Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Leo en Anne Albert Charitable Foundation en JM Foundation. Wij danken de Universiteit van Californië San Diego Moores Cancer Center leden, Dr Jing Yang en Dr Kay T. Yeung voor het toestaan van ons het gebruik van hun microtoom en Randall Frans, Department of Surgery voor technische expertise.

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Universiteit van Californië San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Goedkeuring werd ontvangen van de UCSD Institutional Review Board (IRB) om chirurgische specimens te verzamelen van patiënten voor onderzoeksdoeleinden. Een geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt en een chirurgische bot prostaatkanker metastase specimen werd verkregen uit orthopedischherstel van een pathologische fr...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

3D-organoïden afkomstig van patiënt botmetastase prostaatkankercellen zijn nog relatief zeldzaam. Hier beschrijven we strategieën en verder geoptimaliseerd protocol om met succes gevestigde seriële 3D-patiënt afgeleide organoïden (PDOs) van BMPC. Daarnaast worden protocollen beschreven om de organoïden te beveiligen in monsters met een lagere celdichtheid voor IFC- en IHC-analyse. Differentiële fenotypes in de vorm van cyste, sferoïden en complexere organoïden geven aan dat dit protocol kweekcondities biedt die...

Driedimensionale gekweekte organoïden hebben de aandacht gevestigd op hun potentieel om de in vivo architectuur, cellulaire functionaliteit en genetische signatuur van hun oorspronkelijke weefsels1,2,3,4,5, te recapituleren. Het belangrijkste is dat 3D-organoïden die zijn vastgesteld uit tumorweefsels van patiënten tumoren of door de patiënt afgeleide xenograft (PDX)-modellen onschatbare mogelijkheden bieden om mechanismen van cellulaire signalering bij tumorigenese te begrijpen en de effecten van medicamenteuze behandeling op elke celpopulatie te bepalen6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 ontwikkelden een standaardprotocol voor de oprichting van menselijke en muizenprostaatorganoïden, dat op grote schaal is aangenomen op het gebied van urologie. Daarnaast is aanzienlijke inspanning besteed aan verdere karakterisering van 3D-organoïden en om de gedetailleerde mechanismen van tumorigenese en metastasetebegrijpen 4,12,14,15. Naast het eerder vastgestelde en algemeen aanvaarde protocol voor 3D-organoïdenculturen, beschrijven we hier een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van bobdo met behulp van drie verschillende domingmethoden in geoptimaliseerde cultuuromstandigheden.
In dit manuscript werden 3D-organoïden opgericht als een ex vivo model van botgemetastase prostaatkanker (BMPC). De cellen die voor deze culturen worden gebruikt, kwamen uit de Prostate Cancer San Diego (PCSD) serie en werden rechtstreeks afgeleid van botuitgezaaide tumorweefsels van patiënten (PCSD18 en PCSD22) of tumormodellen van patiënt afgeleide xenograft (PDX) (monsters genaamd PCSD1, PCSD13 en PCSD17). Omdat spontane botmetastase van prostaatkankercellen zeldzaam is in genetisch gemanipuleerde muismodellen16, gebruikten we directe intra-femorale (IF) injectie van menselijke tumorcellen in mannelijke Rag2-/-γc-/- muizen om de PDX-modellen van botgemetastase prostaatkanker vast te stellen17.
Zodra 3D-organoïden zijn gevestigd uit heterogene tumorcellen van patiënten of door de patiënt afgeleide xenografts, is het essentieel om hun identiteit als prostaattumorcellen te bevestigen en hun fenotypes in de 3D-organoïde culturen te bepalen. Immunofluorescentiechemie (IFC) maakt de visualisatie van eiwitexpressie in situ in elke cel mogelijk, waarbij vaak de potentiële functies voor specifieke celpopulaties2,4worden aangegeven. In het algemeen zijn IFC-protocollen voor een overgrote meerderheid van de monsters, waaronder weefsels en cellen, eenvoudig en volledig geoptimaliseerd. De celdichtheid en het aantal organoïden kunnen echter aanzienlijk lager zijn dan die van de conventionele cultuur. Daarom vereist het IFC-protocol voor organoïden extra stappen om te zorgen voor een goede verwerking en inbedding in paraffine voor alle organoïden in de monsters. We beschrijven extra stappen voor een agarose pre-inbedding proces en tips om de locatie van gesectioneerde organoïden label op de dia die het slagingspercentage van IFC op organoïden verhoogt vooral wanneer de monsters van organoïden hebben een lagere celdichtheid dan gewenst.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

