Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Författarna tackar Sophie Patrier och Marianne Parésy för att de delar det ursprungliga flödescytometri-protokollet, och Promega och QIAGEN för att tillhandahålla varor och reagenser. Detta arbete stöddes av Réseau Québécois en reproduktion och det kanadensiska Institutet för hälsoforskning (MOP-130364) till R.S.

Denna forskningsstudie godkändes av McGill institutions granskningsnämnd. Alla patienter gav skriftligt medgivande till att delta i studien och att få sina FFPE-produkter av befruktningen (POCs) hämtade från olika patologi avdelningar.
Anmärkning: Även om det finns flera metoder för genotypning och ploidi bestämning av flödescytometri, beskriver de protokoll som här beskrivs en analysmetod med en plattform för varje.
1. genotypning
<ol...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier och har olika histologiska och genotypiska typer, vilket gör deras korrekta klassificering och diagnos utmanande. Histopatologisk morfologisk utvärdering har ofta visat sig vara felaktig och är därför opålitlig på egen hand för att klassificera HM i CHM och PHM och särskilja dem från icke-molara missfall. Därför kräver en korrekt diagnos av HM användning av andra metoder såsom multiplex mikrosatelliten DNA genotypning, ploiditeten analys av ...

En hydatidiform mullvad (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av onormal embryonal utveckling, hyperproliferation av trofoblast, och och degeneration av korionvilli (CV). Historiskt, HM brukade delas in i två typer, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM) bygger endast på morfologisk utvärdering1. Emellertid, det har visats att morfologisk utvärdering ensam är inte tillräckligt för att klassificera HM i de två subtyperna (chm och PHM) och skilja dem från icke-molar missfall2,3,4.
Eftersom chm och PHM har olika benägenhet att maligniteter, är det därför viktigt att exakt bestämma genotypisk typ av HM för att ge lämplig uppföljning och förvaltning till patienterna. Under de senaste decennierna har därför flera metoder utvecklats och utvecklats i syfte att identifiera föräldra bidraget till molar vävnaderna och nå en korrekt klassificering av HM. Dessa inkluderar karyotyp analys, kromosomala banding polymorfism, humant leukocyt antigen (HLA) serologiska typning, begränsning fragment längd polymorfism, varierande antal tandem upprepningar, mikrosatelliten genotypning, flödescytometri, och P57 KIP2 immunohistokemi. Detta har tillåtit korrekt indelning av HM föreställningar baserat på föräldrarnas bidrag till deras genom, enligt följande: CHM, som är diploida Androgenetisk monospermic eller diploida Androgenetisk dispermic, och PHM, som är triploida, dispermic i 99% och monospermic i 1% av fallen5,6,7,8. Dessutom finns det en annan genotypisk typ av HM som dök upp under de senaste två decennierna, som är diploida biparental. Det sistnämnda är oftast återkommande och kan påverka en enda familjemedlem (simplex-fall) eller minst två familjemedlemmar (familjella fall). Dessa diploida biföräldra mullvadar orsakas främst av recessiva mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterna9,10,11,12. Diploid från HM hos patienter med recessiva mutationer i NLRP7 kan diagnostiseras som chm eller PHM av Morfologisk analys och detta verkar vara förknippat med svårighetsgraden av mutationer i patienterna13,14. Förutom klassificeringen av HM enligt deras genotyper tillät införandet och användningen av flera genotypningsmetoder distinktionen mellan de olika molar-enheterna från icke-molara missfall, såsom aneuploida diploida biföräldrars befruktningar och andra typer av befruktningar5,15. Sådana föreställningar kan ha vissa trofoblastproliferation och onormal villösa morfologi som härma, i viss mån, några morfologiska egenskaper hos HM.
Syftet med denna artikel är att tillhandahålla detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader, och omfattande analyser av resultaten av dessa metoder och deras integration med andra metoder för korrekt och avgörande diagnos av molar vävnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform Mole (HM) är en onormal mänsklig graviditet kännetecknas av överdriven trofoblastisk proliferation och onormal embryonal utveckling. Det finns två typer av HM baserat på mikroskopisk morfologisk utvärdering, komplett HM (CHM) och partiell HM (PHM). Dessa kan delas upp ytterligare baserat på föräldrarnas bidrag till molar genomerna. Sådan karakterisering av HM, genom morfologi och genotyp analyser, är avgörande för patientens ledning och för den grundläggande förståelsen av denna spännande patologi. Det är väl dokumenterat att Morfologisk analys av HM är föremål för stor interobserver variation och är inte tillräckligt på egen hand för att korrekt klassificera HM i CHM och PHM och skilja dem från och icke-molar aborter. Genotypning analys utförs främst på DNA och vävnader från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) produkter av befruktningen, som har mindre än optimal kvalitet och kan därför leda till felaktiga slutsatser. I denna artikel tillhandahålls detaljerade protokoll för multiplex genotypning och flödescytometri analyser av FFPE molar vävnader, tillsammans med tolkningen av resultaten av dessa metoder, deras felsökning, och integration med den morfologiska utvärderingen , P57KIP2 immunohistokemi, och fluorescens in situ hybridisering (fisk) för att nå en korrekt och robust diagnos. Här delar författarna de metoder och lärdomar som har dragits under de senaste 10 åren från analysen av cirka 400 produkter av befruktningen.

