Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación Caritativa Leo y Anne Albert y la Fundación JM. Agradecemos a los miembros del Centro Oncológico de la Universidad de California En San Diego Moores, el Dr. Jing Yang y el Dr. Kay T. Yeung por permitirnos el uso de su microtome y Randall French, Departamento de Cirugía para la experiencia técnica.

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de California en San Diego (UCSD). IRB #090401 La aprobación fue recibida de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCSD para recolectar muestras quirúrgicas de pacientes con fines de investigación. Se obtuvo un consentimiento informado de cada paciente y se obtuvo una muestra de metástasis quirúrgica de cáncer de próstata ósea a partir de la reparación ortopédica d...

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	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

Los organoides 3D derivados de las células de cáncer de próstata de metástasis ósea del paciente son todavía relativamente raros. Aquí, describimos estrategias y protocolo optimizado para establecer con éxito organoides derivados de pacientes 3D en serie (DOP) de BMPC. Además, los protocolos se describen para asegurar los organoides en muestras con menor densidad celular para el análisis ifC e IHC. Los fenotipos diferenciales en forma de quiste, esferoides y organoides más complejos indican que este protocolo ...

Los organoides cultivados tridimensionales han llamado la atención por su potencial para recapitular la arquitectura in vivo, la funcionalidad celular y la firma genética de sus tejidos originales1,2,3,4,5. Lo más importante es que los organoides 3D establecidos a partir de tejidos tumorales de pacientes o modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) proporcionan oportunidades inestimables para comprender los mecanismos de señalización celular sobre la tumorigenesis y determinar los efectos del tratamiento farmacológico en cada población celular6,7,8,9,10,11,12,13. 5 desarrolló un protocolo estándar para el establecimiento de organoides de próstata humanos y de ratón, que ha sido ampliamente adoptado en el campo de la urología. Además, se ha dedicado un esfuerzo significativo para una mayor caracterización de los organoides 3D y para comprender los mecanismos detallados de la tumorigenesis y la metástasis4,12,14,15. Además del protocolo previamente establecido y ampliamente aceptado para las culturas de organoides 3D, aquí describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando tres métodos de doming diferentes en condiciones de cultivo optimizadas.
En este manuscrito, los organoides 3D se establecieron como un modelo ex vivo de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC). Las células utilizadas para estos cultivos provenían de la serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) y se derivaron directamente de los tejidos tumorales metastásicos del cáncer de próstata del paciente (PCSD18 y PCSD22) o de los modelos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) (muestras denominadas PCSD1, PCSD13 y PCSD17). Debido a que la metástasis ósea espontánea de las células cancerosas de próstata es poco frecuente en los modelos de ratón genéticamente modificados16, utilizamos la inyección directa intrafemoral (IF) de células tumorales humanas en machos Rag2-/-c-/- ratones para establecer los modelos PDX del cáncer de próstata metastásico óseo17.
Una vez que los organoides 3D se establecen a partir de células tumorales de pacientes heterogéneos o xenoinjertos derivados del paciente, es esencial confirmar su identidad como células tumorales de próstata y determinar sus fenotipos en los cultivos organoides 3D. La química de la inmunofluorescencia (IFC) permite la visualización de la expresión proteica in situ en cada célula, a menudo indicando las funciones potenciales para poblaciones celulares específicas2,4. En general, los protocolos IFC para una gran mayoría de muestras, incluidos los tejidos y las células, son sencillos y están totalmente optimizados. Sin embargo, la densidad celular y el número de organoides pueden ser significativamente menores que la del cultivo convencional. Por lo tanto, el protocolo IFC para organoides requiere pasos adicionales para asegurar el procesamiento adecuado y la inserción en parafina para todos los organoides en las muestras. Describimos pasos adicionales para un proceso de preincrustación de agarosa y consejos para etiquetar la ubicación de organoides seccionados en la diapositiva que aumenta la tasa de éxito de IFC en organoides, especialmente cuando las muestras de organoides tienen menor densidad celular de la deseada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

