Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Este estudo contou com o apoio da Fundação de Caridade Leo e Anne Albert e da Fundação JM. Agradecemos aos membros do Centro de Câncer da Universidade da Califórnia de San Diego Moores, Dr. Jing Yang e Dr. Kay T. Yeung por nos permitirem o uso de seu microtome e Randall French, Departamento de Cirurgia para perícia técnica.

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Conselho de Revisão Institucional (UCSD) da Universidade da Califórnia em San Diego (UCSD). O IRB #090401 Aprovação foi recebido do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da UCSD para coletar amostras cirúrgicas de pacientes para fins de pesquisa. Um consentimento informado foi obtido de cada paciente e um espécime cirúrgico de metástase do câncer de próstata foi obtido a partir do reparo ortopédico de uma fratura patoló...

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	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

Organoides 3D derivados da metástase óssea paciente células cancerígenas de próstata ainda são relativamente raras. Aqui, descrevemos estratégias e protocolo otimizado para obter organoides derivados de pacientes 3D (PDOs) de BMPC. Além disso, são descritos protocolos para proteger os organoides em amostras com menor densidade celular para análise ifc e IHC. Fenótipos diferenciais na forma de cisto, esferoides e organoides mais complexos indicam que esse protocolo fornece condições culturais que permitem que...

Organoides culturais tridimensionais têm chamado a atenção por seu potencial de recapitular a arquitetura in vivo, funcionalidade celular e assinatura genética de seus tecidos originais1,2,3,4,5. Mais importante, organoides 3D estabelecidos a partir de tecidos tumorais pacientes ou modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) oferecem oportunidades inestimáveis para entender mecanismos de sinalização celular sobre tumorigênese e determinar os efeitos do tratamento medicamentoso em cada população celular6,7,8,9,10,11,12,13. Drost et al.5 desenvolveram um protocolo padrão para o estabelecimento de organoides de próstata humano e rato, que tem sido amplamente adotado no campo da urologia. Além disso, foram dedicados esforços significativos para maior caracterização de organoides 3D e para compreender os mecanismos detalhados de tumorigênese e metástase4,12,14,15. Além do protocolo previamente estabelecido e amplamente aceito para culturas de organoides 3D, descrevemos aqui um protocolo passo a passo para a cultura 3D do PDO usando três métodos de doming diferentes em condições culturais otimizadas.
Neste manuscrito, os organoides 3D foram estabelecidos como um modelo ex vivo de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC). As células utilizadas para essas culturas vieram da série DeSone câncer de próstata San Diego (PCSD) e foram derivadas diretamente de tecidos tumores metastáticos do câncer de próstata paciente (PCSD18 e PCSD22) ou modelos de tumor derivados do paciente (PDX) (amostras chamadas PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Como a metástase óssea espontânea das células cancerígenas da próstata é rara nos modelos de camundongos geneticamente modificados16,usamos injeção intra-femoral direta (IF) de células tumorais humanas em rag2 masculino-/-γc-/- camundongos para estabelecer os modelos PDX de câncer de próstata metastáticoósseo 17.
Uma vez que os organoides 3D são estabelecidos a partir de células tumorais heterogêneas ou xenoenxertos derivados do paciente, é essencial confirmar sua identidade como células tumorais de próstata e determinar seus fenótipos nas culturas organoides 3D. A química da imunofluorescência (IFC) permite a visualização da expressão proteica in situ em cada célula, muitas vezes indicando as funções potenciais para populações específicas de células2,4. Em geral, os protocolos IFC para uma grande maioria das amostras, incluindo tecidos e células, são simples e totalmente otimizados. No entanto, a densidade celular e o número de organoides podem ser significativamente menores do que o da cultura convencional. Portanto, o protocolo IFC para organoides requer etapas adicionais para garantir o processamento adequado e incorporação em parafina para todos os organoides nas amostras. Descrevemos etapas adicionais para um processo de preincorporação de agarose e dicas para rotular a localização de organoides seccionados no slide que aumenta a taxa de sucesso do IFC em organoides especialmente quando as amostras de organoides têm menor densidade celular do que o desejado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

