Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Yazarlar sophie Patrier ve Marianne Parésy orijinal akış sitometri protokolü paylaşımı için teşekkür ve Promega ve Qiagen malzemeleri ve reaktifler sağlamak için. Bu çalışma Réseau Québécois en Reprodüksiyon ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (MOP-130364) tarafından R.S.'ye destek lenmiştir.

Bu araştırma McGill Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm hastalar çalışmaya katılmak ve ffpe ürünlerinin çeşitli patoloji bölümlerinden alınması için yazılı izin verilmiştir.
NOT: Akış sitometrisi ile genotipleme ve ploidi tayini için çeşitli yöntemler olmakla birlikte, burada sağlanan protokoller her biri için bir platform kullanarak bir analiz yöntemini tanımlar.
1. Genotipleme
<ol><li>
<strong...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM heterojen etiyolojileri ile anormal insan gebelikleri ve farklı histolojik ve genotik türleri vardır, hangi onların doğru sınıflandırma ve tanı zor hale getirir. Histopatolojik morfolojik değerlendirme genellikle yanlış kanıtlanmıştır ve bu nedenle HM'yi CHM ve PHM olarak sınıflandırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırt etmek için tek başına güvenilmezdir. Bu nedenle, HM doğru bir tanı multiks mikrouydu DNA genotipleme, akış sitometri sitometri sitometri sitomi ile ploidi anali...

Hydatidiform mol (HM), anormal embriyonik gelişim, trofoblastın hiperproproproproproproprobu ve koryonik villinin hidropik dejenerasyonu (CV) ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Tarihsel olarak, HM iki tip, tam HM (CHM) ve kısmi HM (PHM) sadece morfolojik değerlendirme1dayalı bölünmüş olması için kullanılır. Ancak, morfolojik değerlendirmenin tek başına HM'yi iki alt tipe (CHM ve PHM) ayırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırmak için yeterli olmadığı gösterilmiştir2,3,4.
CHM ve PHM'nin malignitelere göre farklı eğilimleri olduğundan, hastalara uygun takip ve yönetimi sağlamak için genotik HM tipini doğru bir şekilde belirlemek önemlidir. Sonuç olarak, son yıllarda, azı laklarına ebeveyn katkısını belirlemek ve HM'nin doğru bir sınıflandırmasına ulaşmak amacıyla çeşitli metodolojiler geliştirilmiş ve geliştirilmiştir. Bunlar arasında karyotip analizi, kromozom bantlama polimorfizmi, insan lökosit antijeni (HLA) serolojik yazma, restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi, değişken tandem tekrarı sayısı, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve p57 KIP2 immünohistokimya. Bu, hm gebelerinin genomlarına ebeveyn katkısına dayalı doğru bir alt bölüme sahip olmasına olanak sağlamıştır: Dploid androgenetik monospermik veya diploid androgenetik dispermik olan CHM ve triploid olan PHM, %99 ve olguların %1'inde monospermik5,6,7,8. Ayrıca, son yirmi yılda ortaya çıkan başka bir genotypic HM tipi vardır, hangi diploid biparental olduğunu. İkincisi çoğunlukla tekrarlayan ve tek bir aile üyesi etkileyebilir (simpleks durumlarda) veya en az iki aile üyesi (ailesel durumlarda). Bu diploid biebeveyn benler çoğunlukla NLRP7 veya KHDC3L hastalarda9,10,11,12resesif mutasyonlar neden olur. NLRP7'de resesif mutasyonu olan hastalarda diploid biebeveynLI HM morfolojik analiz ile CHM veya PHM tanısı konabilir ve bu hastalardamutasyonların şiddeti ile ilişkili gibi görüner13,14. HM'nin genotiplerine göre sınıflandırılmasına ek olarak, çeşitli genotipleme yöntemlerinin tanıtımı ve kullanımı, çeşitli molar varlıkların molar olmayan düşüklerden, örneğin aneuploid diploid biebeveyn kavramları ndan ayırt edilebilmiştir ve diğer kavram türleri5,15. Bu tür kavramlar bazı trofoblast proliferasyonu ve bir dereceye kadar HM bazı morfolojik özellikleri taklit anormal villous morfolojisi olabilir.
