Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
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Los autores agradecen a Sophie Patrier y Marianne Parésy por compartir el protocolo original de citometría de flujo, y Promega y Qiagen por proporcionar suministros y reactivos. Este trabajo fue apoyado por el Réseau Québécois en Reproduction y el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (MOP-130364) a R.S.

Este estudio de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de McGill. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio y para que sus productos FFPE de concepción (POC) se recuperaran de varios departamentos de patología.
NOTA: Si bien existen varios métodos para el genotipado y la determinación de la ploidía por citometría de flujo, los protocolos proporcionados aquí describen un método de análisis utiliz...

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	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

Los HM son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas y tienen diferentes tipos histológicos y genotípicos, lo que hace que su clasificación y diagnóstico precisos sean desafiantes. La evaluación morfológica histopatológica a menudo se demostró inexacta y, por lo tanto, no es fiable por sí sola para clasificar a HM en CHM y PHM y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares. Por lo tanto, un diagnóstico preciso de HM requiere el uso de otros métodos como el genotipado de ADN multix micro...

Un lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por un desarrollo embrionario anormal, hiperproliferación del trofototo y degeneración hidrográfica de vellosidades coriónicas (CV). Históricamente, HM solía dividirse en dos tipos, HM completo (CHM) y HM parcial (PHM) basado únicamente en la evaluación morfológica1. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica por sí sola no es suficiente para clasificar HM en los dos subtipos (CHM y PHM) y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares2,3,4.
Debido a que CHM y PHM tienen diferentes propensiones a las neoplasias malignas, por lo tanto, es importante determinar con precisión el tipo genotípico de HM para proporcionar un seguimiento y un manejo adecuados a los pacientes. En consecuencia, en las últimas décadas, se han desarrollado y evolucionado varias metodologías con el fin de identificar la contribución parental a los tejidos molares y alcanzar una clasificación correcta de HM. Estos incluyen análisis de cariotipo, polimorfismo de bandas cromosómicas, tilometría serológica de antígeno leucocito humano (HLA), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem, genotipado de microsatélites, citometría de flujo y p57 Inmunohistoquímica KIP2. Esto ha permitido una subdivisión precisa de las concepciones hm basadas en la contribución de los padres a sus genomas, de la siguiente manera: CHM, que son diploides androgenéticos androgenéticos o diploides dispermicos androgenéticos, y PHM, que son triploide, disperménico en 99% y monobrímico en el 1% de los casos5,6,7,8. Además, hay otro tipo de HM genotípico que surgió en las últimas dos décadas, que es diploide biparental. Este último es en su mayoría recurrente y puede afectar a un solo miembro de la familia (casos simplex) o al menos a dos miembros de la familia (casos familiares). Estos lunares biparentales diploides son causados principalmente por mutaciones recesivas en NLRP7 o KHDC3L en los pacientes9,10,11,12. Diploid biparental HM en pacientes con mutaciones recesivas en NLRP7 puede ser diagnosticado como CHM o PHM por análisis morfológico y esto parece estar asociado con la gravedad de las mutaciones en los pacientes13,14. Además de la clasificación de HM según sus genotipos, la introducción y el uso de varios métodos de genotipado permitieron distinguir las diversas entidades molares de los abortos espontáneos no molares, tales como concepciones biparentales diploides aneuploides y otros tipos de concepciones5,15. Tales concepciones pueden tener alguna proliferación de trofoblastos y morfología villosa anormal que imitan, hasta cierto punto, algunas características morfológicas de HM.
El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el genotipado multiplex y la citometría de flujo de los tejidos de parafina incrustada en formalina-fijación (FFPE), y análisis exhaustivos de los resultados de estos métodos y su integración con otros métodos para diagnóstico correcto y concluyente de los tejidos molares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

El lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por una proliferación trofoblástica excesiva y un desarrollo embrionario anormal. Existen dos tipos de HM basados en la evaluación morfológica microscópica, HM completa (CHM) y HM parcial (PHM). Estos pueden subdividirse aún más en función de la contribución parental a los genomas molares. Tal caracterización de HM, por morfología y análisis de genotipos, es crucial para el manejo del paciente y para la comprensión fundamental de esta patología intrigante. Está bien documentado que el análisis morfológico de HM está sujeto a una amplia variabilidad interobservador y no es suficiente por sí solo para clasificar con precisión hm en CHM y PHM y distinguirlos de abortos hidropicos no molares. El análisis de genotipado se realiza principalmente en EL ADN y los tejidos de los productos de concepción de parafina fijados en formalina (FFPE), que tienen una calidad inferior a la óptima y, por lo tanto, pueden conducir a conclusiones erróneas. En este artículo, se proporcionan protocolos detallados para el genotipado multiplex y análisis de citometría de flujo de los tejidos molares FFPE, junto con la interpretación de los resultados de estos métodos, su solución de problemas y la integración con la evaluación morfológica , inmunohistoquímica p57KIP2 e hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para llegar a un diagnóstico correcto y robusto. Aquí, los autores comparten los métodos y lecciones aprendidas en los últimos 10 años del análisis de aproximadamente 400 productos de concepción.