Driedimensionale (3D) cultuur van organoïden uit tumorspecimens van menselijke patiënten en door patiënten afgeleide xenograft (PDX) modellen van prostaatkanker, aangeduid als patiënt-afgeleide organoïden (BOB), zijn een onschatbare bron voor het bestuderen van het mechanisme van tumorigenese en metastase van prostaatkanker. Hun belangrijkste voordeel is dat ze de kenmerkende genomische en functionele heterogeniteit van het oorspronkelijke weefsel behouden in vergelijking met conventionele cellijnen die dat niet doen. Bovendien kunnen 3D-culturen van BOB worden gebruikt om de effecten van medicamenteuze behandeling op individuele patiënten te voorspellen en zijn een stap in de richting van gepersonaliseerde geneeskunde. Ondanks deze voordelen, weinig groepen routinematig gebruik maken van deze methode voor een deel vanwege de uitgebreide optimalisatie van BOB cultuur voorwaarden die nodig kunnen zijn voor verschillende patiënt monsters. We hebben eerder aangetoond dat ons BOT-metastase PDX-model voor prostaatkanker, PCSD1, de resistentie van de botmetastase van de donorpatiënt tegen anti-androgeentherapie recapituleerde. We gebruikten PCSD1 3D-organoïden om de mechanismen van anti-androgeenweerstand verder te karakteriseren. Naar aanleiding van een overzicht van de momenteel gepubliceerde studies van PDX- en BOB-modellen beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de 3D-cultuur van BOB met behulp van koepelvormige of zwevende keldermembraan (bijvoorbeeld Matrigel) bollen in geoptimaliseerde kweekomstandigheden. In vivo worden ook steekbeeldvorming en celverwerking voor histologie beschreven. Dit protocol kan verder worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen, waaronder westerse vlek, co-cultuur, enz.

3D-organoïden werden met succes vastgesteld van een patiënt afgeleid xenograft (PDX) model van botgemetastaseerde prostaatkanker (BMPC) evenals rechtstreeks uit de patiënt botuitgezaaide prostaatkanker weefsel(figuur 4). Kortom, onze PDX-modellen van BMPC werden vastgesteld door intra-femur (IF) injectie van tumorcellen in mannelijke Rag2-/- c-/- muizen en vervolgens PDX tumoren werden geoogst en verwerkt zoals beschreven in dit manuscript. Zoals blijkt uit <strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Driedimensionale culturen van patiënt BMPC-specimens en xenografts van botgemetastaseerde prostaatkanker behouden de functionele heterogeniteit van hun oorspronkelijke tumoren, wat resulteert in cysten, sferoïden en complexe, tumorachtige organoïden. Dit manuscript biedt een optimalisatiestrategie en protocol voor de 3D-cultuur van heterogene patiëntafgeleide monsters en hun analyse met behulp van IFC.

Oprichting en analyse van driedimensionale (3D) organoïden afgeleid van patiënt prostaatkanker Bot metastase Specimens en hun Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

