Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן מזל אריה ואן אלברט וקרן JM. אנו מודים לאוניברסיטה של קליפורניה בסן דייגו מורס מרכז הסרטן חברי, ד ר. ג'ינג יאנג וד ר קיי ט. י. המאפשר לנו להשתמש במיקרוטומה שלהם ובצרפתית רנדל, המחלקה לכירורגיה למומחיות טכנית.

מחקר זה נעשה בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך עבור אוניברסיטת קליפורניה סן דייגו (UCSD) סקירה מוסדית (IRB). IRB #090401 אישור התקבל מהלוח סקירה מוסדית UCSD (IRB) כדי לאסוף דגימה כירורגית מחולים למטרות מחקר. הסכמה מושכלת הושגה מכל מטופל ובעל עצם ניתוח סרטן הערמונית גרורות התקבל תיקון אורתופדית של שבר פתו?...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

אורגנואידים תלת-ממדיים שנגזר מעצם החולה גרורות בתאי סרטן הערמונית הם עדיין נדירים יחסית. כאן, אנו מתארים אסטרטגיות אופטימיזציה נוספת הפרוטוקול להקים בהצלחה החולה 3D סדרתי המטופל הנגזר (PDOs) של BMPC. בנוסף, הפרוטוקולים מתוארים כדי לאבטח את האורגנואידים בדגימות עם צפיפות תאים נמוכה יותר עבור IFC...

האורגנואידים התלת-ממדיים משכו תשומת לב ליכולתם ללכוד את הvivo באדריכלות, הפונקציונליות התאית והחתימה הגנטית של הרקמות המקוריות שלהם1,2,3,4,5. החשוב ביותר, 3d אורגנואידים הוקמה מרקמות סרטן החולה או המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לספק הזדמנויות לא יסולא בפז להבין מנגנונים של איתות סלולרי על טומגנזה וכדי לקבוע את ההשפעות של טיפול בסמים על כל אוכלוסייה תא6,7,8,9,10,11,12,13. דרוסט ואח '5 פיתח פרוטוקול סטנדרטי להקמת אורגנואידים של האדם והעכבר, אשר אומצה באופן נרחב בתחום של אורולוגיה. בנוסף, מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון נוסף של 3d אורגנואידים ולהבין את המנגנונים המפורטים של tuמוריגנזה ו גרורות4,12,14,15. בנוסף לפרוטוקול שהוקם בעבר ומקובל ביותר עבור תרבויות 3D אורגנואידים, אנו מתארים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות שלוש שיטות שונות doming בתנאי תרבות אופטימיזציה.
בכתב יד זה, 3D אורגנואידים הוקמו כמודל vivo ex של סרטן הערמונית גרורתי העצם (BMPC). התאים המשמשים עבור תרבויות אלה הגיעו מסרטן הערמונית סן דייגו (pcsd) סדרה ונגזר ישירות החולה סרטן הערמונית העצם גרורות רקמות גידולים (PCSD18 ו PCSD22) או החולה נגזר מבע (pdx) מודלים סרטניים (דגימות בשם PCSD1, PCSD13, ו PCSD17). מכיוון גרורות עצם ספונטנית של תאים סרטניים בערמונית נדיר במודלים מהונדסים גנטית העכבר16, השתמשנו ישירה הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים האדם לתוך זכר Rag2-/-γc- עכברים להקמת מודלים pdx של סרטן הערמונית גרורתי עצם17.
ברגע שאורגנואיד 3D הוקמו תאים סרטניים הטרוגנית החולה או המטופל נגזר xenografts, זה חיוני כדי לאשר את זהותם כמו תאים סרטניים בערמונית כדי לקבוע פנוטיפים שלהם בתרבויות 3D אורגאיד. אימונולובורנציה כימיה (IFC) מאפשר הדמיה של ביטוי החלבון באתרו בכל תא, לעתים קרובות מציין את הפונקציות הפוטנציאליות עבור אוכלוסיות תאים ספציפיות2,4. באופן כללי, פרוטוקולים IFC עבור רוב המכריע של דגימות כולל רקמות ותאים פשוטים וממוטבים לחלוטין. עם זאת, צפיפות התא ומספר האורגנואידים יכולים להיות נמוכים באופן משמעותי מזו של התרבות המקובלת. לכן, פרוטוקול IFC עבור אורגנואידים דורש צעדים נוספים כדי להבטיח עיבוד תקין והטבעה של פרפין עבור כל אורגנואידים בדגימות. אנו מתארים שלבים נוספים עבור תהליך הטמעה מראש וטיפים כדי לתייג את המיקום של האורגנואידים מנות בשקופית המגביר את שיעור ההצלחה של IFC על אורגנואידים במיוחד כאשר דגימות של האורגנואידים יש צפיפות תא נמוכה יותר מאשר הרצוי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

