Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
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이 연구는 레오와 앤 앨버트 자선 재단과 JM 재단에 의해 지원되었다. 우리는 캘리포니아 샌디에고 무어암 센터 회원, Jing Yang 박사 및 케이 T. Yeung 박사가 기술 전문 지식에 대한 수술학과의 마이크로토메와 랜달 프랑스어의 사용을 허용해 주신 것에 대해 감사드립니다.

이 연구는 캘리포니아 샌디에이고 대학 (UCSD) 기관 검토 위원회 (IRB)에 대한 가이드의 권고에 따라 엄격하게 수행되었다. IRB #090401 승인은 UCSD 기관 검토 위원회 (IRB)에서 연구 목적을 위해 환자에게서 외과 견본을 집합하기 위하여 수신되었습니다. 각 환자로부터 동의를 얻어 외과용 뼈 전립선암 전이 시편은 대퇴골의 병리학적 골절의 정형외과적 수리로부터 얻어졌다. 동물 프로토콜은 캘리포니?...

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	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

환자 뼈 전이 전립선 암 세포에서 파생 된 3D 오르가노이드는 여전히 상대적으로 드뭅니다. 여기서는 BMPC의 직렬 3D 환자 유래 오르가노이드(PSO)를 성공적으로 확립하기 위한 전략과 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 IFC 및 IHC 분석을 위해 더 낮은 세포 밀도를 가진 샘플에서 오르가노이드를 고정하기 위해 설명된다. 낭종, 스페로이드 및 더 복잡한 오르가노이드의 형태로 차동 표...

3차원 배양 오르가노이드는 생체 내 아키텍처, 세포 기능 및 그들의 원래 조직의 유전적 서명을 되풀이할 수 있는 잠재력에 대해 관심을 끌고 있다1,2,3,4,5. 가장 중요한 것은, 환자 종양 조직 또는 환자 유래 이종이식 (PDX) 모델에서 설립 된 3D organoids는 종양 발생시 세포 신호의 메커니즘을 이해하고 각 세포집단6, 7,8,9,10,11,12,13에대한 약물 치료의 효과를 결정하는 귀중한 기회를 제공한다. Drost 등 5 는 비뇨기과 분야에서 널리 채택된 인간 및 마우스 전립선 오르가노이드의 확립을위한 표준 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 3D 오르가노이드의 추가 특성화및 종양발생 및 전이의 상세한 기전을 이해하기 위해상당한 노력이 전념되어 왔다4,12,14,15. 3D 오르가노이드 배양에 대한 이전에 확립되고 널리 인정된 프로토콜 외에도 최적화된 배양 조건에서 세 가지 다른 도밍 방법을 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다.
이 원고에서, 3D 오르가노이드는 뼈 전이성 전립선암 (BMPC)의 ex vivo 모형으로 설치되었습니다. 이러한 배양에 사용되는 세포는 전립선암 샌디에이고(PCSD) 계열로부터 유래되었으며 환자 전립선암 뼈 전이성 종양 조직(PCSD18 및 PCSD22) 또는 환자 유래 이종이식(PDX) 종양 모델(PCSD1, PCSD13 및 PCSD17)으로부터 직접 유래하였다. 전립선암 세포의 자발적인 골 전이는 유전자 조작 마우스모델(16)에서드물기 때문에, 우리는 인간 종양 세포를 남성Rag2-/-γc-/- 마우스로 직접 대퇴내 주사하여 뼈 전이성 전립선암의 PDX 모델을확립하였다 17.
일단 3D 오르가노이드가 이질적인 환자 종양 세포 또는 환자 유래 이종이식에서 확립되면, 전립선 종양 세포로서의 그들의 정체성을 확인하고 3D 오르가노이드 배양에서 그들의 표현형을 결정하는 것이 필수적이다. 면역형광 화학(IFC)은 각 세포에서 의 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하며, 종종 특정 세포 집단에 대한 잠재적인 기능을 나타내는2,4. 일반적으로 조직 및 세포를 포함한 대부분의 시료에 대한 IFC 프로토콜은 간단하고 완전히 최적화되어 있습니다. 그러나, 세포 밀도 및 오르가노이드의 수는 종래의 배양보다 현저히 낮을 수 있다. 따라서, 오르가노이드에 대한 IFC 프로토콜은 샘플의 모든 오르가노이드에 대해 파라핀에 적절한 처리 및 포함을 보장하기 위한 추가 단계가 필요합니다. 우리는 특히 오르가노이드의 샘플이 원하는 것보다 낮은 세포 밀도가있을 때 오르가노이드에 IFC의 성공률을 증가 슬라이드에 단면 오르가노이드의 위치를 표시하는 아가로스 사전 포함 과정에 대한 추가 단계를 설명하고.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

