Name: establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts
Uploaded: 2020-02-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Bu çalışma Leo ve Anne Albert Charitable Vakfı ve JM Vakfı tarafından desteklenmiştir. Biz California Üniversitesi San Diego Moores Kanser Merkezi üyeleri, Dr Jing Yang ve Dr Kay T. Yeung bize teknik uzmanlık için mikrotom ve Randall Fransızca, Cerrahi Bölümü kullanımı izin için teşekkür ederiz.

Bu çalışma, California Üniversitesi San Diego (UCSD) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Kılavuzu'ndaki tavsiyelere sıkı bir şekilde uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB #090401 Onayı UCSD Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) araştırma amaçlı hastalardan cerrahi numune toplamak için alındı. Her hastadan bilgilendirilmiş bir ret alındı ve femurdaki patolojik kırığın ortopedik onarımından cerrahi kemik prostat kanseri metastazı örneği alındı. Hayvan protokolleri California San Diego Üniversitesi ...

<ol>
	<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Tushir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unregulated+ARF6+activation+in+epithelial+cysts+generates+hyperactive+signaling+endosomes+and+disrupts+morphogenesis.">Unregulated ARF6 activation in epithelial cysts generates hyperactive signaling endosomes and disrupts morphogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 21 (13), 2355-2366 (2010).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+and+Assessment+of+Human+Primary+Prostate+Organoid+Culture.">Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), 59051 (2019).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers.">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Abou-Kheir, W. G., Hynes, P. G., Martin, P. L., Pierce, R., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+contribution+of+stem/progenitor+cells+to+tumorigenesis+in+the+Pten-/-TP53-/-+prostate+cancer+model.">Characterizing the contribution of stem/progenitor cells to tumorigenesis in the Pten-/-TP53-/- prostate cancer model.</a> Stem Cells. 28 (12), 2129-2140 (2010).</li><li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PDX/Organoid+Biobank+of+Advanced+Prostate+Cancers+Captures+Genomic+and+Phenotypic+Heterogeneity+for+Disease+Modeling+and+Therapeutic+Screening.">A PDX/Organoid Biobank of Advanced Prostate Cancers Captures Genomic and Phenotypic Heterogeneity for Disease Modeling and Therapeutic Screening.</a> Clinical Cancer Research. 24 (17), 4332-4345 (2018).</li><li>Debnath, J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+glandular+epithelial+cancers+in+three-dimensional+cultures.">Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures.</a> Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Evolution+and+Drug+Response+in+Patient-Derived+Organoid+Models+of+Bladder+Cancer.">Tumor Evolution and Drug Response in Patient-Derived Organoid Models of Bladder Cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Puca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+derived+organoids+to+model+rare+prostate+cancer+phenotypes.">Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes.</a> Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).</li><li>Murrow, L. M., Weber, R. J., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+stem+cell+niche+with+organoid+models:+an+engineering-based+approach.">Dissecting the stem cell niche with organoid models: an engineering-based approach.</a> Development. 144 (6), 998-1007 (2017).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Godebu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCSD1,+a+new+patient-derived+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer,+is+castrate-resistant+in+the+bone-niche.">PCSD1, a new patient-derived model of bone metastatic prostate cancer, is castrate-resistant in the bone-niche.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 275 (2014).</li><li>. Keyence Fluorescence Microscope Available from: <a target="_blank" href="https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/">https://www.keyence.com/ss/products/microscope/bz-x/</a> (2019)</li></ol>

Hasta kemik metastazı prostat kanseri hücrelerinden elde edilen 3D organoidler hala nispeten nadirdir. Burada, BMPC'nin seri 3D hasta kaynaklı organoidlerini (PDO'ları) başarıyla kurmak için stratejileri ve daha da optimize edilmiş protokolü tanımlıyoruz. Buna ek olarak, IFC ve IHC analizi için daha düşük hücre yoğunluğuna sahip numunelerde organoidlerin güvenliğini sağlamak için protokoller tanımlanmıştır. Kist, sferoidler ve daha karmaşık organoidler şeklindeki diferansiyel fenotipler, bu p...