Komplexiteten i molar vävnader och det faktum att de kan ha olika genotyper kräver noggrann analys och användning av flera metoder såsom morfologisk utvärdering, P57 immunohistokemi, mikrosatelliten genotypning, flödescytometri, och fisk. Till exempel, en patient (1790) remitterades med två PHM som konstaterades vara triploid av Microarray analys av POCs bara. Patienten diagnostiserades därför med recidiverande PHM. Mikrosatellit genotypning av hennes två "PHM" tillsammans med D...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform mullvadar är onormala mänskliga graviditeter med heterogena etiologier som kan klassificeras enligt deras morfologiska egenskaper och föräldrarnas bidrag till molar Genomes. Här beskrivs protokoll för multiplex mikrosatelliten DNA genotypning och flödescytometri av formalin-fast paraffin-inbäddade molar vävnader i detalj, tillsammans med resultat ' tolkning och integration.

Microsatellite DNA genotypning och flödescytometri Ploidy analyser av formalin-fast paraffin-inbäddade Hydatidiform molar vävnader

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Den primära fördelen med vår genotypning protokollet är att det minimerar kontaminering med moderns DNA, som är den största utmaningen när genotypning formalin-fast, paraffin-inbäddade molar vävnader. Flödescytometri är en snabb och billig metod som i hög grad underlättar diagnos av hydatidiform mol. För varje formalin-fast paraffin-inbäddade, eller FFPE, produkt av befruktningen, förbereda en fyra-micron tjock hematoxylin och eosin fläck avsnitt som beskrivs i denna video för morfologisk utvärdering genom mikroskopi.Placera FFPE-blocken på is i 15 minuter för att underlätta snittningen. Justera mikrotomen för att skära sektioner som är fyra mikrometer tjocka för mikroskopisk morfologisk utvärdering. Placera kylblocket i mikrotomen och skär ett avsnitt från varje block för H&E-färgning.Med hjälp av tensor, överför varje sektion till ett 45 grader Celsius vattenbad. Plocka upp avsnittet från vattenbadet med en positivt laddad rutschkana som tidigare märkts med providentifieringsnumret med hjälp av en penna. Placera bilderna som innehåller avsnitten i en ugn vid 65 grader Celsius så att sektionerna kan följa bilderna.Förvara rutschkanorna i ugnen i 25 minuter. Utför H&E-infärgningen genom att dränka objektglasen i lämpliga färgningsburkar för den korrekta tidsperioden som tabulated i textprotokollet. Montera de fyra-mikron sektionerna för morfologisk analys med monteringsmedium.Och täck med glasöverdragssli. Med hjälp av H&E-objektglasen och ett ljusmikroskop väljer du FFPE-blocket som har den största mängden korionjiska villi. Och om möjligt, det block som har korion villi separat från och inte blandas med moderns vävnader.Justera mikrotomen för att skära sektioner som är 10 mikrometer tjocka för DNA-extraktion. Skär 10 till 30 sektioner, beroende på mängden korion villi i blocket. När du har plockat upp sektionerna med diabilder som tidigare, placera de bilder som innehåller avsnitten i en ugn på 65 grader Celsius för att låta sektionerna att hålla sig till bilderna.Förvara rutschkanorna i ugnen i 20 minuter. Utför H&E-infärgningen genom att dränka objektglasen i lämpliga färgningsburkar för den korrekta tidsperioden som tabulated i textprotokollet. Låt rutschbanorna vara kvar under draghuven i minst tre timmar för att de giftiga xylenluktarna ska kunna avledas.Med hjälp av tlys, riva en liten bit papper ur en