Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Leo and Anne Albert Charitable Foundation und der JM Foundation unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des University of California San Diego Moores Cancer Center, Dr. Jing Yang und Dr. Kay T. Yeung, dass sie uns die Verwendung ihres Mikrotom und Randall French, Department of Surgery für technisches Know-how ermöglicht haben.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Guide for the University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB) durchgeführt. IRB #090401 Die Zulassung wurde vom UCSD Institutional Review Board (IRB) erhalten, um chirurgische Proben von Patienten zu Forschungszwecken zu sammeln. Von jedem Patienten wurde eine informierte Einwilligung eingeholt und eine Probe für chirurgische Knochenprostatasierungen durch orthopädische Reparatur einer pathologischen Fraktur im Obersche...

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	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

3D-Organoide, die aus Patientenknochenmetastasen Prostatakrebszellen gewonnen werden, sind noch relativ selten. Hier beschreiben wir Strategien und weiter optimiertes Protokoll zu erfolgreich etablierten seriellen 3D-Patienten abgeleiteten Organoiden (PDOs) von BMPC. Darüber hinaus werden Protokolle beschrieben, um die Organoide in Proben mit geringerer Zelldichte für die IFC- und IHC-Analyse zu sichern. Differentialphäpnotypen in Form von Zysten, Sphäroiden und komplexeren Organoiden deuten darauf hin, dass dieses P...

Dreidimensionale kultivierte Organoide haben die Aufmerksamkeit auf ihr Potenzial gelenkt, die In-vivo-Architektur, die zelluläre Funktionalität und die genetische Signatur ihrer ursprünglichen Gewebe1,2,3,4,5zu rekapitulieren. Am wichtigsten ist, 3D-Organoide aus Patiententumorgewebe oder Patienten abgeleitet Xenograft (PDX) Modelle bieten unschätzbare Möglichkeiten, Mechanismen der zellulären Signalisierung auf Tumorigenese zu verstehen und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf jede Zellpopulation6,7,8,9,10,11,12,13zu bestimmen. Drost et al.5 entwickelten ein Standardprotokoll zur Etablierung von Prostataorganoiden von Mensch und Maus, das im Bereich der Urologie weit verbreitet ist. Darüber hinaus wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um 3D-Organoide weiter zu charakterisieren und die detaillierten Mechanismen der Tumorgenese und Metastasierung4,12,14,15zu verstehen. Neben dem zuvor etablierten und weithin akzeptierten Protokoll für 3D-Organoidkulturen beschreiben wir hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die 3D-Kultur von pDO mit drei verschiedenen Doming-Methoden unter optimierten Kulturbedingungen.
In diesem Manuskript wurden 3D-Organoide als ex vivo Modell von Knochenmetastasierung Prostatakrebs (BMPC) etabliert. Die für diese Kulturen verwendeten Zellen stammten aus der Serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) und wurden direkt von patienten ProstatakrebsKnochenmetastasen-Tumorgeweben (PCSD18 und PCSD22) oder von Patienten abgeleiteten Xenograft-Tumormodellen (PDX) (Proben mit den Namen PCSD1, PCSD13 und PCSD17) abgeleitet. Da spontane Knochenmetastasen von Prostatakrebszellen in gentechnisch veränderten Mausmodellen16selten sind, haben wir die direkte intrafemorale (IF) Injektion menschlicher Tumorzellen in männliche Rag2-/-'c-/- Mäuse verwendet, um die PDX-Modelle von Knochenmetastasatasanasanzen zu etablieren17.
Sobald 3D-Organoide aus heterogenen Patiententumorzellen oder von Patienten abgeleiteten Xenografts nachgewiesen wurden, ist es wichtig, ihre Identität als Prostatatumorzellen zu bestätigen und ihre Phänotypen in den 3D-Organoidkulturen zu bestimmen. Die Immunfluoreszenzchemie (IFC) ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression vor Ort in jeder Zelle, was häufig auf die potenziellen Funktionen für bestimmte Zellpopulationen2,4hinweist. Im Allgemeinen sind IFC-Protokolle für eine große Anzahl von Proben, einschließlich Geweben und Zellen, einfach und vollständig optimiert. Die Zelldichte und die Anzahl der Organoide können jedoch deutlich niedriger sein als die der konventionellen Kultur. Daher erfordert das IFC-Protokoll für Organoide zusätzliche Schritte, um eine ordnungsgemäße Verarbeitung und Einbettung in Paraffin für alle Organoide in die Proben zu gewährleisten. Wir beschreiben zusätzliche Schritte für einen Agarose-Voreinbettungsprozess und Tipps, um die Position von schnittförmigen Organoiden auf der Folie zu kennzeichnen, die die Erfolgsrate von IFC auf Organoiden erhöht, insbesondere wenn die Proben von Organoiden eine geringere Zelldichte als gewünscht aufweisen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