Üç boyutlu kültürlü organoidler in vivo mimarisi, hücresel işlevsellik ve orijinal dokularının genetik imza sını yeniden özetleme potansiyelleri için dikkatçekti1 ler 1,2,3,4,5. En önemlisi, hasta tümör dokularından veya hasta türetilmiş ksenogreft (PDX) modellerinden kurulan 3D organoidler, tümörigenez üzerine hücresel sinyalizasyon mekanizmalarını anlamak ve ilaç tedavisinin her hücre popülasyonu6,7,8,9,10,11,12,13üzerindeki etkilerini belirlemek için paha biçilmez fırsatlar sağlar. Drost ve ark.5 üroloji alanında yaygın olarak benimsenen insan ve fare prostat organoidlerinin kurulması için standart bir protokol geliştirmiştir. Buna ek olarak, 3D organoidlerin daha fazla karakterizasyonu ve tümörigenez ve metastaz4,12,14,15ayrıntılı mekanizmaları anlamak için önemli çaba adanmıştır. 3D organoid kültürleri için önceden belirlenmiş ve yaygın olarak kabul görmüş protokole ek olarak, optimize edilmiş kültür koşullarında üç farklı doming yöntemi kullanılarak PDO'nun 3D kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz.
Bu yazıda kemik metastatik prostat kanserinin (BMPC) ex vivo modeli olarak 3Boyutlu organoidler oluşturulmuştur. Bu kültürler için kullanılan hücreler Prostat Kanseri San Diego (PCSD) serisi geldi ve doğrudan hasta prostat kanseri kemik metastatik tümör dokuları (PCSD18 ve PCSD22) veya hasta türetilen ksenogreft (PDX) tümör modelleri (pcsd1, PCSD13 ve PCSD17 adlı örnekler) türetilmiştir. Prostat kanseri hücrelerinin spontan kemik metastazı genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde nadir olduğu için16, biz erkek Rag2 içine insan tümör hücrelerinin doğrudan intra-femoral (IF) enjeksiyonu kullanılan-/-γc-/- fareler kemik metastatik prostat kanseri PDX modelleri kurmak için17.
3D organoidler heterojen hasta tümör hücrelerinden veya türetilmiş ksenogreftlerden oluşturulduktan sonra, prostat tümör hücreleri olarak kimliklerini doğrulamak ve 3D organoid kültürlerde fenotiplerini belirlemek esastır. İmmünofloresan kimyası (IFC) her hücrede protein ekspresyonunun görüntülenmesine izin verir, genellikle belirli hücre popülasyonları için potansiyel işlevleri gösteren2,4. Genel olarak, dokular ve hücreler de dahil olmak üzere örneklerin büyük bir çoğunluğu için IFC protokolleri basit ve tamamen optimize edilebistir. Ancak, hücre yoğunluğu ve organoidlerin sayısı önemli ölçüde konvansiyonel kültürdaha düşük olabilir. Bu nedenle, organoidler için IFC protokolü, numunelerdeki tüm organoidler için parafinin uygun şekilde işlenmesini ve gömülmesini sağlamak için ek adımlar gerektirir. Özellikle organoid örneklerinin hücre yoğunluğunun istenildiğinde nisbeten daha düşük olması durumunda, akderose ön gömme işlemi için ek adımlar ve kesitli organoidlerin yerini slaytta etiketlemek için ipuçları açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Pipettman</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>329654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Spectrum Lab Products</td>
			<td>941-11326-ATP083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol (EtOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1164-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody -for Cytokeratin 5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>905901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody for Cytokeratin 8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>904801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescence imaging system, IVIS 200</td>
			<td>Perkin Elmer Inc</td>
			<td>IVIS 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 24 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 48 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Plate - 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Solution, Accumax</td>
			<td>Innovative Cell Technologies, Inc.</td>
			<td>AM105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Falcon (Corning)</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Vectashield</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-073-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Corning/Cellgro</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>S728696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-0420401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52877-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced)</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (High Concentration)</td>
			<td>BD (Fisher Scientific)</td>
			<td>CB354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Imaging Software, Keyence</td>
			<td>BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope, Keyence</td>
			<td>BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Cell Depletion Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-104-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>American National Can</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Mediatech Inc. (Corning)</td>
			<td>30-002-CI-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)</td>
			<td>Fisherbrand Redi-Tip</td>
			<td>21-197-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plunger (from 3 mL syringe)</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 1</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB2021190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Table Top Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75002426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>2320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>M1817</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and analysis of three-dimensional (3d) organoids derived from patient prostate cancer bone metastasis specimens and their xenografts