fuktad papper torka. Under ett lätt stereomikroskop, använd de tlympor och små bitar av vattenfuktade pappersservetter för att skrapa bort alla oönskade modersvävnader från H&E fläckar 10-mikron tjocka sektioner. Nyckeln för detta steg är tålamod, särskilt för utmanande block.Det är också viktigt att ha någon annan ta en titt för att säkerställa att inga modersvävnader missas. Nu, riva en ny bit papper ur fuktade pappersservetter och använda den för att samla den korioniska villi. Placera bitar av papper våtservetter med deras bifogade chorionic villi i en märkt 1,5 ml rör.Minimera mängden pappersservetter som används i detta steg eftersom för mycket kan täppa till DNA-extraktionskolumnen och följaktligen minska den slutliga mängden uppsamlat DNA. Följ DNA-extraktionsprotokollet från en FFPE-sats för att utföra DNA-extraktion. Med hjälp av en lab spektrofotometer, ladda 1 mikroliter av DNA och mäta absorbans vid 216 nm för kvantifiering.Ladda 1 mikroliter dna på en 2%agarosgel och kör gelelektrofores vid en spänning på 80 till 100 volt för kvalitativ utvärdering. Baserat på DNA-utvärderingsresultaten, välj den volym av DNA som ska användas i multiplex kort tandem repeat PCR-amplifiering. Sikta på att använda minst 1000 nanogram DNA.Fortsätt till PCR-förstärkning, kapillärelektrofores och dataanalys enligt beskrivningen i textprotokollet. För att välja den idealiska FFPE blocket, använd H & E diabilder på ett ljus mikroskop för att välja en FFPE block som har cirka 50 till 70%av dess vävnader består av korion villi. För block som inte har den ideala mängden korion villi, berika för korion villi som snittningen utförs.För att göra det, identifiera vilken sida av de nyklippta sektionerna som innehåller mer korion villi enligt dess motsvarande H&E-bild. Sedan, använd ett blad för att skära av den andra halvan som måste kasseras för att berika för chorionic villi. För att utföra snittning av bästa möjliga FFPE-block, skär fyra sektioner som är 50 mikrometer tjocka med hjälp av en mikrotom.I det fall att en idealisk FFPE block inte är tillgänglig, syftar till att upprätthålla förhållandet mellan korionen villi till moderns vävnad ändå. Till exempel, om bara 30%av blocket består av korion villi, medan resten har moderns vävnader, sedan ta bort minst hälften av den sektion som innehåller de modersvävnader, och använda fler sektioner för att kompensera. Placera sektionerna i märkta 15 mL rör.För avparaffinisering och rehydrering, arbeta i en rökhuv för att lägga till varje reagens och vänta lämplig tidsperiod som tabulated i textprotokollet. Ta sedan bort reagensen genom vakuumsug med en Pasteurpipett. Därefter lägger du till fyra grader Celsius citratlösning till 15 mL-rören.Efter att ha placerat i ett 80 grader Celsius vattenbad i två timmar, låt lösningen svalna till rumstemperatur. Ta bort citratlösningen genom vakuumsug. Tillsätt sex milliliter 1x PBS, virvel, och vänta en till två minuter så att vävnaderna att bosätta sig till botten.Om det behövs, centrifugera proverna vid 1000 RPM i 30 sekunder. Ta bort 1X PBS genom vakuumsug. Lägg nu till ett mL förvärmd pepsinlösning och placera i ett 37 grader Celsius torrt bad i 30 minuter.Vortex var 10:e minut. Förbered propidium iodid ribonuclease A-lösningen under de sista 10 minuterna av denna inkubation. Lägg till ytterligare sex mL av 1x PBS, virvel, och vänta en till två minuter så att vävnaderna att bosätta sig till botten.