인간 환자의 종양 표본과 환자 유래 이종이식(PDX) 전립선암 모델에서 오가노이드의 3차원(3D) 배양, 환자 유래 오르가노이드(PDO)로 지칭되는, 종양 발생 과 전립선 암의 전이. 그들의 주요 장점은 기존의 세포주와 비교하여 본래 조직의 독특한 게놈 및 기능적 이질성을 유지한다는 것이다. 더욱이, PDO의 3D 배양은 개별 적인 환자에 대한 약물 치료의 효력을 예측하기 위하여 이용될 수 있고 개인화한 약을 향한 단계입니다. 이러한 장점에도 불구하고, 몇몇 단은 다른 참을성 있는 견본을 위해 요구될 수 있는 PDO 문화 조건의 광대한 최적화 때문에 부분적으로 이 방법을 일상적으로 이용합니다. 우리는 이전에 우리의 전립선암 뼈 전이 PDX 모델, PCSD1, 항 안드로겐 치료에 기증자 환자의 뼈 전이의 저항을 재입증했다. 우리는 항 안드로겐 저항의 메커니즘을 더 특성화하기 위해 PCSD1 3D 오르가노이드를 사용했습니다. PDX 및 PDO 모델에 대한 현재 발표된 연구에 대한 개요에 따라 최적화된 배양 조건에서 돔형 또는 부동 지하 멤브레인(예: Matrigel) 구를 사용하여 PDO의 3D 배양에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 생체 내 스티치 이미징 및 세포 가입은 세포학에 대해서도 설명되어 있다. 이 프로토콜은 웨스턴 블롯, 공동 배양 등을 포함한 다른 응용 분야에 더욱 최적화될 수 있으며 약물 내성, 종양발생, 전이 및 치료법과 관련된 3D 배양 PDO의 특성을 탐구하는데 사용될 수 있다.

3D 오르가노이드는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델인 골전이성 전립선암(BMPC)뿐만 아니라 환자 골전이성 전립선암 조직으로부터 직접 적으로 확립되었다(그림4). 간단히, BMPC의 우리의 PDX 모델은 남성 Rag2-/- c-/- 마우스로 종양 세포의 대퇴 내 (IF) 주입에 의해 설립된 다음 PDX 종양을 수확하고 이 원고에 기술된 대로 처리하였다. 그림 4에도?...

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Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

환자 BMPC 견본및 뼈 전이성 전립선암의 이종이식의 3차원 배양은 낭종, 스페로이드 및 복잡한, 종양 같이 organoids의 결과로 그들의 본래 종양의 기능적인 이질성을 유지합니다. 이 원고는 IFC를 사용하여 이기종 환자 유래 샘플 및 이들의 분석의 3D 배양에 대한 최적화 전략 및 프로토콜을 제공한다.

환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종이식에서 파생된 3차원(3D) 오르가노이드의 설립 및 분석

