Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Leo og Anne Albert Charitable Foundation og JM Foundation. Vi takker University of California San Diego Moores Cancer Center medlemmer, Dr. Jing Yang og Dr. Kay T. Yeung for at give os mulighed for brug af deres microtome og Randall fransk, Department of Surgery for teknisk ekspertise.

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledningen for University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Godkendelse blev modtaget fra UCSD Institutional Review Board (IRB) til at indsamle kirurgiske prøve fra patienter til forskningsformål. Der blev indhentet et informeret samtykke fra hver patient, og en kirurgisk knogleprostatakræft metastase prøve blev opnået fra ortopædisk reparation af en patologisk fraktur i lårbenet. Dyreprotoko...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

3D organoider stammer fra patienten knogle metastase prostatakræft celler er stadig relativt sjældne. Her beskriver vi strategier og yderligere optimeret protokol til succes etableret seriel 3D patient afledt organoider (PDA'er) af BMPC. Desuden beskrives protokoller for at sikre organoiderne i prøver med lavere celletæthed for IFC- og IHC-analyse. Differentialfænotyper i form af cyste, sfænoider og mere komplekse organoider viser, at denne protokol giver kulturbetingelser, der giver mulighed for heterogonous tumor...

Tre-dimensionelle kulturformede organoider har henledt opmærksomheden på deres potentiale til at opsummere in vivo arkitektur, cellulære funktionalitet og genetiske signatur af deres oprindelige væv1,2,3,4,5. Vigtigst er det, 3D organoider etableret fra patient tumor væv eller patient afledt xenograft (PDX) modeller giver uvurderlige muligheder for at forstå mekanismer af cellulære signalering ved tumorigenese og til at bestemme virkningerne af narkotikabehandling på hver celle population6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 udviklet en standard protokol for etablering af menneskelige og mus prostata organoider, som er blevet bredt vedtaget inden for urologi. Desuden har en betydelig indsats været dedikeret til yderligere karakterisering af 3D organoids og til at forstå de detaljerede mekanismer tumorigenese og metastase4,12,14,15. Ud over den tidligere etablerede og bredt accepterede protokol for 3D organoids kulturer, beskriver vi her en trin-for-trin protokol for 3D-kulturen i BOB ved hjælp af tre forskellige doming metoder i optimerede kulturforhold.
I dette manuskript blev 3D organoider etableret som en ex vivo model af knogle metastatisk prostatakræft (BMPC). De celler, der anvendes til disse kulturer kom fra Prostata Cancer San Diego (PCSD) serien og blev afledt direkte fra patienten prostatakræft knogle metastatisk tumorvæv (PCSD18 og PCSD22) eller patient afledt xenograft (PDX) tumor modeller (prøver ved navn PCSD1, PCSD13, og PCSD17). Da spontan knoglemetastase af prostatakræftceller er sjælden i gensplejsede musemodeller16,brugte vi direkte intrafemoral (IF) injektion af humane tumorceller i mandlige Rag2-/-γc-/- mus til at etablere PDX-modeller af knoglemetastatisk prostatakræft17.
Når 3D organoids er etableret fra heterogene patient tumorceller eller patient afledte xenografts, Det er vigtigt at bekræfte deres identitet som prostata tumorceller og til at bestemme deres fænotyper i 3D organoid kulturer. Immunfluorescenskemi (IFC) gør det muligt at visualisering af proteinekspression på stedet i hver celle, hvilket ofte angiver de potentielle funktioner for specifikke cellepopulationer2,4. Generelt er IFC protokoller for et stort flertal af prøver, herunder væv og celler ligetil og fuldt optimeret. Men celletætheden og antallet af organoider kan være betydeligt lavere end den konventionelle kultur. Ifc-protokollen for organoider kræver derfor yderligere skridt til at sikre korrekt behandling og integrering i paraffin for alle organoider i prøverne. Vi beskriver yderligere trin for en agarose pre-indlejring proces og tips til at mærke placeringen af afgrænsede organoider på diaset, der øger succesraten for IFC på organoider, især når prøverne af organoider har lavere celletæthed end ønsket.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