La complejidad de los tejidos molares y el hecho de que puedan tener varios genotipos requieren un análisis riguroso y el uso de varios métodos como la evaluación morfológica, la inmunohistoquímica p57, el genotipado de microsatélites, la citometría de flujo y el FISH. Por ejemplo, un paciente (1790) fue referido con dos PHM que se encontró triploide por el análisis de microarray de los POC solamente. Por lo tanto, el paciente fue diagnosticado con PHM recurrente. El genotipado m...

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Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Los lunares hidatidiformes son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas que se pueden clasificar según sus características morfológicas y la contribución parental a los genomas molares. Aquí, los protocolos de genotipado de ADN microsatélite multiplex y citometría de flujo de tejidos molares de parafina incrustados fijados por formalina se describen en detalle, junto con la interpretación e integración de los resultados.

Genotipado de ADN microsatélite y análisis de ploidía de citometría de flujo de tejidos molares de parafina incorporados en parafina-involuntaria-incrustadas

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

La principal ventaja de nuestro protocolo de genotipado es que minimiza la contaminación con ADN materno, que es el principal desafío al genotipar tejidos molares fijados en formalina e incrustados en parafina. La citometría de flujo es un método rápido y económico que facilita en gran medida el diagnóstico de lunares hidatidiformes. Para cada producto de concepción de parafina fija fija de formalina, o FFPE, preparar una sección de hematoxilina y tinción de eosina de cuatro micras de espesor, como se detalla en este vídeo para la evaluación morfológica por microscopía.Coloque los bloques FFPE sobre hielo durante 15 minutos para facilitar el seccionamiento. Ajuste el microtomo para cortar secciones de cuatro micras de espesor para una evaluación morfológica microscópica. Coloque el bloque frío en el microtoma y corte una sección de cada bloque para la tinción de H&E.Usando fórceps, transfiera cada sección a un baño de agua de 45 grados Celsius. Recoja la sección del baño de agua con un tobogán cargado positivamente previamente etiquetado con el número de identificación de la muestra usando un lápiz. Coloque las diapositivas que contienen las secciones en un horno a 65 grados Celsius para permitir que las secciones se adhieran a las diapositivas.Mantenga los portaobjetos en el horno durante 25 minutos. Realice la tinción H&E sumergiendo las diapositivas en los frascos de tinción adecuados durante el período de tiempo correcto, tal como se tabula en el protocolo de texto. Monte las secciones de cuatro micras para el análisis morfológico con medio de montaje.Y cúbrete con los resbalones de la cubierta de vidrio. Usando las diapositivas H&E y un microscopio de luz, seleccione el bloque FFPE que tiene la mayor cantidad de vellosidades coriónicas. Y si es posible, el bloque que tiene vellosidades coriónicas separados y no mezclados con tejidos maternos.Ajuste el micrototoma para cortar secciones de 10 micras de espesor para la extracción de ADN. Cortar de 10 a 30 secciones, dependiendo de la cantidad de vellosidades coriónicas en el bloque. Después de recoger las secciones con diapositivas como antes, coloque las diapositivas que contienen las secciones en un horno a 65 grados Celsius para permitir que las secciones se adhieran a los portaobjetos.Mantenga los portaobjetos en el horno durante 20 minutos. Realice la tinción H&E sumergiendo las diapositivas en los frascos de tinción adecuados durante el período de tiempo correcto, tal como se tabula en el protocolo de texto. Deje los portaobjetos debajo de la campana de humo durante un mínimo de tres horas para que los olores tóxicos del xileno se disipenen.Usando fórceps, saque un pequeño pedazo de papel de una toallita de papel humedecido. Bajo un microscopio estéreo ligero, utilice los fórceps y pequeños trozos de toallitas de papel humedecidas con agua para raspar todos los tejidos maternos no deseados de las manchas de H&E secciones de 10 micras de espesor. La clave para este paso es la paciencia, especialmente para los bloques desafiantes.También es importante que otra persona eche un vistazo para asegurarse de que no se pierdan tejidos maternos. Ahora, saca un pedazo nuevo de papel de las toallitas de papel humedecidas y úsala para recoger las vellosidades coriónicas. Coloque los trozos de toallitas de papel con sus vellosidades coriónicas adheridas en un tubo etiquetado de 1,5 ml.Minimice la cantidad de toallitas de papel utilizadas en este paso, ya que demasiado puede obstruir la columna de extracción de ADN y, en consecuencia, reducir la cantidad final de ADN recogido. Siga el protocolo de extracción de ADN de un kit FFPE para realizar la extracción de ADN. Usando un espectrofotómetro de laboratorio, cargue 1 microlitro de ADN y mida la absorbancia a 216 nm para la cuantificación.Cargue 1 microlitro de ADN en un gel de 2% agarosa y ejecute electroforesis de gel a una tensión de 80 a 100 voltios para una evaluación cualitativa. En función de los resultados de la evaluación de ADN, elija el volumen de ADN que se utilizará en la amplificación de PCR de repetición en tándem corto multiplex. Intenta usar un mínimo de 1000 nanogramos de ADN.Proceda a la amplificación de PCR, electroforesis capilar y análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Para elegir