Bu makalenin amacı, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokuların çokkatlı genotipleme ve akış sitometrisi için ayrıntılı protokoller sağlamak ve bu yöntemlerin sonuçlarının kapsamlı analizleri ve bunların diğer yöntemlerle bütünleştirilmesi azı laklarının doğru ve kesin tanısı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hidatidiform mol (HM), aşırı trofoblastik proliferasyon ve anormal embriyonik gelişim ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Mikroskobik morfolojik değerlendirmeye dayalı iki tip HM vardır: komple HM (CHM) ve kısmi HM (PHM). Bunlar, molar genomlarına ebeveyn katkısına göre daha fazla alt bölümlere ayrılabilir. HM'nin morfoloji ve genotip analizleri ile böyle bir karakterizasyonu, hasta yönetimi ve bu ilginç patolojinin temel anlayışı için çok önemlidir. HM'nin morfolojik analizinin geniş bir gözlemci ler arası değişkenliğe tabi olduğu ve HM'yi CHM ve PHM'ye doğru bir şekilde sınıflandırmak ve bunları hidropik molar olmayan düşüklerden ayırmak için tek başına yeterli olmadığı belgelenmiştir. Genotipleme analizi çoğunlukla optimal kaliteden daha az olan ve sonuç olarak yanlış sonuçlara yol açabilecek formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) döllenme ürünlerinden DNA ve dokular üzerinde yapılır. Bu makalede FFPE molar dokularının çokk genotipleme ve akış sitometri analizleri için ayrıntılı protokoller, bu yöntemlerin sonuçlarının yorumlanması, bunların sorun giderme ve morfolojik değerlendirme ile entegrasyon ile birlikte sağlanmaktadır. , p57KIP2 immünohistokimya, ve floresan yerinde hibridizasyon (FISH) doğru ve sağlam bir tanı ulaşmak için. Burada yazarlar, son 10 yılda yaklaşık 400 conception ürününün analizinden öğrenilen yöntem ve dersleri paylaşıyorlar.

Azı laklarının karmaşıklığı ve çeşitli genotiplere sahip olmaları, morfolojik değerlendirme, p57 immünohistokimyası, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve FISH gibi çeşitli yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Örneğin, bir hastaya (1790) sadece POC'ların mikrodizi analizi ile triploid olduğu tespit edilen iki PHM ile sevk edildi. Bu nedenle hastaya tekrarlayan PHM tanısı konuldu. Hastanın dna'sı ve partneri ile birlikte iki "PHM"in mikrouydu genotiplem...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform benler, morfolojik özelliklerine ve molar genomlara ebeveyn katkısına göre sınıflandırılabilen heterojen etiyolojileri olan anormal insan gebelikleridir. Burada formalin-sabit parafin gömülü azı laksamalarının multipleks mikrouydu DNA genotipleme ve akış sitometrisi protokolleri, sonuçların yorumlanması ve entegrasyonu ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Genotipleme protokolümüzün en önemli avantajı, formalin-sabit, parafin gömülü molar dokuları genotipleme de ana sorun olan anne DNA ile kontaminasyonu en aza indirmektir. Akış sitometri büyük ölçüde hydatidiform benlerin tanısını kolaylaştıran hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Her formalin-sabit parafin gömülü, veya FFPE, gebe ürünü için, mikroskopi ile morfolojik değerlendirme için bu videoda ayrıntılı olarak dört mikron kalınlığında hematoksin ve eozin leke bölümü hazırlamak.Kesiti kolaylaştırmak için FFPE bloklarını 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Mikrotomu mikroskobik morfolojik değerlendirme için dört mikron kalınlığında kesecek şekilde ayarlayın. Soğuk bloğu mikrotome yerleştirin ve H&E boyama için her bloktan bir kesin.Forceps kullanarak, 45 santigrat derece su banyosu için