Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة مؤسسة ليو وآن ألبرت الخيرية ومؤسسة JM. نشكر جامعة كاليفورنيا سان دييغو مورز أعضاء مركز السرطان، والدكتور جينغ يانغ والدكتور كاي ت. يونغ للسماح لنا باستخدام الميكروتومي وراندال الفرنسية، قسم الجراحة للخبرة التقنية.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا ً للتوصيات الواردة في دليل مجلس المراجعة المؤسسية التابع لجامعة كاليفورنيا في سان دييغو. تم الحصول على موافقة #090401 IRB من مجلس المراجعة المؤسسية UCSD (IRB) لجمع العينات الجراحية من المرضى لأغراض البحث. تم الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض وتم الحصول على عينة جراحية ...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

لا تزال الأجهزة ثلاثية الأبعاد المشتقة من خلايا سرطان البروستاتا الانبثاث العظمي للمريض نادرة نسبيًا. هنا ، ونحن نصف الاستراتيجيات والبروتوكول الأمثل كذلك إلى إنشاء بنجاح المسلسل 3D المريض المشتقة organoids (PDOs) من BMPC. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف البروتوكولات لتأمين الأورجادات في عينات ذات كثا...

وقد لفتت organoids ثلاثية الأبعاد المستزرعة الانتباه لقدرتها على تلخيص العمارة في الجسم الحي ، والوظائف الخلوية والتوقيع الجيني للأنسجة الأصلية1،2،3،4،5. الأهم من ذلك ، organoids 3D المنشأة من أنسجة الورم المريض أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج توفر فرصا لا تقدر بثمن لفهم آليات الإشارات الخلوية على تكوين الورم وتحديد آثار العلاج الدوائي على كل خلية من السكان6،7،8،9،10،11،12،13. وضعت Drost وآخرون5 بروتوكولًا قياسيًا لإنشاء أجهزة البروستاتا البشرية والفأرة ، والتي تم اعتمادها على نطاق واسع في مجال المسالك البولية. وبالإضافة إلى ذلك، تم تكريس جهد كبير لمزيد من توصيف الأجهزة 3D وفهم آليات مفصلة من الورم والانبثاث4،12،14،15. بالإضافة إلى البروتوكول الذي تم إنشاؤه مسبقًا والمقبول على نطاق واسع لثقافات الأجهزة ثلاثية الأبعاد ، فإننا نصف هنا بروتوكولًا خطوة بخطوة لثقافة 3D من PDO باستخدام ثلاث طرق مختلفة للقباب في ظروف الثقافة المثلى.
في هذه المخطوطة، تم تأسيس الأرغن ثلاثية الأبعاد كنموذج جديد لسرطان البروستاتا النقيلي العظمي (BMPC). جاءت الخلايا المستخدمة لهذه الثقافات من سلسلة سرطان البروستاتا سان دييغو (PCSD) واستمدت مباشرة من سرطان البروستاتا المريض أنسجة الورم النقيلي العظام (PCSD18 و PCSD22) أو المريض المستمدة xenograft (PDX) نماذج الورم (عينات تسمى PCSD1، PCSD13، و PCSD17). لأن الانبثاث العظام التلقائي ة من خلايا سرطان البروستاتا أمر نادر الحدوث في نماذج الماوس المعدلة وراثيا16، استخدمنا مباشرة داخل الفخذ (IF) حقن خلايا الورم البشري في Rag2 الذكور-/-οc-/- الفئران لإنشاء نماذج PDX من سرطان البروستاتا النقيلي العظام17.
مرة واحدة يتم إنشاء organoids 3D من الخلايا السرطانية المريض غير متجانسة أو xenografts المريض المستمدة، فمن الضروري لتأكيد هويتهم كخلايا ورم البروستاتا وتحديد الأنماط الظاهرية في الثقافات الاعضاء 3D. تسمح كيمياء الفلورة المناعية (IFC) بتصور التعبير البروتيني في الموقع في كل خلية ، مما يشير في كثير من الأحيان إلى الوظائف المحتملة لتجمعات خلايا محددة2،4. بشكل عام، بروتوكولات مؤسسة التمويل الدولية للغالبية العظمى من العينات بما في ذلك الأنسجة والخلايا واضحة والأمثل تماما. ومع ذلك ، يمكن أن تكون كثافة الخلايا وعدد الاعضاء أقل بكثير من الثقافة التقليدية. ولذلك، فإن بروتوكول مؤسسة التمويل الدولية للأعضاء يتطلب خطوات إضافية لضمان المعالجة السليمة والتضمين في البارافين لجميع الأرغن في العينات. نحن نصف خطوات إضافية لعملية تضمين أغاروز المسبقة ونصائح لتسمية موقع الأجزاء الاعضاء على الشريحة التي تزيد من معدل نجاح مؤسسة التمويل الدولية على organoids خاصة عندما تكون عينات من organoids كثافة خلايا أقل من المطلوب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة organoids من عينات الورم من المرضى الإنسان ونماذج xenograft (PDX) المستمدة من المريض من سرطان البروستاتا ، ويشار إلى organoids المستمدة من المريض (PDO) ، هي مورد لا يقدر بثمن لدراسة آلية ورم ورم وورم سرطان البروستاتا. ميزتها الرئيسية هي أنها تحافظ على التغايرية الجينومية والوظيفية المميزة للأنسجة الأصلية مقارنة بخطوط الخلايا التقليدية التي لا تفعل ذلك. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لـ PDO للتنبؤ بآثار العلاج الدوائي على المرضى الأفراد وهي خطوة نحو الطب الشخصي. على الرغم من هذه المزايا، عدد قليل من المجموعات بشكل روتيني استخدام هذا الأسلوب في جزء منه بسبب التحسين واسعة النطاق من الظروف ثقافة PDO التي قد تكون مطلوبة لعينات المرضى المختلفة. لقد أثبتنا سابقًا أن نموذج PDX لسرطان البروستاتا هو نموذج PDX ، PCSD1 ، لخص مقاومة الانبثاث العظمي للمريض المتبرع للعلاج المضاد للاندروجين. استخدمنا PCSD1 3D organoids لتوصيف المزيد من آليات مقاومة مضادة للاندروجين. بعد نظرة عامة على الدراسات المنشورة حاليًا لنماذج PDX و PDO ، نصف بروتوكولًا تدريجيًا لثقافة ثلاثية الأبعاد لـ PDO باستخدام أغشية الطابق السفلي المقببة أو العائمة (على سبيل المثال ، Matrigel) في ظروف الثقافة المحسنة. في التصوير غرزة الجسم الحي ومعالجة الخلايا لعلم الأنسجة كما وصفت. ويمكن تحسين هذا البروتوكول كذلك لتطبيقات أخرى بما في ذلك لطخة الغربية، والثقافة المشتركة، وما إلى ذلك، ويمكن استخدامها لاستكشاف خصائص PDO مثقف 3D المتعلقة مقاومة الدواء، والورم، والانبثاث والعلاجات.