el bloque FFPE ideal, utilice diapositivas H&E en un microscopio de luz para seleccionar un bloque FFPE que tenga entre el 50 y el 70% de sus tejidos compuestos de vellosidades coriónicas. Para bloques que no tienen la cantidad ideal de vellosidades coriónicas, enriquecer para las vellosidades coriónicas a medida que se realiza la sección.Para ello, identifique qué lado de las secciones recién cortadas contiene más vellosidades coriónicas de acuerdo con su diapositiva H&E correspondiente. A continuación, utilice una cuchilla para cortar la otra mitad que necesita ser desechada con el fin de enriquecer para las vellosidades coriónicas. Para realizar la sección del mejor bloque FFPE posible, corte cuatro secciones de 50 micras de espesor utilizando un microtoma.En el caso de que no se disponga de un bloque FFPE ideal, procura mantener la relación entre las vellosidades coriónicas y el tejido materno. Por ejemplo, si sólo el 30% del bloque está compuesto de vellosidades coriónicas, mientras que el resto tiene tejidos maternos, entonces retire al menos la mitad de la sección que contiene los tejidos maternos, y use más secciones para compensar. Coloque las secciones en tubos etiquetados de 15 ml.Para la desparafinación y la rehidratación, trabaje en una campana de humos para agregar cada reactivo y espere el período de tiempo adecuado según lo tabulado en el protocolo de texto. A continuación, retire el reactivo por aspiración al vacío con una pipeta Pasteur. A continuación, añada cuatro grados de solución de citrato Celsius a los tubos de 15 ml.Después de colocar en un baño de agua de 80 grados Celsius durante dos horas, deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Retire la solución de citrato por aspiración al vacío. Agregue seis mililitros de 1x PBS, vórtice, y espere de uno a dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior.Si es necesario, centrifugar las muestras a 1000 RPM durante 30 segundos. Retire el 1X PBS por aspiración al vacío. Ahora agregue un ml de solución de pepsina precalentada y colóquela en un baño seco de 37 grados Celsius durante 30 minutos.Vórtice cada 10 minutos. Preparar la solución propidium iodide ribonucleasa A en los últimos 10 minutos de esta incubación. Agregue otros seis ml de 1x PBS, vórtice, y espere de uno a dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior.Una vez más, retire el 1x PBS por aspiración al vacío. Añadir 550 microlitros de la solución de ribonucleasa de yoduro de propidium A, y colocar las muestras en un baño seco de 37 grados Celsius durante 30 minutos. Utilice fórceps para colocar una pieza de cinco cm por cinco cm de malla de filtración de 48 micras en la parte superior de los tubos inferiores redondos de poliestireno para su uso con el citómetro de flujo.Filtrar la solución pipeteando el líquido a través de la malla y en el tubo. Las muestras ya están listas para ejecutarse en el citómetro de flujo. Manténgalos envueltos en papel de aluminio hasta que estén listos para ser ejecutados.Por último, realice la citometría de flujo y el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. El genotipado de microsatélites de un lunar hidatidiformo parcial, junto con el ADN del paciente y su pareja, revela que el lunar del paciente es dispermático triploides. El primer 1er marcador muestra dos picos en el producto de la concepción.El primer pico se origina de la madre, ya que sólo la madre tiene un pico de este tamaño. Siguiendo el mismo razonamiento, el segundo pico se origina en el padre ya que comparte el mismo alelo. Observe cómo el segundo pico es mucho más alto que el primero, lo que indica que probablemente hay dos dosis del mismo alelo paterno en ese pico.La contaminación materna es muy mínima en este producto de la concepción porque muestra un pico muy pequeño en la posición del segundo alelo materno. El segundo marcador muestra tres picos en el producto de la concepción. Dos de estos picos se originan en el padre, y uno de la madre.El tercer y cuarto marcadores son similares al primer marcador, y también muestran dos alelos provenientes del padre, y uno de la madre. Dado que los cuatro marcadores muestran constantemente tres alelos, dos originarios del padre y uno de la madre, se puede concluir que este producto de la concepción es dispermático triploide y confirma el diagnóstico de lunar parcial. Para la interpretación de los resultados del genotipado, es importante ser consciente del nivel de contaminación basado en las notas tomadas durante los pasos de limpieza.En algunos casos, no podemos llegar a una conclusión siguiendo estos dos métodos. En tales casos, utilizamos otros métodos como FISH, para descubrir los verdaderos genotipos. El genotipado de microsatélites ha permitido un diagnóstico molar preciso y ha allanado el camino para comprender mejor los genotipos que están asociados con las diversas características de los lunares hidatidiformes.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Investigación

Genética

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Evaluación de la contaminación del ADN en las muestras de RNA basadas en ADN Ribosomal

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

PCR de fusión de alta resolución para el receptor de complemento 1 Longitud Polimorfismo Genotipificación: una herramienta innovadora para la evaluación de la susceptibilidad genética de la enfermedad de Alzheimer

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulación de ploidía en Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...