El cultivo tridimensional (3D) de organoides a partir de muestras tumorales de pacientes humanos y modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata, conocidos como organoides derivados del paciente (DOP), son un recurso invaluable para estudiar el mecanismo de tumorigenesis y metástasis del cáncer de próstata. Su principal ventaja es que mantienen la heterogeneidad genómica y funcional distintiva del tejido original en comparación con las líneas celulares convencionales que no lo hacen. Además, los cultivos 3D de DOP se pueden utilizar para predecir los efectos del tratamiento farmacológico en pacientes individuales y son un paso hacia la medicina personalizada. A pesar de estas ventajas, pocos grupos utilizan rutinariamente este método en parte debido a la amplia optimización de las condiciones de cultivo de DOP que pueden ser necesarias para diferentes muestras de pacientes. Anteriormente demostramos que nuestro modelo PDX de metástasis ósea de cáncer de próstata, PCSD1, recapitulaba la resistencia de la metástasis ósea del paciente donante a la terapia antiandrógeno. Utilizamos organoides PCSD1 3D para caracterizar aún más los mecanismos de resistencia a los antiandrógenos. Siguiendo una visión general de los estudios publicados actualmente de los modelos PDX y PDO, describimos un protocolo paso a paso para el cultivo 3D de DOP utilizando esferas de membrana de sótano abovedada o flotante (por ejemplo, Matrigel) en condiciones de cultivo optimizadas. También se describen las imágenes de puntadas in vivo y el procesamiento celular para histología. Este protocolo se puede optimizar aún más para otras aplicaciones, incluyendo la mancha occidental, la cocultura, etc. y se puede utilizar para explorar las características de la DOP cultivada en 3D relacionadas con la resistencia a los medicamentos, la tumorigenesis, la metástasis y las terapias.

Los organoides 3D se establecieron con éxito a partir de un modelo de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) de cáncer de próstata metastásico óseo (BMPC), así como directamente del tejido de cáncer de próstata metastásico del paciente(Figura 4). Brevemente, nuestros modelos PDX de BMPC fueron establecidos por inyección intra-femoral (IF) de células tumorales en machos Rag2-/- c-/- ratones y luego los tumores PDX fueron cosechados y procesados como se descri...

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Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Los cultivos tridimensionales de muestras BMPC pacientes y xenoinjertos de cáncer de próstata metastásico óseo mantienen la heterogeneidad funcional de sus tumores originales, lo que resulta en quistes, esferoides y organoides complejos similares a tumores. Este manuscrito proporciona una estrategia de optimización y protocolo para el cultivo 3D de muestras derivadas de pacientes heterogéneos y su análisis utilizando IFC.

Establecimiento y Análisis de Organoides Tridimensionales (3D) Derivados de los Especímenes de Metastasis ósea del Cáncer de Próstata del Paciente y sus Xenoinjertos