Cultura tridimensional (3D) de organoides de tumores de pacientes humanos e modelos de xenoenxerto derivados do paciente (PDX) de câncer de próstata, referidos como organoides derivados do paciente (PDO), são um recurso inestimável para estudar o mecanismo de câncer de próstata tumorigênese e metástase do câncer de próstata. Sua principal vantagem é que eles mantêm a heterogeneidade genômica e funcional distinta do tecido original em comparação com as linhas celulares convencionais que não. Além disso, culturas 3D de PDO podem ser usadas para prever os efeitos do tratamento medicamentoso em pacientes individuais e são um passo para a medicina personalizada. Apesar dessas vantagens, poucos grupos utilizam rotineiramente esse método em parte devido à ampla otimização das condições culturais pdo que podem ser necessárias para diferentes amostras de pacientes. Demonstramos anteriormente que nosso modelo de Metástase Óssea do câncer de próstata PDX, PCSD1, recapitulou a resistência da metástase óssea do paciente doador à terapia antiandgênica. Usamos organoides PCSD1 3D para caracterizar mais os mecanismos de resistência antiandrogênica. Seguindo uma visão geral dos estudos publicados atualmente dos modelos PDX e PDO, descrevemos um protocolo passo a passo para a cultura 3D de PDO usando esferas de membrana de porão de domed ou flutuante (por exemplo, Matrigel) em condições de cultura otimizadas. Também são descritas imagens de pontos vivos e processamento celular para histologia. Este protocolo pode ser ainda mais otimizado para outras aplicações, incluindo mancha ocidental, co-cultura, etc. e pode ser usado para explorar características do PDO cultivado cultivado em 3D relativos à resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica.

Os organoides 3D foram criados com sucesso a partir de um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PcD) de câncer de próstata metastático ósseo (BMPC), bem como diretamente do tecido do câncer de próstata metastático do paciente(Figura 4). Resumidamente, nossos modelos PDX de BMPC foram estabelecidos por injeção intra-femoral (IF) de células tumorais em rag2 masculino-/- c-/- camundongos e, em seguida, tumores PDX foram colhidos e processados como descrito ...

