Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

この研究は、レオとアンアルバート慈善財団とJM財団によって支援されました。カリフォルニア大学サンディエゴ・ムーアズがんセンターのメンバー、ジンヤン博士、ケイ・T・ヨン博士は、マイクロトームとランドール・フレンチ外科部の技術的専門知識を利用してくれたことに感謝します。

この研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校(UCSD)機関審査委員会(IRB)のガイドの勧告に厳密に従って行われました。IRB #090401承認は、UCSD機関審査委員会(IRB)から、研究目的で患者から外科検体を収集するために受け取りました。各患者からインフォームド・コンセントを得て、手術骨前立腺癌転移標本は大腿骨の病的骨折の整形外科修復から得られた。動物プロトコルは、カリフォルニア...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

前立腺癌細胞の骨転移に由来する3Dオルガノイドは、依然として比較的稀である。ここでは、BMPCのシリアル3D患者由来オルガノイド(PTO)を正常に確立するための戦略およびさらに最適化されたプロトコルについて説明する。さらに、プロトコルはIFCおよびIHC分析のための低い細胞密度のサンプルのオルガノイドを確保するために記述されている。嚢胞、回転楕円体およびより複雑なオルガノイ...

三次元培養オルガノイドは、生体内アーキテクチャ、細胞機能性および元の組織の遺伝的シグネチャを再現する可能性に注目されている1,2,3,4,5.最も重要なことは、患者腫瘍組織または患者由来異種移植片(PDX)モデルから確立された3Dオルガノイドは、腫瘍形成に関する細胞シグナル伝達のメカニズムを理解し、各細胞集団6、7、8、9、10、11、12、13に対する薬物治療の効果を決定する貴重な機会を提供する。Drostら5は泌尿器科の分野で広く採用されているヒトおよびマウス前立腺オルガノイドの確立のための標準プロトコルを開発した。また、3Dオルガノイドのさらなる特徴付けに多大な努力が行われ、腫瘍形成および転移の詳細なメカニズムを理解するために4,12,14,15.3D オルガノイド培養のための以前に確立され、広く受け入れられているプロトコルに加えて、我々は最適化された培養条件の3つの異なるドミン法を用いてPDOの3D培養のためのステップバイステップのプロトコルをここに記述する。
本稿では、3Dオルガノイドを骨転移性前立腺癌(BMPC)の元生体モデルとして確立した。これらの培養物に使用される細胞は、前立腺癌サンディエゴ(PCSD)シリーズから来て、患者前立腺癌骨転移性腫瘍組織(PCSD18およびPCSD22)または患者由来異種移植片(PDX)腫瘍モデル(PCSD1、PCSD13、およびPCSD17という名前のサンプル)から直接得られた。前立腺癌細胞の自発的な骨転移は遺伝子組み換えマウスモデル16ではまれであるため、ヒト腫瘍細胞の雄Rag2---γc-/-マウスへの直接の大腿内注射を使用して、骨転移性前立腺癌のPDXモデルを確立した17。
異種患者腫瘍細胞または異種移植片由来の患者から3Dオルガノイドが確立されたら、前立腺腫瘍細胞としての同一性を確認し、3Dオルガノイド培養でそれらの表現型を決定することが不可欠です。免疫蛍光化学(IFC)は、各細胞におけるその中のタンパク質発現の可視化を可能にし、特定の細胞集団2、4に対する潜在的な機能を示すことが多い。一般に、組織や細胞を含むサンプルの大部分に対するIFCプロトコルは、簡単で完全に最適化されています。しかし、細胞密度およびオルガノイドの数は、従来の培養物よりも有意に低くすることができる。したがって、オルガノイドのIFCプロトコルは、サンプル内のすべてのオルガノイドのパラフィンに適切な処理と埋め込みを確実にするために追加のステップを必要とします。アガロースの埋め込み前プロセスの追加手順と、特にオルガノイドのサンプルが所望よりも低い細胞密度を有する場合に、オルガノイド上のIFCの成功率を増加させるスライド上のセクション化オルガノイドの位置を標識するヒントを説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