تم إنشاء organoids 3D بنجاح من نموذج xenograft (PDX) من نموذج التهاب البروستاتا النقيلي (BMPC) المريض والعظام النقيلية سرطان السرطان(الشكل 4). باختصار، تم إنشاء نماذج PDX لدينا من BMPC عن طريق حقن داخل الفخذ (IF) من الخلايا السرطانية في ذكر Rag2-/- ج-/- الفئران ثم تم حصاد الأورام PDX ومعال?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

الثقافات ثلاثية الأبعاد من عينات BMPC المريض وxenografts من سرطان البروستاتا النقيلي العظام الحفاظ على التغايرية الوظيفية للأورام الأصلية مما أدى إلى الخراجات، وspheroids ومعقدة، مثل الورم organoids. توفر هذه المخطوطة استراتيجية وبروتوكولًا أمثل للثقافة ثلاثية الأبعاد للعينات المشتقة من المرضى غير المتجانسة وتحليلها باستخدام مؤسسة التمويل الدولية.

إنشاء وتحليل الأرغن ثلاثيالأبعاد (3D) المستمدة من عينات الانبثاث العظام سرطان البروستاتا المريض وXenografts بهم

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

نحن وصف الاستراتيجيات وبروتوكولات خطوة بخطوة لإنشاء المسلسل 3D المريض المشتقة من الجهازية من سرطان البروستاتا النقيلي العظام. بروتوكولاتنا الأمثل هي عملية لإعداد الثقافات 3D للتجارب باستخدام مواد البداية محدودة مباشرة من المرضى أو أنسجة الورم xenograft المستمدة من المريض. يمكن استخدام الأعضاء ثلاثية الأبعاد من هذا البروتوكول كنماذج vivo السابق لفهم الآليات الأساسية لمرض سرطان البروستاتا النقيلي العظام واختبار العلاج.وسائل الإعلام ثقافة الجهازية 3D في هذا البروتوكول هو محدد للخلايا المشتقة من البروستاتا. يمكن تطبيق أجزاء أخرى من بروتوكولاتنا على أنواع مختلفة من أنسجة الأورام ومواقع النقيلي. قد يثبت تقنية doming أن يكون الجزء الصعب في هذه العملية.وسوف ممارسة تقنية doming ضمان حجم ثابت من خليط مقبب من organoids, وسائل الإعلام, وماتريجل, وتقليل تشكيل فقاعة أثناء تعليق عينة. بصريا مما يدل على هذه الطريقة يوفر فهم أفضل لكيفية التعامل مع Matrigel لزجة لاستزراع organoids أقل كثافة بنجاح من عدد منخفض من الخلايا. تبدأ من قبل resuspending بيليه الخلية في حجم مناسب من غشاء الطابق السفلي لإعداد لوحة 24-well.الماصات صعودا وهبوطا بلطف لضمان أن الخلايا هي resuspended، ثم ماصة الحجم المناسب من تعليق الخلية في وسط لوحة ثقافة الأنسجة قبل الدافئة. عكس لوحة ووضعها رأسا على عقب على الفور في حاضنة ثقافة الخلية تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. Pipette الحجم المناسب من المتوسطة قبل الدافئة التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ديهيدروكورايد في كل بئر.لتشكيل قبة عائمة من القبة المستديرة المرفقة، افصل القبة عن اللوحة باستخدام مكشطة خلية. قطع اثنين في أربعة بوصة قطعة من فيلم البارافين ووضعها على رأس divots من طرف فارغ عقد رف من مربع طرف ماصات بلاستيكية ملليلتر واحد. استخدام إصبع السبابة قفاز للضغط بلطف إلى أسفل على فيلم البارافين لتتبع divots مع الحرص على عدم اختراق الفيلم.رش فيلم البارافين مع 70٪ الإيثانول وتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية في خلية هود الثقافة لتعقيم الفيلم المعد لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه، resuspend الخلايا المعالجة مسبقا في 20 ميكرولترات من غشاء الطابق السفلي. ثم الماصات تعليق في divots شكلت في فيلم البارافين.