Tredimensional (3D) kultur af organoider fra tumorprøver af humane patienter og patient-afledt xenograft (PDX) modeller af prostatakræft, benævnt patient-afledte organoider (BOB), er en uvurderlig ressource for at studere tumorigenese og metastase af prostatakræft. Deres største fordel er, at de opretholder den karakteristiske genomiske og funktionelle heterogenitet af det oprindelige væv i forhold til konventionelle cellelinjer, der ikke gør. Desuden kan 3D-kulturer af BOB bruges til at forudsige virkningerne af narkotikabehandling på de enkelte patienter og er et skridt i retning af personlig medicin. På trods af disse fordele, få grupper rutinemæssigt bruge denne metode til dels på grund af den omfattende optimering af BOB kulturbetingelser, der kan være nødvendige for forskellige patientprøver. Vi har tidligere vist, at vores prostatakræft knogle metastase PDX model, PCSD1, opsummerede modstanden af donor patientens knogle metastase til anti-androgen terapi. Vi brugte PCSD1 3D organoids til yderligere at karakterisere mekanismerne i anti-androgen modstand. Efter en oversigt over aktuelt offentliggjorte undersøgelser af PDX- og BOB-modeller beskriver vi en trinvis protokol for 3D-kultur af BOB ved hjælp af kuppelformede eller flydende kældermembraner (f.eks. matrigel) i optimerede kulturforhold. In vivo sting billeddannelse og celle behandling for histologi er også beskrevet. Denne protokol kan yderligere optimeres til andre applikationer, herunder vestlige blot, co-kultur, etc. og kan bruges til at udforske karakteristika 3D kulturfremstillede BOB vedrørende resistens, tumorigenese, metastase og terapeutiske.

3D organoids blev med succes etableret fra en patient afledt xenograft (PDX) model af knoglemetastatisk prostatakræft (BMPC) samt direkte fra patient knogle metastatisk prostatakræft væv (Figur 4). Kort, vores PDX modeller af BMPC blev etableret ved intra-femoral (IF) injektion af tumorceller i mandlige Rag2-/- c-/- mus og derefter PDX tumorer blev høstet og behandlet som beskrevet i dette manuskript. Som vist i figur 4resulterede PDX t...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Tre-dimensionelle kulturer af patientenBMPC prøver og xenografts af knogle metastatisk prostatakræft opretholde den funktionelle heterogenitet af deres oprindelige tumorer resulterer i cyster, sfænoider og komplekse, tumor-lignende organoider. Dette manuskript giver en optimeringsstrategi og protokol for 3D-kultur af heterogene patientafledte prøver og deres analyse ved hjælp af IFC.

