их устранение неполадок и интеграция с морфологической оценкой , p57KIP2 иммуногистохимия, и флуоресценция на месте гибридизации (FISH) для достижения правильной и надежной диагностики. Здесь авторы делятся методами и уроками, извлеченные за последние 10 лет из анализа примерно 400 продуктов зачатия.

Сложность моляровских тканей и тот факт, что они могут иметь различные генотипы, требуют строгого анализа и использования нескольких методов, таких как морфологическая оценка, иммуногистохимия p57, генотипирование микроспутников, цитометрия потока и FISH. Например, один...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform моли являются ненормальные беременности человека с разнородными этиологиями, которые могут быть классифицированы в соответствии с их морфологических особенностей и родительского вклада в молярового геномов. Здесь подробно описаны протоколы мультиплексной микроспутниковой ДНК генотипирования и цитометрии потока формалино-фиксированных парафин-встроенных моляровских тканей, а также интерпретации результатов и интеграции.

Микроспутниковая ДНК Генотипирование и поток Цитометрия Плоиди Анализ формалин фиксированной Парафин-встроенный Hydatidiform Моляровые ткани

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Основным преимуществом нашего генотипного протокола является то, что он сводит к минимуму загрязнение материнской ДНК, что является основной проблемой при генотипировании формалин-фиксированных, парафин-встроенных молярных тканей. Цитометрия потока является быстрым и недорогим методом, который значительно облегчает диагностику гидатиформных родинок. Для каждого формалин-фиксированный парафин-встроенный, или FFPE, продукт зачатия, подготовить четыре микрона толщиной гематоксилин и эозин пятно разделе, как подробно описано в этом видео для морфологической оценки микроскопии.Поместите блоки FFPE на лед в течение 15 минут, чтобы облегчить раздел. Отрегулируйте микротом, чтобы сократить разделы, которые четыре микрона толщиной для микроскопической морфологической оценки. Поместите холодный блок в микротом и вырезать один раздел из каждого блока для Н И Е окрашивания.Используя типсы, перенесите каждый участок на водяную баню по 45 градусов по Цельсию. Возьмите секцию из водяной ванны с положительно заряженным слайдом, ранее помеченным идентификационный номер образца с помощью карандаша. Поместите горки, содержащие секции, в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы секции придерживались слайдов.Держите горки в духовке в течение 25 минут. Выполните Окрашивание H и E, погрузив слайды в соответствующие банки окрашивания в течение правильного периода времени, как у табулируется в текстовом протоколе. Намонтировать четырехмирные секции для морфологического анализа с монтажной средой.И крышка стеклянной крышкой скользит. Используя слайды Н И Е и легкий микроскоп, выберите блок FFPE, который имеет наибольшее количество хорионических вилли. И если это возможно, блок, который имеет хорионические вилли отдельно от и не смешиваются с материнскими тканями.Отрегулируйте микротом, чтобы вырезать разделы толщиной 10 микрон для извлечения ДНК. Вырезать от 10 до 30 разделов, в зависимости от количества хорионических вилли в блоке. После сбора разделов с слайдами, как и раньше, поместите слайды, содержащие разделы в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы позволить разделам придерживаться слайдов.Держите горки в духовке в течение 20 минут. Выполните Окрашивание H и E, погрузив слайды в соответствующие банки окрашивания в течение правильного периода времени, как у табулируется в текстовом протоколе. Оставьте слайды под капотом дыма в течение как минимум трех часов для того, чтобы токсичные запахи ксилена рассеяться.Используя типсы, вырвите крошечный лист бумаги из увлажненной бумажной салфетки. Под легким стерео микроскопом используйте типсы и мелкие кусочки увлажненной водой бумажных салфеток, чтобы соскребать все нежелательные материнские ткани с пятен H и E толщиной 10 микрон. Ключом к этому шагу является терпение, особенно для сложных блоков.Важно также, чтобы кто-то другой взглянуть, чтобы убедиться, что не материнские ткани пропустили. Теперь, разорвать новый лист бумаги из увлажненной бумаги салфетки и использовать его для сбора хорионических вилли. Поместите кусочки бумажных салфеток с прикрепленным хорионическим вилли в помеченную трубку по 1,5 мл.Свести к минимуму количество бумажных салфеток, используемых на этом этапе, как слишком много может засорить столбец извлечения ДНК и, следовательно, уменьшить окончательное количество собранной ДНК. Следуйте протоколу извлечения ДНК из комплекта FFPE для выполнения извлечения ДНК. Используя лабораторный спектрофотометр, загрузите 1 микролитр ДНК и измерьте абсорбанс в 216 нм для количественной оценки.Загрузите 1 микролитер ДНК на гель 2%agarose и запустите гель электрофорез при напряжении от 80 до 100 вольт для качественной оценки. Основываясь на результатах оценки ДНК, выберите объем ДНК, который будет использоваться в мультиплексном коротком тандеме повторения усиления ПЦР. Цель использовать как минимум 1000 нанограммов ДНК.Приступайте к усилению ПЦР, капиллярного электрофореза и анализа данных, как описано в текстовом протоколе. Чтобы выбрать идеальный блок FFPE, используйте слайды H и E на световом микроскопе, чтобы выбрать блок FFPE, который имеет от 50 до 70% своих тканей, состоящих из хорионических вилли. Для блоков, которые не имеют идеальное количество хорионических вилли, обогатить для хорионических вилли, как раздел выполняется.