Die dreidimensionale (3D) Kultur von Organoiden aus Tumorproben menschlicher Patienten und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX), die als patientenabgeleitete Organoide (g.U.) bezeichnet werden, sind eine unschätzbare Ressource für die Untersuchung des Tumorgenese und Metastasierung von Prostatakrebs. Ihr Hauptvorteil besteht darin, dass sie die ausgeprägte genomische und funktionelle Heterogenität des ursprünglichen Gewebes im Vergleich zu herkömmlichen Zelllinien, die dies nicht tun, beibehalten. Darüber hinaus können 3D-Kulturen von g.A. verwendet werden, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf einzelne Patienten vorherzusagen und sind ein Schritt in Richtung personalisierte Medizin. Trotz dieser Vorteile verwenden nur wenige Gruppen diese Methode routinemäßig, zum Teil aufgrund der umfassenden Optimierung der PDO-Kulturbedingungen, die für verschiedene Patientenproben erforderlich sein können. Wir haben zuvor gezeigt, dass unsere Prostatakrebs-Knochenmetastasierung PDX-Modell, PCSD1, die Resistenz der Knochenmetastasierung des Spenderpatienten gegen Anti-Androgen-Therapie rekapituliert hat. Wir verwendeten PCSD1 3D-Organoide, um die Mechanismen der Anti-Androgen-Resistenz weiter zu charakterisieren. Nach einem Überblick über die aktuell veröffentlichten Studien zu PDX- und PDO-Modellen beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die 3D-Kultur von pDO unter Verwendung von gewölbten oder schwimmenden Kellermembran(z.B. Matrigel) Kugeln unter optimierten Kulturbedingungen. In vivo Stichbildgebung und Zellverarbeitung für die Histologie werden ebenfalls beschrieben. Dieses Protokoll kann weiter für andere Anwendungen optimiert werden, einschließlich Western Blot, Co-Culture, etc. und kann verwendet werden, um Eigenschaften von 3D-kultivierten g.Us-Dollar in Bezug auf Arzneimittelresistenz, Tumorigenese, Metastasen und Therapeutika zu erforschen.

3D-Organoide wurden erfolgreich aus einem vom Patienten abgeleiteten Xenograft(PDX)-Modell von Knochenmetastasierung Prostatakrebs (BMPC) sowie direkt aus patientenknochenmetastasischem Prostatakrebsgewebe(Abbildung 4) hergestellt. Kurz gesagt, unsere PDX-Modelle von BMPC wurden durch intrafemorale (IF) Injektion von Tumorzellen in männliche Rag2-/- c-/- Mäuse und dann PDX-Tumoren geerntet und verarbeitet, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wie in <strong class="xf...

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Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Dreidimensionale Kulturen von Patienten-BMPC-Proben und Xenografts von Knochenmetastasierung Prostatakrebs erhalten die funktionelle Heterogenität ihrer ursprünglichen Tumoren, was zu Zysten, Sphäroiden und komplexen, tumorartigen Organoiden führt. Dieses Manuskript bietet eine Optimierungsstrategie und ein Protokoll für die 3D-Kultur heterogener Patientenproben und deren Analyse mit IFC.