her bölümü aktarın. Daha önce bir kalem kullanarak örnek kimlik numarası ile etiketlenmiş pozitif yüklü bir slayt ile su banyosundan bölümü alın. Bölümleri içeren slaytları 65 derece lik bir fırına yerleştirin ve bölümlerin slaytlara yapışmasını bekleyin.Slaytları 25 dakika fırında bekletin. Slaytları metin protokolünde tablolu olarak doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin. Morfolojik analiz için dört mikronluk bölümleri montaj ortamı ile monte edin.Ve cam kapak fişleri ile kaplayın. H&E slaytları ve hafif mikroskobu kullanarak, en fazla koryonik villi miktarına sahip FFPE bloğunu seçin. Ve mümkünse, koryonik villi olan blok ayrı ve anne dokuları ile iç içe değil.MIKROtomu, DNA ekstraksiyonu için 10 mikron kalınlığında ki kesitleri kesecek şekilde ayarlayın. Bloktaki koryonik villi miktarına bağlı olarak 10 ila 30 kesit kesin. Daha önce olduğu gibi slaytlı bölümleri aldıktan sonra, bölümlerin slaytlara yapışmasını sağlamak için bölümleri içeren slaytları 65 derece lik bir fırına yerleştirin.Slaytları 20 dakika fırında bekletin. Slaytları metin protokolünde tablolu olarak doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin. Zehirli ksilen kokularının dağılabilmesi için slaytları en az üç saat duman kaputunun altına bırakın.Forceps kullanarak, nemlendirilmiş bir kağıt mendil küçük bir kağıt parçası gözyaşı. Hafif stereo mikroskop altında, H & E lekeleri 10 mikron kalınlığında bölümlerden tüm istenmeyen anne dokuları kazımak için forseps ve su nemlendirilmiş kağıt mendil küçük parçalar kullanın. Bu adımIçin anahtar sabır, özellikle zorlu bloklar için.Ayrıca başka birinin hiçbir anne dokuları cevapsız olduğundan emin olmak için bir göz atın olması önemlidir. Şimdi, nemlendirilmiş kağıt mendil yeni bir parça yırtmak ve koryonik villi toplamak için kullanabilirsiniz. Kağıt mendil parçalarını, bağlı koryonik villi ile etiketlenmiş 1,5 ml'lik bir tüpe yerleştirin.Bu adımda kullanılan kağıt mendil miktarını en aza indirin, çünkü DNA çıkarma sütununu çok fazla tıkayabilir ve dolayısıyla toplanan DNA'nın son miktarını azaltabilir. DNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için FFPE kitinden DNA çıkarma protokolünü uygulayın. Laboratuvar spektrofotometresini kullanarak, 1 mikrolitre DNA yükleyin ve ölçüm ölçümü için 216 nm'de absorbans ölçün.1 mikrolitre DNA'yı %2'lik agarose jele yükleyin ve nitel değerlendirme için 80 ila 100 voltluk bir voltajla jel elektroforezini çalıştırın. DNA değerlendirme sonuçlarına göre, multipleks kısa tandem tekrar PCR amplifikasyon kullanılacak DNA hacmini seçin. En az 1000 nanogram DNA kullanmayı hedefleyin.Metin protokolünde açıklandığı gibi PCR amplifikasyonuna, kılcal elektroforeze ve veri analizine devam edin. İdeal FFPE bloğunu seçmek için, koryonik villi'den oluşan dokularının yaklaşık %50-70'ine sahip bir FFPE bloğu seçmek için ışık mikroskobundaki H&E slaytlarını kullanın. Koryonik villi ideal miktarda olmayan bloklar için, kesit yapılır gibi koryonik villi için zenginleştirmek.Bunu yapmak için, yeni kesilmiş bölümlerin hangi tarafında daha koryonik villi içerdiğini ilgili H&E slaytına göre belirleyin. Sonra, koryonik villi için zenginleştirmek için atılması gereken diğer yarısı kesmek için bir bıçak kullanın. Mümkün olan en iyi FFPE bloğunun kesitini gerçekleştirmek için, bir mikrotom kullanarak 50 mikron kalınlığında dört kesin.