Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dalla Leo and Anne Albert Charitable Foundation e dalla JM Foundation. Ringraziamo i membri dell'Università della California San Diego Moores Cancer Center, il Dr. Jing Yang e il Dr. Kay T. Yeung per averci permesso l'uso del loro microtome e Randall French, Dipartimento di Chirurgia per competenze tecniche.

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per l'Università della California di San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Approvazione è stata ricevuta dall'UCSD Institutional Review Board (IRB) per raccogliere campioni chirurgici dai pazienti per scopi di ricerca. Un consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente e un campione chirurgico di metastasi della prostata ossea è stato ottenuto dalla riparazione ortopedica di una frattura p...

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	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

Gli organoidi 3D derivati dalle cellule tumorali della prostata della metastasi ossea del paziente sono ancora relativamente rari. Qui, descriviamo strategie e ulteriore protocollo ottimizzato per stabilire con successo organiidi derivati del paziente 3D seriale (PDO) di BMPC. Inoltre, vengono descritti i protocolli per proteggere gli organoidi in campioni con densità cellulare inferiore per l'analisi IFC e IHC. Fenotipi differenziali sotto forma di cisti, sferoidi e organoidi più complessi indicano che questo protocol...

Gli organoidi colti tridimensionali hanno attirato l'attenzione sul loro potenziale di ricapitolazione dell'architettura in vivo, della funzionalità cellulare e della firma genetica dei loro tessuti originali1,2,3,4,5. Ancora più importante, gli organoidi 3D stabiliti dai tessuti tumorali dei pazienti o dai modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) offrono opportunità inestimabili per comprendere i meccanismi di segnalazione cellulare sulla tumorigenesi e per determinare gli effetti del trattamento farmacologico su ogni popolazione cellulare6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 ha sviluppato un protocollo standard per la creazione di organoidi della prostata umana e murina, che è stato ampiamente adottato nel campo dell'urologia. Inoltre, è stato dedicato uno sforzo significativo per un'ulteriore caratterizzazione degli organoidi 3D e per comprendere i meccanismi dettagliati della tumorigenesi e metastasi4,12,14,15. Oltre al protocollo precedentemente stabilito e ampiamente accettato per le colture di organoidi 3D, descriviamo qui un protocollo passo-passo per la cultura 3D di DOP utilizzando tre diversi metodi di doming in condizioni di coltura ottimizzate.
In questo manoscritto, gli organoidi 3D sono stati stabiliti come un modello ex vivo di cancro alla prostata metastatica ossea (BMPC). Le cellule utilizzate per queste colture provenivano dalla serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) ed erano derivate direttamente dai tessuti tumorali metastatici del cancro della prostata del paziente (PCSD18 e PCSD22) o dai modelli tuminanti xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente (campioni denominati PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Poiché la metastasi ossea spontanea delle cellule tumorali della prostata è rara nei modelli murini geneticamente ingegnerizzati16, abbiamo usato l'iniezione intrafmorale diretta (IF) delle cellule tumorali umane nel maschio Rag2-/-z -/- topi per stabilire i modelli PDX del cancro alla prostata metastatico osseo17.
Una volta che gli organoidi 3D sono stabiliti da cellule tumorali del paziente eterogenee o xenogratraps derivati dal paziente, è essenziale confermare la loro identità come cellule tumorali della prostata e determinare i loro fenotipi nelle colture organoidi 3D. La chimica dell'immunofluorescenza (IFC) consente la visualizzazione dell'espressione proteica in situ in ogni cellula, spesso indicando le potenziali funzioni per specifiche popolazioni cellulari2,4. In generale, i protocolli IFC per la maggior parte dei campioni, inclusi tessuti e cellule, sono semplici e completamente ottimizzati. Tuttavia, la densità cellulare e il numero di organoidi possono essere significativamente inferiori a quelli della coltura convenzionale. Pertanto, il protocollo IFC per gli organoidi richiede passaggi aggiuntivi per garantire una corretta elaborazione e incorporamento in paraffina per tutti gli organoidi nei campioni. Descriviamo ulteriori passaggi per un processo di pre-incorporamento dell'agarose e suggerimenti per etichettare la posizione degli organoidi sezionati sul vetrino che aumenta il tasso di successo di IFC sugli organoidi, soprattutto quando i campioni di organoidi hanno una densità di cellule inferiore a quella desiderata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