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Describimos estrategias y protocolos paso a paso para establecer organoides seriales derivados del paciente 3D de cáncer de próstata metastásico óseo. Nuestros protocolos optimizados son prácticos para configurar cultivos 3D para experimentos utilizando material de partida limitado directamente de pacientes o tejidos tumorales de xenoinjerto derivados del paciente. Los organoides 3D de este protocolo se pueden utilizar como modelos ex vivo para comprender los mecanismos básicos de la patología del cáncer de próstata metastásico óseo y para probar el tratamiento.El medio de cultivo organoide 3D en este protocolo es específico para las células derivadas de la próstata. Otras partes de nuestros protocolos son aplicables a diferentes tipos de tejidos tumorales y sitios metastásicos. La técnica de doming puede resultar ser la parte más difícil de este proceso.La práctica de la técnica de doming asegurará un tamaño constante de la mezcla abovedada de organoides, medios y Matrigel, y minimizará la formación de burbujas durante la suspensión de la muestra. Demostrar visualmente este método proporciona una mejor comprensión de cómo manejar el Matrigel viscoso para el cultivo con éxito organoides de menor densidad de un bajo número de células. Comience por resuspending el pellet celular en el volumen adecuado de membrana del sótano para una configuración de placa de 24 pozos.Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para asegurarse de que las células se resuspenden, luego pipetear el volumen apropiado de la suspensión celular en el centro de una placa de cultivo de tejido precalentó. Invierta la placa e inmediatamente colóquela boca abajo en la incubadora de cultivo celular establecida en 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Pipetear el volumen adecuado de medio precalegado que contenga 10 micromolares Y-27632 dihidrocloruro en cada pozo.Para formar una cúpula flotante de la cúpula redonda adjunta, separe la cúpula de la placa utilizando un rascador de celda. Corte una pieza de dos por cuatro pulgadas de película de parafina y colóquela encima de los divots de un estante de sujeción de punta vacía de una caja de punta de pipeta de plástico de un mililitro. Utilice un dedo índice enguantado para presionar suavemente hacia abajo en la película de parafina para trazar los divots teniendo cuidado de no romper a través de la película.Rocíe la película de parafina con 70% de etanol y encienda la lámpara UV en la campana de cultivo celular para esterilizar la película preparada durante al menos 30 minutos. Mientras tanto, resuspender las células preprocesadas en 20 microlitros de membrana del sótano. A continuación, pipetear la suspensión en los divots formados en la película de parafina.Coloque las perlas solidificadas y la película de parafina en una placa de seis pozos y pipetee de tres a cinco mililitros de medio precalentado que contenga 10 micromolares Y-27632 dihidrocloruro en cada pozo mientras cepilla suavemente las cuentas de la película de parafina. Para procesar los organoides para la histología, retire los medios existentes del pozo teniendo cuidado de no aspirar las cúpulas de membrana del sótano. Añadir un volumen igual de solución de recuperación celular e incubar la placa durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la incubación, desalojar la cúpula de membrana del sótano con una pipeta y aplastarla con una punta de pipeta. Recoger la cúpula disociada y la solución de recuperación celular en un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 300 veces g en cuatro grados Centígrados durante cinco minutos, luego retire el sobrenadante y dejó a un lado.Guarde todos los sobrenadantes hasta el paso final cuando se confirme la presencia de organoides en el volumen deseado de PBS frío y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para desalojar mecánicamente el pellet sin interrumpir los organoides. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. Fijar el pellet en un volumen igualado de 4%PFA durante 60 minutos a temperatura ambiente.Después de la fijación, repita el paso de centrifugación y el lavado PBS. A continuación, agregue lentamente 200 microlitros de 2% de agarosa caliente e inmediatamente, pero suavemente, desenganche el pellet celular de la pared del tubo sin interrumpirlo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro. Para el método de giro de agarosa hacia abajo, es fundamental separar el pellet celular de la pared del tubo justo después de agregar agarosa usando una aguja de calibre 25.Una vez que la agarosa se haya solidificado por completo, desprendala del tubo con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro y transfiérelo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Llene el tubo con 70% de etanol y proceda con el protocolo convencional para la deshidratación de tejidos y la incrustación de parafina. Este protocolo se utilizó con éxito para establecer organoides 3D a partir de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de cáncer de próstata metastásico hueso, así como directamente del tejido canceroso.Los organoides mostraron diferentes fenotipos que se manifestaron como quistes, esferoides y organoides de mayor complejidad. Una cúpula entera de membrana de sótano y organoides se puede ver en una imagen cosida de 25 imágenes de aumento de alta resolución y 10X. Para investigar más a fondo el tejido tumoral, se realizó citoquímica inmunofluorescente en una sección de parafina epintina de cinco micrómetros de espesor de organoides dirigida al marcador celular epitelial basal cytokeratin-5, marcador celular epitelial luminoso cytokera-8 y DAPI.Este protocolo se puede optimizar para otras aplicaciones como la hinchazón occidental, el cultivo en cocultura y la citometría de flujo para explorar las características de los organoides 3D y los efectos de los tratamientos farmacológicos. Estos experimentos podrían abordar los mecanismos de resistencia a los medicamentos y la eficacia de nuevas terapias solos o en combinación con las terapias actuales. Los organoides 3D de esta técnica conservan la heterogeneidad entre sujetos e intra-sujetos y, por lo tanto, son un modelo más preciso de la enfermedad en pacientes.Esta técnica allana el camino para que los investigadores exploren mecanismos de resistencia a los medicamentos, tumorigenesis, metástasis y terapias que pueden ser más predecibles de la progresión de la enfermedad en los pacientes y su respuesta a la terapia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

El establecimiento y la utilización de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de metástasis del sistema nervioso central

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...