Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

نشكر ك. تشاو ، ج. مورغان ، و ا. دريلر-كولانجلو للمساهمة في تقنيات الشاسيه المجزاه الحمض النووي اوريغامي. كما نشكر الأعضاء السابقين في مختبرات Reck-بيترسون وشيه علي المناقشات المفيدة والمساهمات في التطوير الأصلي لهذه التقنيات. نشكر j. Wopereis ومركز سميث كليه لمجهر والتصوير و ل. Bierwert ومركز سميث كليه لعلم الاحياء الجزيئية. ونحن نعترف بامتنان برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي NSF للحصول علي المجهر TIRF.

1. النمو والتعبير والحصاد من البروتينات الحركية التي تسيطر عليها مروج المستحثة
<ol><li>باستخدام الخميرة-peptone-سكر العنب (YPD) لوحه الثقافة وعصا التلقيح العقيمة ، والمطلوبة خط سلاله الخميرة المجمدة واحتضان لمده 3-4 يوما في 30 درجه مئوية.</li>
	<li>اليوم الأول من النمو الثقافي: في فتره ما بعد الظهر ، أضا?...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

تقنيات البناء الجزيئية من الحمض النووي اوريغامي توفر وسيله فريدة من نوعها لبناء الفرق الحركية مع البنيات المحددة ، وأرقام المحركات ، وأنواع ، وتمكين الدراسات من كيف تنشا السلوك الناشئة من تكوينات المحرك محدده31. كما تواصل الدراسات الهيكلية والخلوية لتوضيح أمثله من المحركات ?...

