Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par la Leo and Anne Albert Charitable Foundation et la JM Foundation. Nous remercions les membres du Centre de cancérologie de l'Université de Californie à San Diego Moores, le Dr Jing Yang et le Dr Kay T. Yeung de nous avoir permis l'utilisation de leur microtome et Randall Français, département de chirurgie pour l'expertise technique.

Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide for the University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). L'Accord de #090401 de la CISR a été reçu de la Commission d'examen institutionnel de l'UCSD (CISR) pour recueillir des échantillons chirurgicaux de patients à des fins de recherche. Un consentement informé a été obtenu de chaque patient et un spécimen chirurgical de métastasie de cancer de la prostate d'os a été obtenu de la réparation orthop...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

Les organoïdes 3D dérivés des cellules cancéreuses de prostate de métastasie d'os patient sont encore relativement rares. Ici, nous décrivons des stratégies et le protocole optimisé de nouveau pour établir avec succès les organoïdes dérivés de patient 3D de série (PDO) de BMPC. En outre, des protocoles sont décrits pour fixer les organoïdes dans les échantillons avec la densité cellulaire inférieure pour l'analyse d'IFC et d'IHC. Les phénotypes différentiels sous forme de kyste, de sphéroïdes et d'...

Les organoïdes cultivés tridimensionnels ont attiré l'attention sur leur potentiel de récapituler l'architecture in vivo, la fonctionnalité cellulaire et la signature génétique de leurs tissus d'origine1,2,3,4,5. Plus important encore, les organoïdes 3D établis à partir de tissus tumoraux patients ou de xénogreffes dérivées du patient (PDX) modèles fournissent des occasions inestimables de comprendre les mécanismes de signalisation cellulaire sur la tumorigénèse et de déterminer les effets du traitement médicamenteux sur chaque population cellulaire6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et coll.5 ont élaboré un protocole standard pour l'établissement d'organoïdes de la prostate humains et souris, qui a été largement adopté dans le domaine de l'urologie. En outre, un effort significatif a été consacré pour la caractérisation des organoïdes 3D et de comprendre les mécanismes détaillés de la tumorigénèse et la métastes4,12,14,15. En plus du protocole précédemment établi et largement accepté pour les cultures d'organoïdes 3D, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la culture 3D de PDO utilisant trois méthodes différentes de doming dans des conditions de culture optimisées.
Dans ce manuscrit, des organoïdes 3D ont été établis comme modèle ex vivo du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC). Les cellules utilisées pour ces cultures provenaient de la prostate Cancer San Diego (PCSD) série et ont été dérivés directement de patients cancer de la prostate os métastatique tissus tumoraux (PCSD18 et PCSD22) ou le patient dérivé xénogreffe (PDX) modèles tumoraux (échantillons nommés PCSD1, PCSD13, et PCSD17). Parce que la métastase spontanée d'os des cellules cancéreuses de la prostate est rare dans les modèles génétiquement modifiés de souris16,nous avons employé l'injection intra-fémorale directe (IF) des cellules humaines de tumeur dans le Rag2 mâle -/--c------souris pour établir les modèles de PDX du cancer de la prostate métastatiqued'os 17.
Une fois que les organoïdes 3D sont établis à partir des cellules hétérogènes de tumeur patiente ou des xénogreffes dérivées de patient, il est essentiel de confirmer leur identité en tant que cellules de tumeur de prostate et de déterminer leurs phénotypes dans les cultures organoïdes 3D. La chimie de l'immunofluorescence (IFC) permet la visualisation de l'expression des protéines in situ dans chaque cellule, indiquant souvent les fonctions potentielles pour des populations cellulaires spécifiques2,4. En général, les protocoles IFC pour une grande majorité d'échantillons, y compris les tissus et les cellules, sont simples et entièrement optimisés. Cependant, la densité cellulaire et le nombre d'organoïdes peuvent être significativement inférieurs à ceux de la culture conventionnelle. Par conséquent, le protocole de l'IFC pour les organoïdes nécessite des mesures supplémentaires pour assurer un traitement approprié et l'intégration de la paraffine pour tous les organoïdes dans les échantillons. Nous décrivons des étapes supplémentaires pour un processus de pré-embedding d'agarose et des bouts pour étiqueter l'emplacement des organoïdes sectionnés sur la glissière qui augmente le taux de succès de l'IFC sur des organoïdes particulièrement quand les échantillons des organoïdes ont la densité cellulaire inférieure que désiré.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