תלת מימדי (3d) תרבות של אורגנואידים מתוך דגימות הגידול של חולים אנושיים והמטופל נגזר מבע (pdx) מודלים של סרטן הערמונית, המכונה מטופל נגזר החולה (pdo), הם משאב לא יסולא בפז ללמוד את המנגנון של טווריגנזה וגרורה של סרטן הערמונית. היתרון העיקרי שלהם הוא שהם לשמור על גנומית ייחודי ופונקציונלי טרוגניות של רקמת המקורי לעומת קווי תאים קונבנציונליים כי לא. יתר על כן, התרבויות 3D של PDO יכול לשמש כדי לנבא את ההשפעות של טיפול בסמים על חולים בודדים הם צעד לקראת הרפואה אישית. למרות היתרונות הללו, קבוצות מעטות משתמשות בשיטה זו באופן שגרתי במסגרת המיטוב הנרחב של תנאי התרבות PDO העשויים להידרש לדגימות מטופלים שונים. בעבר הדגמנו כי סרטן הערמונית שלנו עצם גרורות PDX מודל, PCSD1, לכידה ההתנגדות של גרורות העצם של המטופל תורם לטיפול אנטי אנדרוגן. השתמשנו PCSD1 3D אורגנואידים כדי לאפיין עוד את המנגנונים של אנטי אנדרוגן התנגדות. בעקבות סקירה של מחקרים שפורסמו כעת של PDX ו-PDO מודלים, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור תרבות תלת-ממד של PDO באמצעות ממברנה כיפה או צפה מרתף (g., מטריצות) ספירות בתנאים התרבותיים אופטימיזציה. ב vivo תפר הדמיה ועיבוד תאים עבור היסטולוגיה מתוארים גם. פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה נוספת עבור יישומים אחרים, כולל אבן חשופה מערבית, שיתוף תרבות, וכו ' והוא יכול לשמש כדי לחקור את המאפיינים של PDO תרבותי תלת-ממד המתייחס התנגדות לסמים, tuמוריגנזה, גרורות ו therapeutics.

אורגנואידים 3d הוקמו בהצלחה מן החולה נגזר מבע (pdx) מודל של סרטן הערמונית גרורתי העצם (bmpc), כמו גם ישירות מרקמת סרטן הערמונית גרורתית העצם (איור 4). בקצרה, מודלים pdx שלנו של bmpc הוקמו על ידי פנים הירך (IF) הזרקה של תאים סרטניים לתוך Rag2 זכר-/- c-/- עכברים ולאחר מכן הגידולים pdx ?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

תרבויות תלת ממדיות של החולה BMPC דגימות ו xenografts של סרטן הערמונית גרורתי העצם לשמור על טרוגניות תפקודית של גידולים המקורי שלהם וכתוצאה מכך ציסטות, spheroids ו מורכבים, גידול כמו אורגנואידים. כתב יד זה מספק אסטרטגיה מיטוב ופרוטוקול לתרבות תלת-ממדית של מטופלים הטרוגנית דגימות נגזרות והניתוח שלהם באמצעות IFC.

הקמה וניתוח של תלת מימדי (3D) אורגנואידים נגזר החולה סרטן הערמונית העצם גרורות דגימות ושתלי Xenografts להם