ヒト患者の腫瘍標本からのオルガノイドの三次元(3D)培養および前立腺癌の患者由来異種移植片(PDX)モデルは、患者由来オルガノイド(PDO)と呼ばれ、そのメカニズムを研究するための貴重な資源である。前立腺癌の腫瘍形成と転移。彼らの主な利点は、彼らがそうしない従来の細胞株と比較して、元の組織の特徴的なゲノムと機能的不均一性を維持することです。さらに、PDOの3D培養は、個々の患者に対する薬物治療の影響を予測するために使用することができ、パーソナライズされた医療への一歩です。これらの利点にもかかわらず、いくつかのグループは、異なる患者のサンプルに必要な可能性のあるPDO培養条件の広範な最適化のために、この方法を日常的に使用しています。我々は、我々の前立腺癌骨転移PDXモデル、PCSD1が、抗アンドロゲン療法に対するドナー患者の骨転移の抵抗を再現したことを以前に実証した。我々は、PCSD1 3Dオルガノイドを用いて、抗アンドロゲン抵抗性のメカニズムをさらに特徴付けた。PDXおよびPDOモデルの現在発表されている研究の概要に続いて、我々は最適化された培養条件でドーム型または浮遊基基盤膜(例えば、マトリゲル)球を用いたPDOの3D培養のためのステップバイステッププロトコルを記述する。インビボでは、ヒストロジーのための細胞処理と画像化と細胞処理も記載されている。このプロトコルは、ウェスタンブロット、共培養、等を含む他の用途のためにさらに最適化することができ、薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療薬に関する3D培養PDOの特性を探索するために使用することができる。

3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌(BMPC)の由来異種移植片(PDX)モデルから、ならびに患者の骨転移性前立腺癌組織から直接確立された(図4)。簡単に言えば、BMPCのPDXモデルは、大腿内(IF)が雄Rag2----c-----マウスに腫瘍細胞を注入することによって確立され、PDX腫瘍を採取し、この原稿に記載されているように処理した。図4に示すよう...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

患者のBMPC標本および骨転移性前立腺癌の異種移植片の三次元培養は、嚢胞、回転楕円および複雑な腫瘍様オルガノイドをもたらす元の腫瘍の機能的不均一性を維持する。本稿は、異種患者由来サンプルの3D培養とIFCを用いた解析のための最適化戦略とプロトコルを提供します。