We beschrijven strategieën en stapsgewijze protocollen om serieel 3D-patiënt-afgeleide organoïden van botuitzaaiende prostaatkanker vast te stellen. Onze geoptimaliseerde protocollen zijn praktisch om 3D-culturen op te zetten voor experimenten met beperkt uitgangsmateriaal rechtstreeks van patiënten of door patiënten afgeleide xenografttumorweefsels. De 3D-organoïden uit dit protocol kunnen worden gebruikt als ex vivo-modellen om basismechanismen van botuitzaaiingen van prostaatkanker te begrijpen en de behandeling te testen.De 3D organoïde cultuurmedia in dit protocol zijn specifiek voor prostaatcellen. Andere delen van onze protocollen zijn van toepassing op verschillende soorten tumorweefsels en gemetastaseerte. De doming techniek kan blijken te zijn het moeilijkste deel van dit proces.Het beoefenen van de doming techniek zal zorgen voor een consistente grootte van de koepelvormige mengsel van organoïden, media, en Matrigel, en minimaliseren bubble vorming tijdens de steekproef schorsing. Visueel aantonen van deze methode biedt een beter begrip van hoe om te gaan met de viskeuze Matrigel voor het succesvol kweken van lagere dichtheid organoïden uit een laag aantal cellen. Begin met het opnieuw inrichten van de celpellet in het juiste volume van het keldermembraan voor een 24-put plaat setup.Pipet op en neer voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen opnieuw worden opgetrokken, dan pipette het juiste volume van de cel suspensie in het midden van een voorverwarmde weefsel cultuurplaat. Omkeren van de plaat en onmiddellijk ondersteboven in de cel cultuur incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 15 minuten. Pipette het juiste volume van voorverwarmd medium met 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride in elke put.Als u een drijvende koepel wilt vormen van de bijgevoegde ronde koepel, maakt u de koepel los van de plaat met behulp van een celschraper. Snijd een twee bij vier centimeter stuk paraffine film en plaats het op de top van de divots van een lege tip holding rek van een een milliliter plastic pipette tip box. Gebruik een gehandschoende wijsvinger om zachtjes op de paraffinefilm te drukken om de divots te traceren die ervoor zorgen dat ze niet door de film breken.Spuit de paraffinefilm met 70% ethanol en zet de UV-lamp in de celkweekkap aan om de voorbereide film minstens 30 minuten te steriliseren. Ondertussen, resuspend de voorbewerkte cellen in 20 microliter van kelder membraan. Dan pipette de suspensie in de divots gevormd in de paraffine film.Plaats de gestolde kralen en paraffine film in een zes-put plaat en pipet drie tot vijf milliliter van voorverwarmd medium met 10 micromolar Y-27632 dihydrochloride in elke put, terwijl zachtjes borstelen kralen uit van de paraffine film. Om de organoïden voor histologie te verwerken, verwijder bestaande media uit de put die ervoor zorgen dat de koepels van het keldermembraan niet worden aangezogen. Voeg een gelijk volume van de cel herstel oplossing en incubeer de plaat gedurende 60 minuten op vier graden Celsius.Na de incubatie verjagen, verjagen de kelder membraan koepel met behulp van een pipet en plet het met een pipet tip. Verzamel de gescheiden koepel en de celterugwinningsoplossing in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeren de buis op 300 keer g in vier graden Celsius gedurende vijf minuten, verwijder dan de supernatant en zet het opzij.Bewaar alle supernatants tot de laatste stap wanneer de aanwezigheid van organoïden wordt bevestigd op het gewenste volume van koude PBS en zachtjes pipette op en neer om de pellet mechanisch los te maken zonder de organoïden te verstoren. Herhaal de centrifugatie en verwijder de supernatant. Bevestig de pellet in een afgestemd volume van 4%PFA gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.Herhaal na fixatie de centrifugatiestap en PBS-was. Voeg dan langzaam 200 microliters van warme 2%agarose toe en onmiddellijk maar onmiddellijk de celkorrel van de buismuur los zonder het te verstoren gebruikend een 25 maatnaald die aan een één milliliter spuit wordt vastgemaakt. Voor de agarose spin down methode, is het van cruciaal belang om de cel pellet los te maken van de wand van de buis direct na het toevoegen van agarose met behulp van een 25 meter naald.Zodra de agarose volledig is gestold, los deze los van de buis met een 25-meter naald bevestigd aan een een milliliter spuit en breng het naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Vul de buis met 70% ethanol en ga verder met het conventionele protocol voor weefseluitdroging en paraffine inbedding. Dit protocol werd met succes gebruikt om 3D-organoïden vast te stellen van door de patiënt afgeleide xenograftmodellen van botuitzaaiende prostaatkanker en rechtstreeks uit het kankerweefsel.De organoïden vertoonden verschillende fenotypes die zich manifesteerden als cysten, sferoïden en hogere complexiteitsorganoïden. Een hele koepel van keldermembraan en organoïden is te zien in een gestikt beeld van 25 hoge resolutie, 10X vergrotingsbeelden. Om het tumorweefsel verder te onderzoeken, werd immunofluorescente cytochemie uitgevoerd op een vijf micrometer dikke paraffinesectie van organoïden gericht op de basale epitheelcelmarkering cytokeratine-5, luminale epitheliale celmarker cytokeratine-8 en DAPI.Dit protocol kan worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen zoals westerse blotting, co-cultuur en flow cytometrie om kenmerken van 3D-organoïden en de effecten van medicamenteuze behandelingen te verkennen. Deze experimenten kunnen mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen en de werkzaamheid van nieuwe therapieën alleen of in combinatie met de huidige therapieën aanpakken. De 3D-organoïden van deze techniek behouden inter-subject en intra-subject heterogeniteit en zijn daarom een nauwkeuriger model van de ziekte bij patiënten.Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen, tumorigenese, metastase en therapieën te onderzoeken die voorspelbaarder kunnen zijn voor de progressie van de ziekte bij patiënten en hun reactie op therapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Oprichting van een primaire cultuur van patiënt-afgeleide weke delen Sarcoom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...