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Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Descrevemos estratégias e protocolos passo a passo para estabelecer organoides 3D em série derivados do câncer de próstata metastático. Nossos protocolos otimizados são práticos para configurar culturas 3D para experimentos usando material inicial limitado diretamente de pacientes ou tecidos tumorais de xenoenxerto derivados do paciente. Os organoides 3D deste protocolo podem ser usados como modelos ex vivo para entender mecanismos básicos da patologia do câncer de próstata metastático ósseo e para testar o tratamento.A mídia de cultura organoide 3D neste protocolo é específica para células derivadas da próstata. Outras partes de nossos protocolos são aplicáveis a diferentes tipos de tecidos tumorais e locais metastáticos. A técnica de doming pode ser a parte mais difícil deste processo.A prática da técnica de doming garantirá um tamanho consistente da mistura de organoides, mídia e Matrigel, e minimizará a formação de bolhas durante a suspensão da amostra. Demonstrar visualmente este método fornece uma melhor compreensão de como lidar com o Matrigel viscoso para culminar com sucesso organoides de menor densidade a partir de um baixo número de células. Comece reutilizando a pelota de célula no volume apropriado da membrana do porão para uma configuração de placa de 24 poços.Pipeta para cima e para baixo suavemente para garantir que as células sejam resuspended, em seguida, pipeta o volume apropriado da suspensão celular para o centro de uma placa de cultura de tecido pré-aquecido. Inverta a placa e coloque-a imediatamente de cabeça para baixo na incubadora de cultura celular fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Pipeta o volume apropriado de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloreto em cada poço.Para formar uma cúpula flutuante da cúpula redonda anexada, retire a cúpula da placa usando um raspador de células. Corte um pedaço de dois por quatro polegadas de filme de parafina e coloque-o em cima dos divots de uma ponta vazia segurando rack de uma caixa de ponta de pipeta de plástico de um mililitro. Use um dedo indicador de luvas para pressionar suavemente o filme de parafina para rastrear os divots tomando cuidado para não romper o filme.Pulverize o filme de parafina com 70% de etanol e ligue a lâmpada UV no capô da cultura celular para esterilizar o filme preparado por pelo menos 30 minutos. Enquanto isso, resuspense as células pré-processadas em 20 microliters de membrana do porão. Em seguida, pipeta a suspensão para os divots formados no filme de parafina.Coloque as contas solidificadas e o filme de parafina em uma placa de seis poços e pipeta de três a cinco mililitros de meio pré-aquecido contendo 10 micromolar Y-27632 dihidrocloida em cada poço enquanto escova suavemente as contas do filme de parafina. Para processar os organoides para histologia, remova a mídia existente do poço tomando cuidado para não aspirar as cúpulas de membrana do porão. Adicione um volume igual de solução de recuperação celular e incubar a placa por 60 minutos a quatro graus Celsius.Após a incubação, desaloja a cúpula da membrana do porão usando uma pipeta e esmague-a com uma ponta de pipeta. Colete a cúpula dissociada e a solução de recuperação celular em um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 300 vezes g em quatro graus Celsius por cinco minutos, em seguida, remova o supernante e reserve-o.Guarde todos os supernantes até o passo final quando a presença de organoides for confirmada no volume desejado de PBS frio e pipeta suavemente para cima e para baixo para desalojar mecanicamente a pelota sem interromper os organoides. Repita a centrifugação e remova o sobrenatante. Fixar a pelota em um volume combinado de 4%PFA por 60 minutos em temperatura ambiente.Após a fixação, repita a etapa de centrifugação e a lavagem do PBS. Em seguida, adicione lentamente 200 microliters de 2%de agarose quente e imediatamente, mas suavemente desprender a pelota celular da parede do tubo sem interrompê-la usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro. Para o método de rotação de garose, é fundamental separar a pelota celular da parede do tubo logo após a adição de agarose usando uma agulha de calibre 25.Uma vez que a agarose tenha se solidificado completamente, retire-a do tubo com uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de um mililitro e transfira-a para um novo tubo de 1,5 mililitro. Encha o tubo com 70% de etanol e proceda com o protocolo convencional de desidratação tecidual e incorporação de parafina. Este protocolo foi usado com sucesso para estabelecer organoides 3D de modelos de xenoenxerto derivados do paciente do câncer de próstata metastático ósseo, bem como diretamente do tecido cancerígeno.Os organoides apresentaram diferentes fenótipos que se manifestaram como cistos, esferoides e organoides de maior complexidade. Uma cúpula inteira de membrana de porão e organoides pode ser vista em uma imagem costurada a partir de 25 imagens de ampliação de alta resolução e 10X. Para investigar melhor o tecido tumoral, a citoquímica imunofluorescente foi realizada em uma seção de cinco micrômetros de parafina de organoides visando o marcador de células epiteliais basais citokeratin-5, marcador de célula epitelial luminal cytokeratin-8 e DAPI.Este protocolo pode ser otimizado para outras aplicações como manchas ocidentais, cocultura e citometria de fluxo para explorar características de organoides 3D e os efeitos dos tratamentos medicamentosos. Esses experimentos poderiam abordar mecanismos de resistência a medicamentos e a eficácia de novas terapêuticas isoladamente ou em combinação com as terapias atuais. Os organoides 3D desta técnica retêm heterogeneidade entre sujeitos e intra-sujeitos e, portanto, são um modelo mais preciso da doença em pacientes.Essa técnica abre caminho para que os pesquisadores explorem mecanismos de resistência a medicamentos, tumorigênese, metástase e terapêutica que podem ser mais previsíveis da progressão da doença em pacientes e sua resposta à terapia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Pesquisa do câncer

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Estabelecimento e Utilização de Modelos de Xenoenxerto de Metástases do Sistema Nervoso Central Derivados de Pacientes

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...