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

우리는 뼈 전이성 전립선암의 직렬 3D 환자 파생 오르가노이드를 확립하기 위한 전략및 단계별 프로토콜을 기술합니다. 당사의 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 xenograft 종양 조직에서 직접 제한된 시작 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양을 설정하는 것이 실용적입니다. 이 프로토콜에서 3D 오르간로이드는 뼈 전이성 전립선 암 병리학의 기본 메커니즘을 이해하고 치료를 테스트하기 위해 ex vivo 모델로 사용될 수 있습니다.이 프로토콜의 3D 오르간구배기 배지는 전립선 유래 세포에 특이적이다. 우리의 프로토콜의 그밖 부분은 종양 조직 및 전이성 사이트의 다른 모형에 적용됩니다. 도밍 기술은 이 과정에서 가장 어려운 부분일 수 있습니다.도밍 기술을 연습하면 오르가노이드, 미디어 및 마모젤의 돔 혼합물의 일관된 크기를 보장하고 샘플 서스펜션 동안 거품 형성을 최소화합니다. 시각적으로이 방법을 시연하는 것은 성공적으로 세포의 낮은 수에서 낮은 밀도 오르가노이드를 배양하기 위한 점성 마트리겔을 처리하는 방법의 더 나은 이해를 제공합니다. 24웰 플레이트 설정을 위해 지하 멤브레인의 적절한 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단하여 시작합니다.피펫은 세포가 다시 중단되도록 부드럽게 위아래로, 다음 사전 따뜻하게 조직 배양 플레이트의 중심으로 세포 현탁액의 적절한 볼륨을 피펫. 플레이트를 반전시키고 즉시 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 세포 배양 배양에 거꾸로 놓습니다. 피펫은 각각의 우물에 10 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로염화물을 포함하는 미리 데워진 배지의 적절한 부피이다.연결된 둥근 돔에서 부동 돔을 형성하려면 셀 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 돔을 분리합니다. 파라핀 필름을 2x 4인치 자르고 1밀리리터 플라스틱 파이펫 팁 박스에서 선반을 들고 있는 빈 팁의 디봇 위에 놓습니다. 장갑을 낀 검지 손가락을 사용하여 파라핀 필름을 부드럽게 눌러 영화를 돌파하지 않도록 주의를 기울이는 디봇을 추적합니다.파라핀 필름을 70% 에탄올로 분무하고 세포 배양 후드의 UV 램프를 켜서 준비된 필름을 30분 이상 살균한다. 한편, 지하 막의 20 마이크로 리터에서 미리 처리 된 세포를 다시 중단. 그런 다음 파라핀 필름에 형성된 디봇으로 서스펜션을 피펫합니다.고체 구슬과 파라핀 필름을 6웰 플레이트에 넣고 파라핀 필름에서 구슬을 부드럽게 닦으면서 10개의 마이크로몰러 Y-27632 디하이드로클로라이드를 각각 양호에 담아 온전한 매체의 파이펫 3~5밀리리터를 넣습니다. 조직학에 대한 오르가노이드를 처리하려면 지하 멤브레인 돔을 흡인하지 않도록주의하는 우물에서 기존 미디어를 제거하십시오. 동일한 양의 세포 회수 용액을 추가하고 섭씨 4도에서 60 분 동안 플레이트를 배양하십시오.인큐베이션 후 파이펫을 사용하여 지하 멤브레인 돔을 빼내고 파이펫 끝으로 분쇄합니다. 해리된 돔과 세포 회수 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 수집합니다. 5 분 동안 섭씨 4도에서 300 배 g에서 튜브를 원심 분리 한 다음 상체를 제거하고 따로 둡니다.오르가노이드의 존재가 차가운 PBS의 원하는 부피에서 확인될 때까지 모든 초월제를 저장하고 부드럽게 피펫 위아래로 오르가노이드를 방해하지 않고 펠릿을 기계적으로 제거합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 제거합니다. 펠릿을 4%PFA의 일치하는 부피로 실온에서 60분 동안 수정합니다.고정 후 원심분리 단계와 PBS 세척을 반복합니다. 그런 다음 천천히 200 마이크로 리터의 따뜻한 2 % 아가로즈를 추가하고 즉시 하지만 부드럽게 1 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 사용하여 방해하지 않고 튜브 벽에서 세포 펠릿을 분리. 아가로즈 스핀 다운 방법의 경우, 25 게이지 바늘을 사용하여 아가로즈를 첨가한 직후 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 것이 중요합니다.아가로즈가 완전히 굳어지면, 1밀리리터 주사기에 부착된 25 게이지 바늘로 튜브에서 분리하여 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 70%에탄올로 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포함을 위한 기존의 프로토콜을 진행한다. 이 프로토콜은 성공적으로 암 조직에서 직접뿐만 아니라 뼈 전이성 전립선암의 환자 파생 된 xenograft 모델에서 3D 오르가노이드를 확립하는 데 사용되었다.오르가노이드는 낭종, 스페로이드 및 더 높은 복잡성 오르간노이드로 나타나는 다른 표현형을 표시했습니다. 지하 멤브레인과 오르가노이드의 전체 돔은 25 개의 고해상도 10 배율 이미지에서 스티치 된 이미지에서 볼 수 있습니다. 종양 조직을 더욱 조사하기 위해, 면역형광 세포화학은 기저 상피 세포 마커 시토케라틴-5, 발광 상피 세포 마커 시토케라틴-8 및 DAPI를 대상으로 하는 오르가노이드의 5마이크로미터 두께의 파라핀 섹션에서 수행되었다.이 프로토콜은 3D 오르가노이드의 특성과 약물 치료의 효과를 탐구하기 위해 서양 블로팅, 공동 배양 및 유동 세포측정과 같은 다른 응용 분야에 최적화 될 수 있습니다. 이 실험은 약물 저항의 기계장치 및 새로운 치료의 효험을 단독으로 또는 현재 치료와 조합하여 해결할 수 있었습니다. 이 기술의 3D 오르간노이드는 주제 간 및 주제 내 이질성을 유지하므로 환자에서 질병의 보다 정확한 모델입니다.이 기술은 연구원이 환자에서 질병 진행과 치료에 대한 반응의 더 예측 가능 할 수있는 약물 내성, 종양 발생, 전이 및 치료의 메커니즘을 탐구하는 방법을 포장합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

중추신경계 전이의 환자 유래 이종이식 모델의 확립 및 활용

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...