وضع حبات وparffin الفيلم في لوحة ستة بئر والماصات من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المتوسطة قبل الدافئة التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ديهيدروكلوريد في كل بئر في حين بالفرشاة بلطف الخرز قبالة من فيلم البارافين. لمعالجة العضيات لعلم الأنسجة، وإزالة الوسائط الموجودة من البئر مع الحرص على عدم التبخر القباب غشاء الطابق السفلي. إضافة وحدة تخزين متساوية من حل استرداد الخلايا واحتضان لوحة لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية.بعد الحضانة، ازاحة قبة غشاء الطابق السفلي باستخدام ماصة وسحقه مع طرف ماصة. جمع القبة المنفصلة وحل استعادة الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إزالة فائقة ووضعها جانبا.حفظ جميع supernatants حتى الخطوة النهائية عندما يتم تأكيد وجود organoids في الحجم المطلوب من برنامج تلفزيوني الباردة والماصات بلطف صعودا وهبوطا إلى طرد ميكانيكيا بيليه دون تعطيل organoids. كرر الطرد المركزي وإزالة ازاحة. إصلاح بيليه في حجم مطابقة من 4٪ PFA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت، كرر خطوة الطرد المركزي وغسل برنامج تلفزيوني. ثم إضافة ببطء 200 ميكرولترات من دافئة 2٪ agarose وعلى الفور ولكن بلطف فصل بيليه الخلية من جدار الأنبوب دون تعطيله باستخدام إبرة قياس 25 تعلق على حقنة ملليلتر واحد. لطريقة أغاروز تدور أسفل, فمن الأهمية بمكان لفصل بيليه الخلية من جدار الأنبوب الحق بعد إضافة agarose باستخدام إبرة قياس 25.بمجرد أن تتوطد agarose تماما، وفصله عن الأنبوب مع إبرة قياس 25 تعلق على حقنة ملليلتر واحد ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. ملء أنبوب مع 70٪ الإيثانول والمضي قدما في البروتوكول التقليدي لجفاف الأنسجة والparffin تضمين. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإنشاء 3D organoids من نماذج xenograft المستمدة من المريض من سرطان البروستاتا النقيلي العظام وكذلك مباشرة من أنسجة السرطان.عرضت الأعضاء أنماطًا ظاهرية مختلفة تتجلى كخراجات وبشريات وعضويات عالية التعقيد. يمكن رؤية قبة كاملة من غشاء الطابق السفلي و organoids في صورة مخيط من 25 عالية الدقة، 10X صور التكبير. لمزيد من التحقيق في أنسجة الورم، تم إجراء الكيمياء الخلوية المناعية على خمسة ميكرومتر سميكة البارافين مقطع من organoids تستهدف علامة الخلايا الظهارية القاعدية cytokeratin-5، اللمعان الظهارية الخلية علامة cytokeratin-8 وDAPI.يمكن تحسين هذا البروتوكول لتطبيقات أخرى مثل النشاف الغربي ، والثقافة المشتركة والتدفق الجُلّي لاستكشاف خصائص الأعضاء ثلاثية الأبعاد وآثار العلاجات الدوائية. ويمكن لهذه التجارب أن تعالج آليات مقاومة الأدوية وفعالية العلاجات الجديدة وحدها أو بالاشتراك مع العلاجات الحالية. organoids 3D من هذه التقنية الاحتفاظ بين المواضيع وداخل الموضوع التجانس وبالتالي هي نموذج أكثر دقة من المرض في المرضى.هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف آليات مقاومة الأدوية، ورمريجنيسيس، الانبثاث والعلاجات التي قد تكون أكثر قابلية للتنبؤ تطور المرض في المرضى واستجابتهم للعلاج.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...