La culture tridimensionnelle (3D) des organoïdes des spécimens de tumeur des patients humains et des modèles de xénogreffe (PDX) de patient-dérivé (PDX), désignés sous le nom d'organoïdes patient-dérivés (PDO), sont une ressource inestimable pour étudier le mécanisme de tumorigenesis et métastasie du cancer de la prostate. Leur principal avantage est qu'ils maintiennent l'hétérogénéité génomique et fonctionnelle distinctive du tissu original par rapport aux lignées cellulaires conventionnelles qui ne le font pas. En outre, les cultures 3D de l'ADP peuvent être utilisées pour prédire les effets du traitement médicamenteux sur les patients individuels et sont une étape vers la médecine personnalisée. Malgré ces avantages, peu de groupes utilisent régulièrement cette méthode en partie en raison de l'optimisation étendue des conditions de culture des APR qui peuvent être nécessaires pour différents échantillons de patients. Nous avons précédemment démontré que notre modèle de métastasie d'os de prostate PDX, PCSD1, a récapitulé la résistance de la métaste d'os du patient de distributeur au traitement d'anti-androgène. Nous avons employé des organoïdes 3D de PCSD1 pour caractériser plus loin les mécanismes de la résistance d'anti-androgène. À la suite d'un aperçu des études actuellement publiées sur les modèles PDX et ADP, nous décrivons un protocole étape par étape pour la culture 3D de l'ADO à l'aide de membranes en dôme ou flottantes (p. ex. Matrigel) dans des conditions de culture optimisées. L'imagerie in vivo de point et le traitement cellulaire pour l'histologie sont également décrits. Ce protocole peut être optimisé pour d'autres applications, y compris la tache occidentale, la co-culture, etc. et peut être utilisé pour explorer les caractéristiques de l'AOP cultivé en 3D concernant la résistance aux médicaments, la tumorigénèse, la métastes et la thérapeutique.

Des organoïdes 3D ont été établis avec succès à partir d'un modèle de xénogreffe dérivé de patient (PDX) du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC) aussi bien que directement du tissu métastatique patient de cancer de la prostate (figure 4). En bref, nos modèles de PDX de BMPC ont été établis par l'injection intra-fémorale (IF) des cellules de tumeur dans le Rag2mâle -/- c-/- souris et puis les tumeurs de PDX ont été moissonnées et traitées ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.

Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Nous décrivons des stratégies et des protocoles étape par étape pour établir les organoïdes patients-dérivés 3D périodiques du cancer métastatique de prostate d’os. Nos protocoles optimisés sont pratiques pour mettre en place des cultures 3D pour des expériences utilisant le matériel de départ limité directement des patients ou des tissus de tumeur de xénogreffe patients-dérivés. Les organoïdes 3D de ce protocole peuvent être utilisés comme modèles ex vivo pour comprendre les mécanismes de base de la pathologie métastatique du cancer de la prostate osseuse et pour tester le traitement.Le média de culture organoïde 3D dans ce protocole est spécifique pour les cellules prostate-dérivées. D’autres parties de nos protocoles sont applicables à différents types de tissus tumoraux et de sites métastatiques. La technique du doming peut s’avérer être la partie la plus difficile de ce processus.La pratique de la technique de doming assurera une taille cohérente du mélange bombé des organoïdes, des médias, et de Matrigel, et de réduire au minimum la formation de bulle pendant la suspension d’échantillon. La démonstration visuelle de cette méthode permet de mieux comprendre comment manipuler le Matrigel visqueux pour réussir à culturer des organoïdes de basse densité à partir d’un faible nombre de cellules. Commencez par réutiliser la pastille cellulaire dans le volume approprié de la membrane du sous-sol pour une installation de plaque de 24 puits.Pipette de haut en bas doucement pour s’assurer que les cellules sont résuspendées, puis pipette le volume approprié de la suspension cellulaire dans le centre d’une plaque de culture de tissu préchauffé. Inverser la plaque et la placer immédiatement à l’envers dans l’incubateur de culture cellulaire fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 15 minutes. Pipette le volume approprié de milieu préchauffé contenant 10 micromolaires Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits.Pour former un dôme flottant à partir du dôme rond ci-joint, détachez le dôme de la plaque à l’aide d’un grattoir cellulaire. Coupez un morceau de film de paraffine de deux par quatre pouces et placez-le sur les divots d’une grille vide de fixation de pointe d’une boîte en plastique de pointe de pipette d’un millilitre. Utilisez un index ganté pour appuyer doucement sur le film de paraffine pour tracer les divots en prenant soin de ne pas percer le film.Vaporiser le film de paraffine avec 70% d’éthanol et allumer la lampe UV dans le capot de culture cellulaire pour stériliser le film préparé pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, résuspendez les cellules pré-traitées dans 20 microlitres de membrane de sous-sol. Puis pipette la suspension dans les divots formés dans le film de paraffine.Placez les perles solidifiées et le film de paraffine dans une assiette de six puits et pipette de trois à cinq millilitres de milieu préchauffé contenant 10 micromolaires Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits tout en brossant doucement les perles du film de paraffine. Pour traiter les organoïdes pour l’histologie, retirez les supports existants du puits en prenant soin de ne pas aspirer les dômes membranaires du sous-sol. Ajouter un volume égal de solution de récupération cellulaire et incuber la plaque pendant 60 minutes à quatre degrés Celsius.Après l’incubation, déloger le dôme membranaire du sous-sol à l’aide d’une pipette et l’écraser à l’aide d’une pointe de pipette. Recueillir le dôme dissocié et la solution de récupération cellulaire dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifugez le tube à 300 fois g en quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant et mettez-le de côté.Gardez tous les supernatants jusqu’à l’étape finale où la présence d’organoïdes est confirmée au volume désiré de PBS froid et pipette doucement de haut en bas pour déloger mécaniquement la pastille sans perturber les organoïdes. Répétez la centrifugation et retirez le supernatant. Fixez la pastille dans un volume assorti de 4%PFA pendant 60 minutes à température ambiante.Après la fixation, répétez l’étape de centrifugation et le lavage PBS. Ajoutez ensuite lentement 200 microlitres d’agarose chaude de 2 % et détachez immédiatement mais doucement la pastille cellulaire de la paroi du tube sans la perturber à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre. Pour la méthode de spin down agarose, il est essentiel de détacher la pastille cellulaire de la paroi du tube juste après l’ajout d’agarose à l’aide d’une aiguille de calibre 25.Une fois que l’agarose s’est complètement solidifiée, détachez-la du tube avec une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre et transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Remplissez le tube de 70 % d’éthanol et procédez au protocole conventionnel de déshydratation des tissus et d’intégration de la paraffine. Ce protocole a été avec succès employé pour établir des organoïdes 3D des modèles xénogreffe patients-dérivés du cancer de la prostate métastatique d’os aussi bien que directement du tissu de cancer.Les organoïdes ont montré différents phénotypes qui se sont manifestés comme kystes, sphéroïdes, et organoïdes de plus grande complexité. Un dôme entier de membrane de sous-sol et d’organoïdes peut être vu dans une image cousue à partir de 25 images de grossissement à haute résolution et 10X. Pour étudier plus loin le tissu de tumeur, la cytochimie immunofluorescente a été exécutée sur une section épaisse de paraffine de cinq micromètres des organoïdes ciblant le marqueur épithélial basal de cellules cytokeratin-5, cytokeratin-8 épithélial de marqueur épithélial de cellules luminal et DAPI.Ce protocole peut être optimisé pour d’autres applications telles que le ballonnement occidental, la co-culture et la cytométrie d’écoulement pour explorer les caractéristiques des organoïdes 3D et les effets des traitements médicamenteux. Ces expériences pourraient aborder les mécanismes de résistance aux médicaments et l’efficacité de nouvelles thérapeutiques seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles. Les organoïdes 3D de cette technique conservent l’hétérogénéité inter-sujet et intra-sujet et sont donc un modèle plus précis de la maladie chez les patients.Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer les mécanismes de résistance aux médicaments, tumorigenesis, métastases et thérapeutiques qui peuvent être plus prévisibles de la progression de la maladie chez les patients et leur réponse à la thérapie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Étiquetage des xénogreffes de patients dérivés cancer du sein avec traçables Reporters pour la croissance tumorale et la métastase études

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Mise en place d’une Culture primaire de sarcome des tissus mous dérivé de Patient

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilité améliorée pour les cultures Hydrogel 3D Ex vivo de xénogreffes dérivées du patient dans une plate-forme microfluidique perfusée

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Dépistage de drogue des xénogreffes dérivées de tumeur de patient primaire dans le poisson-zèbre

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

L’établissement et l’utilisation de modèles de xénogreffes dérivés de patients de métastases du système nerveux central

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...