La coltura tridimensionale (3D) degli organoidi da campioni tumorali di pazienti umani e modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente del cancro alla prostata, indicati come organoidi derivati dal paziente (DOP), sono una risorsa inestimabile per studiare il meccanismo di tumoraligenesi e metastasi del cancro alla prostata. Il loro principale vantaggio è che mantengono l'eterogeneità genomica e funzionale distintiva del tessuto originale rispetto alle linee cellulari convenzionali che non lo fanno. Inoltre, le colture 3D della DOP possono essere utilizzate per prevedere gli effetti del trattamento farmacologico sui singoli pazienti e sono un passo verso la medicina personalizzata. Nonostante questi vantaggi, pochi gruppi utilizzano abitualmente questo metodo in parte a causa dell'ampia ottimizzazione delle condizioni di coltura DOP che possono essere necessarie per diversi campioni di pazienti. In precedenza abbiamo dimostrato che il nostro modello di metastasi ossea del cancro alla prostata, PCSD1, ha ricapitolato la resistenza della metastasi ossea del donatore alla terapia anti-androgena. Abbiamo usato organoidi 3D PCSD1 per caratterizzare ulteriormente i meccanismi della resistenza anti-androgeni. Seguendo una panoramica degli studi attualmente pubblicati sui modelli PDX e DOP, descriviamo un protocollo passo-passo per la cultura 3D della DOP utilizzando sfere a cupola o galleggianti in terra seminterrato (ad esempio, Matrigel) in condizioni di cultura ottimizzate. Vengono descritti anche l'imaging dei punti in vivo e l'elaborazione cellulare per l'istologia. Questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per altre applicazioni tra cui macchia occidentale, co-cultura, ecc. e può essere utilizzato per esplorare le caratteristiche della PDO coltivata 3D relative alla resistenza ai farmaci, alla tumorigenesi, alle metastasi e alle terapie.

Gli organoidi 3D sono stati stabiliti con successo da un modello di xenotrapianto (PDX) derivato dal paziente di cancro alla prostata metastatica ossea (BMPC) e direttamente dal tessuto del cancro prostatico metastatico dell'osso del paziente (Figura 4). In breve, i nostri modelli PDX di BMPC sono stati stabiliti mediante iniezione intrafemorale (IF) di cellule tumorali nei topi Rag2maschi -/- c-/- e poi i tumori PDX sono stati raccolti ed elaborati come descritto in qu...

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Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Le colture tridimensionali di campioni di BMPC pazienti e xenografi del carcinoma della prostata metastatica ossea mantengono l'eterogeneità funzionale dei loro tumori originali con conseguenti cisti, sferoidi e organoidi complessi simili a tumori. Questo manoscritto fornisce una strategia di ottimizzazione e un protocollo per la cultura 3D di campioni eterogenei derivati dai pazienti e la loro analisi utilizzando IFC.

Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Descriviamo strategie e protocolli passo-passo per stabilire organoidi seriali derivati dal paziente 3D del cancro alla prostata metastatico osseo. I nostri protocolli ottimizzati sono pratici per impostare colture 3D per esperimenti utilizzando materiale di partenza limitato direttamente da pazienti o tessuti tumorali xenograft derivati dal paziente. Gli organoidi 3D di questo protocollo possono essere utilizzati come modelli ex vivo per comprendere i meccanismi di base della patologia del cancro alla prostata metastatica ossea e per testare il trattamento.Il supporto di coltura organoide 3D in questo protocollo è specifico per le cellule derivate dalla prostata. Altre parti dei nostri protocolli sono applicabili a diversi tipi di tessuti tumorali e siti metastatici. La tecnica di doming può rivelarsi la parte più difficile di questo processo.La pratica della tecnica di cupola garantirà una dimensione costante della miscela a cupola di organoidi, mezzi e Matrigel e ridurrà al minimo la formazione di bolle durante la sospensione del campione. Dimostrando visivamente questo metodo fornisce una migliore comprensione di come gestire il Matrigel viscoso per coltivare con successo organoidi a bassa densità da un basso numero di cellule. Iniziare riutilizzando il pellet cellulare nel volume appropriato della membrana basale per una configurazione della piastra da 24 poggiamenti.Pipettare delicatamente su e giù per assicurarsi che le cellule vengano rimostrate, quindi pipettare il volume appropriato della sospensione cellulare al centro di una piastra di coltura tissutale preri warmed. Invertire la piastra e posizionarla immediatamente a testa in giù nell'incubatore di coltura cellulare impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 15 minuti. Pipettare il volume appropriato di mezzo prerischiato contenente 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro in ogni pozzo.Per formare una cupola galleggiante dalla cupola rotonda attaccata, staccare la cupola dalla piastra usando un raschietto per celle. Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina da due per quattro pollici e posizionarlo sopra i divot di una punta vuota che tiene rack da una scatola di punta in pipetta di plastica da un millilitro. Utilizzare un dito indice guantato per premere delicatamente il film di paraffina per rintracciare i divot facendo attenzione a non sfondare il film.Spruzzare il film di paraffina con 70%etanolo e accendere la lampada UV nel cappuccio di coltura cellulare per sterilizzare il film preparato per almeno 30 minuti. Nel frattempo, ha rimescolato le cellule pre-lavorate in 20 microlitri di membrana basale. Quindi pipettare la sospensione nei divots formati nel film di paraffina.Posizionare le perline solidificate e la pellicola di paraffina in una piastra a sei pozzi e pipetta da tre a cinque millilitri di mezzo prerimolato contenente 10 micromolare Y-27632 diidrocloruro in ogni pozzo mentre si spazzolano delicatamente le perline dal film di paraffina. Per elaborare gli organoidi per l'istologia, rimuovere i supporti esistenti dal pozzo facendo attenzione a non aspirare le cupole a membrana del seminterrato. Aggiungere un volume uguale di soluzione di recupero cellulare e incubare la piastra per 60 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione, spodesare la cupola della membrana basale usando una pipetta e schiacciarla con una punta di pipetta. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 300 volte g in quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante e rlo da parte.Salvare tutti i supernaganti fino alla fase finale quando la presenza di organoidi è confermata al volume desiderato di PBS freddo e pipettare delicatamente su e giù per rimuovere meccanicamente il pellet senza interrompere gli organoidi. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il supernatante. Fissare il pellet in un volume abbinato del 4%PFA per 60 minuti a temperatura ambiente.Dopo la fissazione, ripetere il passaggio di centrifugazione e il lavaggio PBS. Quindi aggiungere lentamente 200 microlitri di agarosio caldo al 2% e staccare immediatamente ma delicatamente il pellet cellulare dalla parete del tubo senza interromperlo utilizzando un ago calibro 25 attaccato a una siringa da un millilitro. Per il metodo di spin down dell'agarosio, è fondamentale staccare il pellet cellulare dalla parete del tubo subito dopo aver aggiunto agarosio utilizzando un ago calibro 25.Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, staccarlo dal tubo con un ago calibro 25 attaccato a una siringa da un millilitro e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Riempire il tubo con il 70% di etanolo e procedere con il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'incorporamento della paraffina. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per stabilire organoidi 3D da modelli di xenograft derivati dal paziente di cancro alla prostata metastatica ossea e direttamente dal tessuto tumorale.Gli organoidi mostravano diversi fenotipi che si manifestavano come cisti, sferoidi e organoidi di maggiore complessità. Un'intera cupola di membrana basale e organoidi può essere vista in un'immagine cucita da 25 immagini di ingrandimento ad alta risoluzione e 10X. Per indagare ulteriormente il tessuto tumorale, la citochimica immunofluorescente è stata eseguita su una sezione di paraffina spessa cinque micrometri di organoidi mirati al marcatore cellulare epiteliale basale citokeratina-5, marcatore di cellule epiteliali luminali citokeratina-8 e DAPI.Questo protocollo può essere ottimizzato per altre applicazioni come l'assorbimento occidentale, la co-coltura e la citometria del flusso per esplorare le caratteristiche degli organoidi 3D e gli effetti dei trattamenti farmacologici. Questi esperimenti potrebbero riguardare meccanismi di resistenza ai farmaci e l'efficacia di nuove terapie da sole o in combinazione con le terapie attuali. Gli organoidi 3D di questa tecnica mantengono l'eterogeneità tra soggetti e intra-soggetti e quindi sono un modello più accurato della malattia nei pazienti.Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare meccanismi di resistenza ai farmaci, tumorigenesi, metastasi e terapie che possono essere più prevedibili della progressione della malattia nei pazienti e della loro risposta alla terapia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Maggiore vitalità per le colture di idrogel 3D ex vivo di xenoinnesti derivati dal paziente in una piattaforma microfluidica perfusa

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...