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

אנו מתארים אסטרטגיות ופרוטוקולים שלב אחר שלב כדי להקים אורגנואידים סדרתיים שמקורם בחולים תלת-מימדיים של סרטן הערמונית גרורתי בעצמות. הפרוטוקולים האופטימיים שלנו הם מעשיים כדי להגדיר תרביות 3D לניסויים באמצעות חומר התחלתי מוגבל ישירות מחולים או רקמות גידול שנגזרו על ידי המטופל. האורגנואידים 3D מפרוטוקול זה יכול לשמש מודלים ex vivo להבין מנגנונים בסיסיים של פתולוגיה סרטן הערמונית גרורתי עצם כדי לבדוק את הטיפול.מדיית תרבות האורגנואידים תלת-מימדית בפרוטוקול זה ספציפית לתאים שמקורם בערמונית. חלקים אחרים של הפרוטוקולים שלנו חלים על סוגים שונים של רקמות הגידול ואתרים גרורתיים. טכניקת הדומינג עשויה להתברר כחלק הקשה ביותר בתהליך זה.תרגול טכניקת ההדמיה יבטיח גודל עקבי של תערובת הכיפה של אורגנואידים, מדיה, ו Matrigel, ולמזער היווצרות בועה במהלך השעיה מדגם. הדגמה חזותית של שיטה זו מספקת הבנה טובה יותר של אופן האופן שבו ניתן לטפל במטריגל הקרבי לצורך טיפול מוצלח באורגנואידים בצפיפות נמוכה ממספר נמוך של תאים. התחל על ידי שימוש חוזר את גלולת התא בנפח המתאים של קרום מרתף עבור התקנה צלחת 24 היטב.פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי להבטיח כי התאים הם resuspended, ולאחר מכן pipette את הנפח המתאים של ההשעיה התא למרכז צלחת תרבות רקמה מחוממת מראש. להפוך את הצלחת מיד למקם אותו במהופך באינקובטור תרבות התא להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 15 דקות. פיפטה הנפח המתאים של מדיום מחומם מראש המכיל 10 מיקרומולר Y-27632 דיהידרוכלוריד לתוך כל באר.כדי ליצור כיפה צפה מהכיפה העגולה המחוברת, נתק את הכיפה מהצלחת באמצעות מגרד תאים. חותכים חתיכה של שניים על ארבעה אינץ ' של סרט פרפין ומ מניחים אותו על גבי divots של מתלה מחזיק קצה ריק מתיבת קצה פיפטה פלסטיק מיליליטר אחד. השתמש באצבע המורה כפפות בעדינות ללחוץ על הסרט פרפין כדי לעקוב אחר divots דואג לא לפרוץ את הסרט.לרסס את הסרט פרפין עם 70% אתנול ולהדליק את מנורת UV במכסה המנוע של תרבות התא כדי לעקר את הסרט מוכן לפחות 30 דקות. בינתיים, תעבדו מחדש את התאים המעובדים מראש ב-20 מיקרוליטרים של קרום מרתף. ואז פיפטה ההשעיה לתוך divots נוצר בסרט פרפין.מניחים את חרוזים מוצקים סרט פרפין לתוך צלחת שש באר פיפטה שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיום מחומם מראש המכיל 10 micromolar Y-27632 דיהידרוכלוריד לתוך כל באר תוך צחצוח בעדינות חרוזים את הסרט פרפין. כדי לעבד את האורגנואידים להיסטולוגיה, הסר את התקשורת הקיימת מה באר דואג לא לזמן את כיפות קרום המרתף. מוסיפים נפח שווה של פתרון שחזור תאים ו דגירה את הצלחת במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, לנתק את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ולמחוץ אותו עם קצה פיפטה. לאסוף את הכיפה דיסוציאציה ואת פתרון שחזור התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant ולהניח אותו בצד.שמור את כל supernatants עד השלב הסופי כאשר נוכחות של organoids הוא אישר בנפח הרצוי של PBS קר בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לסלק מכנית את גלולה מבלי לשבש את האורגנואידים. חזור על הצנטריפוגה והסר את העל-טבעי. תקן את גלולה בנפח תואם של 4% PFA במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר קיבעון, חזור על שלב הצנטריפוגה ושטיפת PBS. ואז לאט להוסיף 200 microliters של חם 2% agarose ומיד אבל בעדינות לנתק את גלולת התא מקיר הצינור מבלי לשבש אותו באמצעות מחט מד 25 מחובר מזרק אחד מיליליטר. עבור שיטת ספין למטה agarose, זה קריטי כדי לנתק את גלולת התא מקיר הצינור מיד לאחר הוספת אגרוז באמצעות מחט מד 25.לאחר שהתעוררות התגבשה לחלוטין, נתק אותה מהצינור עם מחט 25 מד המחוברת למזרק מיליליטר אחד והעבר אותו לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. מלאו את הצינור ב-70%אתנול והמשיכו בפרוטוקול המקובל להתייבשות רקמות והטבעת פרפין. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי להקים אורגנואידים 3D מן המטופל נגזר xenograft מודלים של סרטן הערמונית גרורתי העצם, כמו גם ישירות מן הרקמה הסרטנית.האורגנואידים הציגו פנוטיפים שונים שהתבטאו בציסטות, כדורידים ואיברים בעלי מורכבות גבוהה יותר. כיפה שלמה של קרום מרתף אורגנואידים ניתן לראות בתמונה תפורה מ 25 ברזולוציה גבוהה, תמונות הגדלה 10X. כדי להמשיך לחקור את רקמת הגידול, ציטוכימיה immunofluorescent בוצעה על קטע פרפין עבה חמישה מיקרומטר של אורגנואידים מיקוד סמן תא אפיתל בזלת cytokeratin-5, סמן תא אפיתל זוהר cytokeratin-8 ו DAPI.פרוטוקול זה יכול להיות אופטימיזציה עבור יישומים אחרים כגון סופג מערבי, שיתוף תרבות ו cytometry זרימה כדי לחקור את המאפיינים של אורגנואידים 3D ואת ההשפעות של טיפולים תרופתיים. ניסויים אלה יכולים לטפל במנגנונים של עמידות לתרופות והיעילות של טיפולים חדשניים בלבד או בשילוב עם טיפולים נוכחיים. האורגנואידים תלת מימדיים מטכניקה זו שומרים על הטרוגניות בין-נושאית ואינטרה-נושאית ולכן הם מודל מדויק יותר של המחלה בחולים.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים לחקור מנגנונים של עמידות לתרופות, tumorigenesis, גרורות וטיפולים שעשויים להיות צפויים יותר של התקדמות המחלה בחולים ותגובתם לטיפול.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...