Для этого определите, какая сторона свежесрезанной секции содержит больше хорионических вилли в соответствии с соответствующим слайдом Н И Е. Затем используйте лезвие, чтобы отрезать другую половину, которая должна быть отброшена для того, чтобы обогатить для хорионических вилли. Для выполнения секций наилучшего блока FFPE вырежьте четыре секции толщиной 50 микрон с помощью микротомы.В случае, если идеальный блок FFPE не доступен, цель сохранить соотношение хорионических вилли материнской ткани, тем не менее. Например, если только 30% блока состоит из хорионических вилли, в то время как остальные материнские ткани, а затем удалить по крайней мере половину раздела, который содержит материнские ткани, и использовать больше разделов, чтобы компенсировать. Поместите секции в помеченные 15 мл труб.Для депарафинизации и регидратации работайте в дымовом капоте, чтобы добавить каждый реагент и подождать соответствующий период времени, как уписаны в текстовом протоколе. Затем удалите реагент вакуумным всасыванием с помощью пипетки Pasteur. Затем добавьте четыре градуса цельсия цитрат раствора 15 мл труб.После размещения в водяной бане 80 градусов по Цельсию в течение двух часов, дайте раствору остыть до комнатной температуры. Удалите раствор цитрата вакуумным всасыванием. Добавить шесть миллилитров 1x PBS, вихрь, и ждать одну-две минуты, чтобы ткани оседают на дно.При необходимости центрифуга образцов при 1000 об/мин в течение 30 секунд. Удалите 1X PBS вакуумным всасыванием. Теперь добавьте один мл разогретого раствора пепсин и поместите в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.Вихрь каждые 10 минут. Подготовка пропидий йодид рибонуклеазы решение в последние 10 минут этого инкубации. Добавьте еще шесть мл 1x PBS, вихрь, и ждать одну-две минуты, чтобы ткани оседают на дно.Опять же, удалить 1x PBS вакуумным всасыванием. Добавьте 550 микролитров раствора рибонуклеазы propidium iodide A и поместите образцы в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Используйте типсы, чтобы поместить пять см на пять см кусок 48 микрон фильтрационой сетки в верхней части полистирола круглые нижние трубки для использования с потоком цитометра.Фильтровать раствор путем трубопроводов жидкости через сетку и в трубку. Образцы теперь готовы к запуску на цитометре потока. Держите их завернутые в фольгу, пока они не будут готовы к запуску.Наконец, выполните цитометрию потока и анализ данных, описанный в текстовом протоколе. Микроспутник генотипирования частичной гидатидиформной родинки, наряду с ДНК пациента и ее партнера, показывает, что родинка пациента является триплоидной диспермией. Первый 1-й маркер показывает два пика в продукте зачатия.Первый пик происходит от матери, так как только мать имеет пик такого размера. Следуя тем же рассуждениям, второй пик происходит от отца, так как он разделяет тот же аллель. Обратите внимание, как второй пик намного выше, чем первый, указывая, что Есть, вероятно, две дозы одного и того же отцовского аллеля в этом пике.Материнское загрязнение является очень минимальным в этом продукте зачатия, потому что он отображает очень крошечный пик в положении второго материнского аллеля. Второй маркер показывает три пика в продукте зачатия. Два из этих пиков происходят от отца, и один от матери.Третий и четвертый маркеры похожи на первый маркер, а также показывают два аллеля, поступающие от отца, и один от матери. В виду того что все 4 маркера последовательно показывают 3 аллеля, 2 возникая от отца и одного от матери, одно может заключить что этот продукт зачатия триплоид непермический и подтверждает диагноз частично моль. Для интерпретации результатов генотипирования важно знать уровень загрязнения на основе заметок, сделанных во время очистки.В некоторых случаях мы не можем прийти к выводу, следуя этим двум методам. В таких случаях мы используем другие методы, такие как FISH, чтобы раскрыть истинные генотипы. Микроспутник генотипирования позволил точной диагностики моляров и проложил путь, чтобы лучше понять генотипы, которые связаны с различными особенностями hydatidiform родинок.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

миРНК Трансфекция и EMSA Анализы на свежеизолированных ворсинок Cytotrophoblasts человека

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Оценка загрязнения ДНК в образцах РНК, основанный на рибосомной ДНК

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Плазменная ПЦР с высоким разрешением для рецептора комплемента 1 Полиморфизм длины генотипа Генотипирование: инновационный инструмент для оценки чувствительности генов к болезням Альцгеймера

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Кандидат Джин тестирование в клинической когортных исследований с мультиплексной генотипирования и масс-спектрометрии

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Экстракции ДНК высокой пропускной способностью и генотипирования 3dpf личинки у рыбок данио путем отсечения Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Измерение BK-полиомавируса Некодирования Контроль региона Driven транскрипционной активности через поток цитометрии

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...