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

骨転移性前立腺癌の連続3D患者由来オルガノイドを確立するための戦略とステップバイステッププロトコルについて述べています。当社の最適化されたプロトコルは、患者または患者由来の異種移植片腫瘍組織から直接限られた出発物質を使用して実験のための3D培養を設定するために実用的です。このプロトコルの3Dオルガノイドは、骨転移性前立腺癌病理の基本的なメカニズムを理解し、治療をテストするためにex vivoモデルとして使用することができます。このプロトコルの3Dオルガノイド培養培地は、前立腺由来細胞に特異的である。私たちのプロトコルの他の部分は、腫瘍組織および転移部位の異なるタイプに適用可能である。ドミン技術は、このプロセスの中で最も困難な部分であることが証明されるかもしれません。ドーム型の技術を実践することで、オルガノイド、メディア、マトリゲルのドーム型混合物の一貫したサイズが保証され、サンプル懸濁液中の気泡の形成を最小限に抑えることができます。この方法を視覚的に実証することで、低密度の細胞から低密度オルガノイドをうまく培養するための粘性マトリゲルの扱い方をよりよく理解できます。24ウェルプレートの設定のために、細胞ペレットを適切な量の原膜に再懸濁させることから始めます。ピペットは、細胞が再懸濁されることを確実にするために穏やかに上下し、その後、細胞懸濁液の適切な体積を、事前に温めた組織培養プレートの中央にピペットします。プレートを反転し、37°Cに設定された細胞培養インキュベーターに逆さまにして、15分間5%の二酸化炭素を置きます。ピペットは、各ウェルに10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含む適切な体積の予熱された培地を含む。付属の円形ドームから浮動ドームを形成するには、セルスクレーパーを使用してプレートからドームを取り外します。パラフィンフィルムを2枚4インチ切り、1ミリリットルのプラスチックピペットチップボックスから空の先端保持ラックのディボットの上に置きます。手袋をした人差し指を使ってパラフィンフィルムを軽く押し下げて、フィルムを突破しないように注意してディボットを追跡します。パラフィンフィルムに70%エタノールをスプレーし、細胞培養フードのUVランプをオンにして、少なくとも30分間、調製したフィルムを殺菌します。一方、前処理された細胞を20マイクロリットルの地下膜に再懸濁させる。その後、パラフィンフィルムに形成されたディボットに懸濁液をピペットする。固化ビーズとパラフィンフィルムを6ウェルプレートに入れ、10マイクロモルY-27632ジヒドロクロリドを含むプリウォーム培地を3~5ミリリットルのプリホットル培地に入れ、パラフィンフィルムからビーズを軽くブラッシングします。組織学のためのオルガノイドを処理するには、地下膜ドームを吸引しないように注意して井戸から既存の培地を取り除きます。等量の細胞回収液を加え、プレートを摂氏4度で60分間インキュベートします。インキュベーション後、ピペットを使用して地下膜ドームを外し、ピペットチップで粉砕します。解ciaされたドームと細胞回収液を1.5ミリリットルチューブに回収します。チューブを摂氏4度で300倍にして5分間遠心し、上清を取り除いて脇に置きます。オルガノイドの存在が冷たいPBSの所望の容積で確認され、オルガノイドを中断することなくペレットを機械的に取り除くために穏やかにピペットが上下に確認されたとき、最後のステップまですべての上澄み物を保存します。遠心分離を繰り返し、上清を取り除く。ペレットを室温で60分間4%PFAの一致したボリュームに固定します。固定後、遠心分離工程とPBS洗浄を繰り返します。その後、ゆっくりと暖かい2%アガロースの200マイクロリットルを追加し、すぐに、穏やかに1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージ針を使用してそれを中断することなく、チューブ壁から細胞ペレットを取り外します。アガローススピンダウン法では、25ゲージ針を用いてアガロースを添加した直後に、細胞ペレットをチューブの壁から取り外す必要があります。アガロースが完全に固まったら、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針でチューブから取り外し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。70%エタノールでチューブを充填し、組織脱水およびパラフィン埋め込みのための従来のプロトコルを進めます。このプロトコルは、骨転移性前立腺癌の患者由来の異種移植片モデルから、また癌組織から直接3Dオルガノイドを確立するために成功した。オルガノイドは、嚢胞、スフェロイド、およびより複雑なオルガノイドとして現れる異なる表現型を示した。地下膜とオルガノイドのドーム全体が、25の高解像度、10倍の拡大画像からステッチされた画像で見ることができます。さらに腫瘍組織を調査するために、免疫蛍光細胞化学は、基底上皮細胞マーカーサイトケラチン-5、ルミナル上皮細胞マーカーサイトケラチン-8およびDAPIを標的とするオルガノイドの5マイクロメートル厚いパラフィンセクションに対して行った。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング、共培養、フローサイトメトリーなどの他のアプリケーションに最適化して、3Dオルガノイドの特性と薬物治療の効果を探求することができます。これらの実験は、薬剤耐性のメカニズムと、単独で、または現在の治療法と組み合わせて新しい治療法の有効性に対処することができます。この技術の3Dオルガノイドは、対象間および被験体内の異質性を保持し、したがって患者における疾患のより正確なモデルである。この技術は、研究者が患者の疾患進行と治療への応答をより予測可能にする可能性のある薬剤耐性、腫瘍形成、転移および治療のメカニズムを探求する道を開く。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...