İdeal bir FFPE bloğu mevcut olmaması durumunda, koryonik villi oranını yine de anne dokusuna kadar korumayı amaçlamaktadır. Örneğin, bloğun sadece %30'u koryonik villi'den oluşuyorsa, geri kalanı anne dokuları varsa, anne dokularını içeren bölümün en az yarısını çıkarın ve telafi etmek için daha fazla kesit kullanın. Bölümleri etiketli 15 mL tüplere yerleştirin.Deparafinizasyon ve rehidrasyon için, her reaktifeklemek ve metin protokolünde tablolu olarak uygun bir süre beklemek için bir duman başlık içinde çalışmak. Sonra, bir Pasteur pipet ile vakum emme ile reaktif çıkarın. Ardından, 15 mL tüplere dört santigrat santikül çözeltisi ekleyin.İki saat boyunca 80 derece su banyosu yerleştirdikten sonra, çözelti oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Vakum emme ile sitrat çözeltisi çıkarın. 1x PBS, girdap altı mililitre ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin.Gerekirse, örnekleri 1000 RPM'de 30 saniye santrifüj edin. 1X PBS'yi vakum emme ile çıkarın. Şimdi önceden ısıtılmış pepsin çözeltisi bir mL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat kuru banyo yerleştirin.Her 10 dakikada bir girdap. Propidium iyodür ribonükleaz Bu kuluçka son 10 dakika içinde bir çözüm hazırlayın. 1x PBS, girdap başka bir altı mL ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin.Yine, vakum emme ile 1x PBS kaldırın. Propidium iyodür ribonükle a çözeltisi 550 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat kuru banyo örnekleri yerleştirin. Akış sitometresi ile kullanmak için polistiren yuvarlak alt tüplerin üst kısmına 48 mikron filtrasyon örgü beş cm beş cm beş cm parça yerleştirmek için forseps kullanın.Sıvıyı kafesten ve tüpe boruyla karıştırarak çözeltiyi filtreleyin. Örnekler akış sitometresi üzerinde çalıştırılmaya hazır. Onlar çalıştırılmak için hazır olana kadar folyo sarılmış tutun.Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi akış sitometrisi ve veri analizi gerçekleştirin. Kısmi hidatidiform köstebeğin mikrouydu genotipleme, hastanın ve eşinin DNA'sı ile birlikte hastanın köstebeğinin triploid dispermik olduğunu ortaya koymaktadır. İlk 1.İlk zirve anneden kaynaklanır, çünkü sadece anne bu büyüklükte bir tepeye sahiptir. Aynı mantıktaki ikinci zirve, aynı alelleri paylaştığı için babadan kaynaklanır. İkinci tepenin ilkinden çok daha yüksek olduğuna dikkat edin, bu da muhtemelen o tepede aynı baba alelinin iki dozolduğunu gösteriyor.Maternal kontaminasyon bu gebe üründe çok azdır çünkü ikinci maternal alel pozisyonunda çok küçük bir tepe gösterir. İkinci işaret, gebe kalma ürününde üç tepe gösterir. Bu zirvelerden ikisi babadan, biri de anneden geliyor.Üçüncü ve dördüncü belirteçler ilk işarete benzer ve babadan gelen iki alel, anneden de bir tane gösterir. Dört belirteç de sürekli olarak babadan, biri anneden kaynaklanan üç alel gösterdiğinden, bu döllenme nin bu ürününün triploid dispermik olduğu sonucuna varılabilir ve kısmi mol tanısını doğrulayabilir. Genotipleme sonuçlarının yorumlanması için, temizleme adımları sırasında alınan notlara göre kontaminasyon seviyesinin farkında olmak önemlidir.Bazı durumlarda, bu iki yöntemden sonra bir sonuca varamıyoruz. Bu gibi durumlarda, gerçek genotipleri ortaya çıkarmak için FISH gibi diğer yöntemleri kullanırız. Mikrouydu genotipleme doğru molar tanısı için izin verdi ve daha iyi hydatidiform benlerin çeşitli özellikleri ile ilişkili genotipler anlamak için yol açtı.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Sıvı Kromatografi / Kütle Spektrometresi zehirlidir pufferfish Geliştirilmiş Polimeraz Zincir Reaksiyonu-kısıtlama Parça Uzunluk Polimorfizmi Genotiplemesi

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...