İnsan hastalarının tümör örneklerinden organoidlerin üç boyutlu (3D) kültürü ve hasta kaynaklı organoidler (PDO) olarak adlandırılan prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, tümörigenez ve prostat kanseri metastazı. Onların en büyük avantajı, orijinal dokunun ayırt edici genomik ve fonksiyonel heterojenliğini geleneksel hücre hatlarına göre korumalarıdır. Ayrıca, PDO'nun 3D kültürleri ilaç tedavisinin bireysel hastalar üzerindeki etkilerini tahmin etmek için kullanılabilir ve kişiselleştirilmiş tıbba doğru atılmış bir adımdır. Bu avantajlara rağmen, farklı hasta örnekleri için gerekli olabilecek PDO kültür koşullarının kapsamlı optimizasyonu nedeniyle bu yöntemi rutin olarak çok az grup kullanmaktadır. Daha önce prostat kanseri kemik metastazı PDX modelimizin PCSD1'in donör hastanın kemik metastazının anti-androjen tedavisine direncini yeniden kapladığını gösterdik. Biz anti-androjen direnci daha fazla mekanizmaları karakterize PCSD1 3D organoidler kullanılır. PDX ve PDO modellerinin şu anda yayınlanmış çalışmalarının genel bir görünümünü takiben, optimize edilmiş kültür koşullarında kubbeli veya yüzen bazal membran (örneğin, Matrigel) küreler kullanarak PDO'nun 3B kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz. In vivo dikiş görüntüleme ve histoloji için hücre işleme de açıklanmıştır. Bu protokol batı leke, co-kültür, vb dahil olmak üzere diğer uygulamalar için daha optimize edilebilir ve ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve terapötik ile ilgili 3D kültürlü PDO özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir.

3D organoidler kemik metastatik prostat kanseri (BMPC) modelinden ve doğrudan hasta kemik metastatik prostat kanseri dokusundan elde edilen ksenogreft (PDX) modelinden başarılı bir şekilde saptandı(Şekil 4). Kısaca, BMPC PDX modellerimiz erkek Rag2-/- c-/- farelere tümör hücrelerinin intra-femoral (IF) enjeksiyonu ile oluşturulmuş ve daha sonra PDX tümörleri bu el yazmasında açıklandığı şekilde hasat edilerek işlenmiştir. Şe...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts at JoVE.com

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.

Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

Kemik metastatik prostat kanserinin seri 3Boyutlu hasta kaynaklı organoidlerini oluşturmak için stratejileri ve adım adım protokolleri tanımlıyoruz. Optimize edilmiş protokollerimiz, doğrudan hastalardan veya hasta kaynaklı ksenogreft tümör dokularından sınırlı başlangıç materyali kullanarak deneyler için 3Boyutlu kültürler kurmak için pratiktir. Bu protokolden 3D organoidler kemik metastatik prostat kanseri patolojisinin temel mekanizmalarını anlamak ve tedaviyi test etmek için ex vivo modelleri olarak kullanılabilir.Bu protokoldeki 3D organoid kültür ortamı prostat kaynaklı hücrelere özgüdür. Protokollerimizin diğer bölümleri farklı tümör dokuları ve metastatik bölgeler için geçerlidir. Doming tekniği bu sürecin en zor parçası olarak kanıtlamak olabilir.Doming tekniğinin pratik organoidler, medya ve Matrigel kubbeli karışımı tutarlı bir boyut sağlayacak ve örnek süspansiyon sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirmek. Bu yöntemi görsel olarak göstermek, düşük yoğunluklu organoidleri düşük sayıdaki hücreden başarıyla elde etmek için viskoz Matrigel'in nasıl işleyeceğinidaha iyi anlamamızı sağlar. 24 kuyulu bir plaka kurulumu için hücre peletini uygun bodrum zarında yeniden sulayarak başlayın.Pipet yukarı ve aşağı yavaşça hücreleri resuspended olduğundan emin olmak için, sonra önceden ısıtılmış doku kültür plaka merkezine hücre süspansiyon uygun hacmi pipet. Plakaters ve hemen hücre kültürü kuluçka seti baş aşağı yerleştirin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 15 dakika. Pipet her kuyuya 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür içeren önceden ısıtılmış ortam uygun hacmi.Ekli yuvarlak kubbeden yüzen bir kubbe oluşturmak için kubbeyi bir hücre kazıyıcı kullanarak plakadan ayırın. Parafin film bir iki dört inç parça kesin ve bir mililitre plastik pipet ucu kutusundan raf tutan boş bir ucu divots üstüne yerleştirin. Parafin filmine nazikçe basmak için eldivenli bir işaret parmağı kullanın ve filmi kırmamaya özen gösterdi.Sprey parafin filmi% 70 etanol ile ve en az 30 dakika boyunca hazırlanan film sterilize etmek için hücre kültürü başlık UV lambası açın. Bu arada, bazal membran 20 mikrolitre önceden işlenmiş hücreleri askıya. Sonra parafin filminde oluşan divots içine süspansiyon pipet.Katılaşmış boncukları ve parafin filmini altı kuyulu bir tabağa ve pipete 3-5 mililitre önceden ısıtılmış ortama yerleştirin ve parafin filminden boncukları hafifçe fırçalarken her kuyuya 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür içeren bir ortam yerleştirin. Histoloji için organoidler işlemek için, kuyudan bodrum membran kubbeler aspire değil özen mevcut medya kaldırın. Eşit hacimli hücre kurtarma çözeltisi ekleyin ve plakayı 4 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, bir pipet kullanarak bodrum membran kubbe çıkarmak ve bir pipet ucu ile ezmek. Ayrıştırılmış kubbeyi ve hücre kurtarma çözeltisini 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüpü 4 santigrat derecede 300 kez 5 dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı çıkarın ve bir kenara koyun.Organoidlerin varlığı istenilen soğuk PBS hacminde onaylandığında son adıma kadar tüm supernatants kaydedin ve hafifçe pipet yukarı ve aşağı mekanik organoidler bozmadan pelet çıkarmak için. Santrifüjtekrar layın ve supernatant çıkarın. Peleti oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'lık uyumlu bir hacimde sabitleyin.Fiksasyondan sonra santrifüj adımını ve PBS yıkamayı tekrarlayın. Sonra yavaş yavaş sıcak 2% agarose 200 mikrolitre ekleyin ve hemen ama yavaşça bir mililitre şırınga bağlı bir 25 gauge iğne kullanarak bozmadan tüp duvardan hücre pelet ayırmak. Agarose spin down yöntemi için, 25 gauge iğne kullanarak agarose ekledikten hemen sonra tüp duvarından hücre pelet ayırmak için önemlidir.Agarose tamamen katıladıktan sonra, bir mililitreşile bağlı 25 kalibrelik bir iğne ile tüpten ayırın ve yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüp% 70 etanol ile doldurun ve doku dehidratasyon ve parafin gömme için geleneksel protokol ile devam edin. Bu protokol, kemik metastatik prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft modellerinden ve doğrudan kanser dokusundan 3Boyutlu organoidler oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır.Organoidler kistler, sferoidler ve daha yüksek karmaşıklık organoidler olarak tezahür farklı fenotipleri gösterdi. 25 yüksek çözünürlüklü, 10X büyütme görüntüleri dikişli bir görüntü de bodrum membran ve organoidlerin bütün bir kubbe görülebilir. Tümör dokusunu daha fazla araştırmak için, bazal epitel hücre belirteç sitokeratin-5, luminal epitel hücre belirteç sitokeratin-8 ve DAPI hedefleyen organoidlerin beş mikrometre kalınlığında parafin bölümüne immünfloresan sitokimya uygulandı.Bu protokol, 3D organoidlerin özelliklerini ve ilaç tedavilerinin etkilerini keşfetmek için Batı lekeleme, eş kültür ve akış sitometrisi gibi diğer uygulamalar için optimize edilebilir. Bu deneyler ilaç direnci mekanizmaları ve yeni terapötik lerin etkinliğini tek başına veya mevcut tedaviler ile birlikte ele alabilir. Bu teknikten 3Boyutlu organoidler inter-konu ve intra-konu heterojenliğini korurlar ve bu nedenle hastalarda hastalığın daha doğru bir modelidir.Bu teknik, araştırmacıların hastalarda hastalığın ilerlemesini ve tedaviye verdikleri yanıtı daha öngörülebilir hale getiren ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve tedavi mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfüzyonlu Mikroakışkan Platformda Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Ex vivo 3D Hidrojel Kültürleri için Geliştirilmiş Canlılık

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Santral Sinir Sistemi Metastazının Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Kurulması ve Kullanılması

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...