Återigen, ta bort 1x PBS genom vakuumsug. Tillsätt 550 mikroliter av propidium iodid ribonuklease A-lösningen, och placera proverna i ett 37 grader Celsius torrt vatten i 30 minuter. Använd forceps för att placera en fem cm med fem cm bit 48 mikron filtrering mesh i den övre delen av polystyren runda bottenrör för användning med flödet cytometer.Filtrera lösningen genom att pipettera vätskan genom nätet och in i röret. Proverna är nu klara att köras på flödescytometern. Håll dem inslagna i folie tills de är redo att köras.Slutligen utför flödescytometri och dataanalys enligt beskrivningen i textprotokollet. Microsatellite genotypning av en partiell hydatidiform mol, tillsammans med DNA av patienten och hennes partner, avslöjar att patientens mullvad är triploid dispermic. Den första 1: a markören visar två toppar i produkten av befruktningen.Den första toppen härstammar från modern, eftersom endast modern har en topp av denna storlek. Efter samma resonemang kommer den andra toppen från fadern eftersom han delar samma allel. Lägg märke till hur den andra toppen är mycket högre än den första, vilket tyder på att det förmodligen finns två doser av samma faderliga allel i den toppen.Moderns kontaminering är mycket minimal i denna produkt av befruktningen eftersom det visar en mycket liten topp på positionen för den andra moderns allel. Den andra markören visar tre toppar i produkten av befruktningen. Två av dessa toppar härstammar från fadern, och en från modern.Den tredje och fjärde markörer liknar den första markören, och visar också två alleler som kommer från fadern, och en från modern. Eftersom alla fyra markörer visar konsekvent tre alleler, två som härrör från fadern och en från modern, kan man dra slutsatsen att denna produkt av befruktningen är triploid dispermic och bekräftar diagnos av partiell mullvad. För tolkningen av genotypningsresultaten är det viktigt att vara medveten om föroreningsnivån baserat på de anteckningar som togs under rengöringsstegen.För vissa fall kan vi inte komma fram till en slutsats efter dessa två metoder. I sådana fall använder vi andra metoder som FISH, för att avslöja de sanna genotyperna. Microsatellite genotypning har möjlig gjort för korrekt molar diagnos och banade väg för att bättre förstå de genotyper som är associerade med de olika funktionerna i hydatidiform mol.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfektion och EMSA Analyser av nyligen isolerade mänskliga villös cytotrofoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Förbättrad Polymerase Chain Reaction-restriction fragment length polymorphism Genotypning av Toxic Pufferfish genom vätskekromatografi / masspektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bedömning av DNA kontaminering i RNA-prover baserat på Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Högupplöst smältande PCR för komplementreceptor 1 Längdpolymorfism Genotyping: Ett innovativt verktyg för Alzheimers sjukdomssynsberoende bedömning

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation av ploiditeten i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat Gene tester i klinisk kohortstudier med multiplexade genotypning och masspektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hög genomströmning DNA-extraktion och genotypning av 3dpf zebrafiskar larver av Fin klippning

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Mätning av BK-polyomavirus icke-kodning kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...