Etablering og analyse af tredimensionale (3D) organoider afledt af patient prostatakræft Bone Metastase prøver og deres Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Vi beskriver strategier og trin-for-trin protokoller til at etablere serielle 3D patient-afledte organoider af knogle metastatisk prostatakræft. Vores optimerede protokoller er praktiske til at oprette 3D-kulturer til eksperimenter ved hjælp af begrænset udgangsmateriale direkte fra patienter eller patient-afledte xenograft tumorvæv. 3D-organoiderne fra denne protokol kan bruges som ex vivo-modeller til at forstå de grundlæggende mekanismer i knoglemetastiktisk prostatakræftpatologi og til at teste behandlingen.3D organoid kultur medierne i denne protokol er specifikke for prostata-afledte celler. Andre dele af vores protokoller gælder for forskellige typer af tumorvæv og metastatiske websteder. Den doming teknik kan vise sig at være den sværeste del af denne proces.Øve doming teknik vil sikre en ensartet størrelse af den kuppelformede blanding af organoider, medier og Matrigel, og minimere bobledannelse under prøve suspension. Visuelt demonstrere denne metode giver en bedre forståelse af, hvordan man håndterer tyktflydende Matrigel for held dyrke lavere tæthed organoids fra et lavt antal celler. Start med at resuspending cellen pellet i passende volumen af kælderen membran til en 24-brønd plade setup.Pipette op og ned forsigtigt for at sikre, at cellerne er resuspended, derefter pipette den passende volumen af celle suspension i midten af en forvarperet væv kultur plade. Inverter pladen og læg den straks på hovedet i cellekulturinkubatoren indstillet til 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 15 minutter. Pipette den passende mængde forvarmt medium indeholdende 10 mikromolar Y-27632 dihydrochlorid i hver brønd.For at danne en flydende kuppel fra den vedlagte runde kuppel, løsrive kuplen fra pladen ved hjælp af en celleskraber. Skær en to af fire tommer stykke paraffin film og placere den på toppen af divots af en tom spids bedrift rack fra en en milliliter plast pipette tip boks. Brug en behandsket pegefinger til forsigtigt at trykke ned på paraffinfilmen for at spore divotsen og passe på ikke at bryde gennem filmen.Spray paraffinfilmen med 70% ethanol og tænd for UV-lampen i cellekulturhætten for at sterilisere den forberedte film i mindst 30 minutter. I mellemtiden, resuspend de forarbejdede celler i 20 mikroliter af kældermembran. Derefter pipette suspensionen i divots dannet i paraffin filmen.Placer størknede perler og paraffinfilm i en seks-brønd plade og pipette tre til fem milliliter forvarmt medium indeholdende 10 mikromolar Y-27632 dihydrochlorid i hver brønd, mens forsigtigt børste perler ud af paraffin filmen. For at behandle organoids for histologi, fjerne eksisterende medier fra brønden passe på ikke at aspirere kælderen membran kupler. Tilsæt et tilsvarende volumen af cellegendannelsesopløsning og inkuber pladen i 60 minutter ved fire grader Celsius.Efter inkubationen, løsne kælderen membran kuppel ved hjælp af en pipette og knuse det med en pipette spids. Opsaml den dissocierede kuppel og cellegenvindingsopløsningen i et 1,5 milliliterrør. Centrifuge røret ved 300 gange g i fire grader Celsius i fem minutter, derefter fjerne supernatant og sæt den til side.Gem alle supernatanterne indtil det sidste trin, når tilstedeværelsen af organoider bekræftes ved den ønskede mængde kold PBS og forsigtigt pipette op og ned til mekanisk løsne pellet uden at forstyrre organoids. Gentag centrifugering og fjern supernatanten. Fastgør pellet i et matchende volumen på 4% PFA i 60 minutter ved stuetemperatur.Efter fikseringen gentages centrifugeringstrinnet og PBS-vask. Derefter langsomt tilføje 200 mikroliter af varm 2% agarose og straks, men forsigtigt løsrive celle pellet fra røret væggen uden at forstyrre det ved hjælp af en 25 gauge nål fastgjort til en milliliter sprøjte. For agarose spin down-metoden er det afgørende at løsne cellepellet fra rørets væg lige efter tilsætning af agarose ved hjælp af en 25 gauge nål.Når agarose er helt størknet, løsrive det fra røret med en 25 gauge nål fastgjort til en en milliliter sprøjte og overføre det til en ny 1,5 milliliter rør. Fyld røret med 70% ethanol og fortsæt med den konventionelle protokol for vævsdehydrering og paraffinindlejring. Denne protokol blev med succes brugt til at etablere 3D organoids fra patient-afledte xenograft modeller af knogle metastatisk prostatakræft samt direkte fra kræftvæv.De organoider viste forskellige fænotyper, der manifesterede sig som cyster, sfæroider, og højere kompleksitet organoider. En hel kuppel af kældermembran og organoider kan ses i et syet billede fra 25 billeder i høj opløsning, 10X forstørrelse. For yderligere at undersøge tumorvævet blev immunfluorescerende cytokemi udført på en fem mikrometer tyk paraffindel af organoider rettet mod de basale epitelcellemarkør cytokeratin-5, luminal epitelcellemarkør cytokeratin-8 og DAPI.Denne protokol kan optimeres til andre applikationer såsom vestlige blotting, co-kultur og flow cytometri at udforske karakteristika 3D organoids og virkningerne af narkotika behandlinger. Disse forsøg kunne omhandle mekanismer af resistens over for lægemidler og effekten af nye terapeutiske alene eller i kombination med de nuværende behandlinger. 3D-organoiderne fra denne teknik bevarer den 4- subjektive og intra-motiverede heterogenitet og er derfor en mere nøjagtig model af sygdommen hos patienter.Denne teknik baner vejen for forskere at udforske mekanismer af resistens over for lægemidler, tumorigenesis, metastase og terapi, der kan være mere forudsigelig af sygdommensprogression hos patienter og deres reaktion på behandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

etablering og anvendelse af patientafledte xenograftmodeller af centralnervesystemets metastaser

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer patientafledte organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...