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Wir beschreiben Strategien und Schritt-für-Schritt-Protokolle, um serielle 3D-Patienten-abgeleitete Organoide von Knochenmetastasen-Prostatakrebs zu etablieren. Unsere optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem Ausgangsmaterial direkt von Patienten oder patientenabgeleitetem Xenograft-Tumorgewebe einzurichten. Die 3D-Organoide aus diesem Protokoll können als ex vivo-Modelle verwendet werden, um grundlegende Mechanismen der Knochenmetastasen-Prostatakrebspathologie zu verstehen und die Behandlung zu testen.Die 3D-Organoidkulturmedien in diesem Protokoll sind spezifisch für Prostatazellen. Andere Teile unserer Protokolle sind auf verschiedene Arten von Tumorgeweben und metastasierenden Stellen anwendbar. Die Doming-Technik kann sich als der schwierigste Teil dieses Prozesses erweisen.Das Üben der Doming-Technik sorgt für eine konsistente Größe der gewölbten Mischung aus Organoiden, Medien und Matrigel und minimiert die Blasenbildung während der Probensuspension. Die visuelle Demonstration dieser Methode bietet ein besseres Verständnis für den Umgang mit dem zähflüssigen Matrigel zur erfolgreichen Kultivierung von Organoiden mit geringerer Dichte aus einer geringen Anzahl von Zellen. Beginnen Sie mit dem Wiederaufhängen des Zellpellets in der entsprechenden Menge an Kellermembran für eine 24-Well-Platteneinrichtung.Pipette sanft nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Zellen resuspendiert werden, dann Pipette das entsprechende Volumen der Zellsuspension in die Mitte einer vorgewärmten Gewebekulturplatte. Invertieren Sie die Platte und legen Sie sie sofort auf den Kopf in den Zellkultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 15 Minuten eingestellt ist. Das entsprechende Volumen des vorgewärmten Mediums mit 10 Mikromolaren Y-27632 Dihydrochlorid in jeden Brunnen einteilen.Um eine schwebende Kuppel von der befestigten runden Kuppel zu bilden, lösen Sie die Kuppel von der Platte mit einem Zellschaber. Schneiden Sie ein zwei mal vier Zoll großes Stück Paraffinfolie und legen Sie es auf die Divots eines leeren Spitzenhalters aus einer ein Milliliter Plastik-Pipetten-Spitzenbox. Verwenden Sie einen gehandicapten Zeigefinger, um sanft auf den Paraffinfilm zu drücken, um die Divots zu verfolgen, die darauf achten, den Film nicht zu durchbrechen.Sprühen Sie den Paraffinfilm mit 70% Ethanol und schalten Sie die UV-Lampe in der Zellkulturhaube ein, um den vorbereiteten Film mindestens 30 Minuten lang zu sterilisieren. In der Zwischenzeit, resuspendieren Sie die vorverarbeiteten Zellen in 20 Mikroliter Kellermembran. Dann Pipette die Suspension in die Divots in der Paraffin-Folie gebildet.Legen Sie die erstarrten Perlen und Paraffinfolie in eine Sechs-Brunnen-Platte und Pipette drei bis fünf Milliliter vorgewärmtes Medium mit 10 Mikromolar Y-27632 Dihydrochlorid in jeden Brunnen, während sanft Bürsten von der Paraffinfolie. Um die Organoide für die Histologie zu verarbeiten, entfernen Sie vorhandene Medien aus dem Brunnen, die darauf achten, die Kellermembrankuppeln nicht zu aspirieren. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Zellrückgewinnungslösung hinzu und inkubieren Sie die Platte für 60 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Inkubation die Kellermembrankuppel mit einer Pipette lösen und mit einer Pipettenspitze zerkleinern. Sammeln Sie die dissoziierte Kuppel und die Zellrückgewinnungslösung in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 mal g in vier Grad Celsius für fünf Minuten, dann entfernen Sie den Überstand und legen Sie es beiseite.Speichern Sie alle Überräube bis zum letzten Schritt, wenn das Vorhandensein von Organoiden bei der gewünschten Menge an kalten PBS bestätigt wird und sanft Pipetten nach oben und unten, um das Pellet mechanisch zu vertreiben, ohne die Organoide zu stören. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Fixieren Sie das Pellet in einem abgestimmten Volumen von 4%PFA für 60 Minuten bei Raumtemperatur.Wiederholen Sie nach der Fixierung den Zentrifugationsschritt und die PBS-Wäsche. Dann langsam 200 Mikroliter warme 2%Agarose hinzufügen und sofort, aber sanft das Zellpellet von der Rohrwand lösen, ohne es mit einer 25-Spur-Nadel an einer Ein-Milliliter-Spritze zu stören. Für die Agarose-Spin-Down-Methode ist es wichtig, das Zellpellet direkt nach dem Hinzufügen von Agarose mit einer 25-Spur-Nadel von der Wand des Rohres zu lösen.Sobald die Agarose vollständig verfestigt ist, lösen Sie sie mit einer 25-Spur-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, aus dem Rohr und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit 70% Ethanol und fahren Sie mit dem herkömmlichen Protokoll für Gewebedehydrierung und Paraffineinbettung fort. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um 3D-Organoide aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen von Knochenmetastasen-Prostatakrebs sowie direkt aus dem Krebsgewebe zu etablieren.Die Organoide zeigten verschiedene Phänotypen, die sich als Zysten, Sphäroide und Organoide mit höherer Komplexität manifestierten. Eine ganze Kuppel aus Kellermembran und Organoiden ist in einem genähten Bild aus 25 hochauflösenden, 10-fachen Vergrößerungsbildern zu sehen. Zur weiteren Untersuchung des Tumorgewebes wurde eine immunfluoreszente Zytochemie an einem fünf Mikrometer dicken Paraffinabschnitt von Organoiden durchgeführt, die auf den basalen Epithelzellmarker Cytokeratin-5, den luminalen Epithelzellmarker Cytokeratin-8 und DAPI abzielten.Dieses Protokoll kann für andere Anwendungen wie Western Blotting, Co-Culture und Flow Zytometrie optimiert werden, um Eigenschaften von 3D-Organoiden und die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen zu erforschen. Diese Experimente könnten Mechanismen der Arzneimittelresistenz und die Wirksamkeit neuartiger Therapeutika allein oder in Kombination mit aktuellen Therapien angehen. Die 3D-Organoide dieser Technik behalten die intersubjektische und intra-subjekt-Heterogenität bei und sind daher ein genaueres Modell der Erkrankung bei Patienten.Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, Mechanismen der Arzneimittelresistenz, Tumorigenese, Metastasierung und Therapeutika zu erforschen, die mehr vorhersehbar für das Fortschreiten der Krankheit bei Patienten und ihre Reaktion auf die Therapie sein können.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Einrichtung einer primären Kultur des Patienten abgeleitet Weichteilsarkomen

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...