Dynein و كينيسن هي بروتينات المحرك خلوي المسؤولة عن وظائف لا تعد ولا تحصي في الخلايا حقيقية النواة1. عن طريق تحويل الطاقة الكيميائية من التحلل ATP في العمل الإنتاجي ، وهذه المحركات translocate علي الأنابيب الدقيقة لسحب وتوزيع الشحنات داخل الخلايا المختلفة. كما انها تنسق في الترتيبات الضخمة داخل الخلايا المرتبطة بالانقسام ، حيث تظهر القوي المدبرة التي تسهم في تحديد المواقع وفصل الكروموسومات. وقد كشفت الفحوصات الهيكلية والبيوكيميائية والبيوفيزيائية ، بما في ذلك ملاحظات جزيء واحد ، أليات هذه المحركات علي المستوي الفردي (المراجعة الجيدة في الاعمال السابقة2،3،4). ومع ذلك ، فان العديد من مهام المحركات تتطلب منهم العمل في فرق صغيره من أنواع المحركات المتشابهة والمختلطة. نسبيا اقل فهمت حول اليه ان ينسق النشاط وحركيه طارئه مطلقه من هذا فرق5,6. وتعزي هذه الفجوة المعرفية ، جزئيا ، إلى صعوبة إنشاء الفرق ذات الميزات القابلة للتحكم ، مثل نوع المحرك ورقم النسخة. علي مدي العقد الماضي ، تم استخدام تقنيات البناء الجزيئية من اوريغامي الحمض النووي لحل هذه المشكلة. للمحركات القائمة علي ميكروتثبول ، وتشمل بعض الامثله علي هذه التحقيقات ملاحظات جزيء واحد من الفرق من dynein سيتوبلاسميك-17،8،9، داخل الشركات11، مختلفه [كينسن] محركات12,13, وخلطاء من كلا [ديينس] و [كينينس]7,14,15. هنا ، ونحن نقدم تفاصيل عن تنقيه والتسميات قله الكرياتالسبعمن المحركات من الخميرة 7،16،17،18،19،20، و للطي وتنقيه اوريغامي الحمض النووي مجزاه مع الامتثال انضباطي8، والتصوير من المحركات الخميرة دفع هياكل الشاسيه7،18.
بناء السيارات الفرق لرصد جزيء واحد في المختبر يتطلب ثلاثه جهود أساسيه. الأول هو التعبير ، وتنقيه ووضع العلامات من السيارات بنيات مناسبه لربط إلى اوريغامي الحمض النووي. والثاني هو إنتاج وتنقيه الهياكل المحددة اوريغامي الحمض النووي (تسمي في كثير من الأحيان "الشاسيه"). والثالث هو اقتران المحركات بهيكل الشاسيه متبوعا بالملاحظة باستخدام المجهر الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF). هنا ، ونحن نقدم البروتوكولات المعمول بها لهذه العملية للمحركات المؤتلف المستندة إلى ميكروتوبولي المنقية من الخميرة ساكاروميسز سيريفيسياي7،16،17،18، 19. وقد تم التحقيق في الفرق المحركات القائمة علي الحمض النووي اوريغامي باستخدام كل من المؤتلف كينيسن15 و dynein7,8,18 يبني في هذا النظام التعبير الخميرة16 و17و18و19. هذا البروتوكول هو صالح لهذه الثوابت ، بالنظر إلى ان يتم التحكم بها من قبل المروج المستحثة الغالاكتوز ، وتنصهر في نفس علامات البروتين لتنقيه (ZZ و tev الانزيم البروتيني رابط) والاقتران الحمض النووي اليغو (snaptag).
سلالات الخميرة محدده تنتج بنيات المحرك محدده. علي سبيل المثال ، تم تنقيه dynein المستخدمة لدراسة دور الامتثال البضائع من سلاله RPY10847،8. وبصفه عامه ، يمكن طلب السلالات التي تحتوي علي ثوابت حركيه مع التعديلات الجينية المناسبة للتعبير والتنقية من المختبرات التي نشرت استخدام تلك المحركات. ويمكن اجراء الثوابت ذات السمات الجديدة مثل الطفرات أو العلامات باستخدام التقنيات الوراثية المؤتلفة ، مثل تحويل خلات الليثيوم21 والمجموعات التجارية. وقد نشرت بروتوكولات مفصله لإنشاء بروتينات المحركات المعدلة في الخميرة لدراسات جزيء واحد19. بالاضافه إلى المحركات يجري تنصهر إلى SNAPtag ، والتي تستخدم لتسميه المحركات يجب ان يكون مترافق إلى الركيزة المفاجئة ، البنزيلغوانين (BG) ؛ البروتوكولات المنشورة سابقا تصف تشكيل وتنقيه BG-oligo تستحضر18. وقد استخدمت الاستراتيجية العامة الموصوفة هنا أيضا للمحركات القائمة علي actin (انظر الاعمال السابقة للاطلاع علي الامثله22و23و24) والمحركات المنقية من الكائنات الحية الأخرى وأنظمه التعبير (انظر السابق يعمل لمثل الامثله7،9،10،11،12،13،14).
وتستخدم الأنابيب المجهرية بلمره (MTs) في هذه التجارب في إجراءين مختلفين. MT التقارب تنقيه المحركات الوظيفية يتطلب MTs التي لا توصف مع المجموعات الوظيفية الأخرى ، في حين ان المحرك الفرقة الحركة TIRF الفحص يتطلب MTs المسمية مع البيوتين والفلوماتورس. في جميع الحالات ، يتم تثبيت MTs مع تاكسول لمنع التشبع. يتم استخدام خطوه تنقيه التقارب MT لأزاله اي المحركات غير motile مع تقارب MT عاليه ، كما يمكن لهذه المحركات تغيير الحركة الفرقة إذا مترافق إلى الشاسيه. اثناء هذه العملية ، المحركات النشطة إلغاء ربط MTs والبقاء في الحل ، بينما المحركات ملزمه ضيق تدور في بيليه MT. وهذا يساعد علي ضمان ان جميع المحركات علي الشاسيه هي من السكان النشطين.
وقد استخدمت مجموعه متنوعة من الهياكل اوريغامي الحمض النووي لدراسة الفرق المحركات خلوي. وبما ان الفهم الألى لنقل الفرقة قد زاد ، فقد نمت هياكل اوريغامي الحمض النووي المستخدمة في التجارب في التعقيد. ومن حيث المبدا ، يمكن تكييف اي هيكل لهذا الغرض شريطه تعديله ليشمل مواقع مرفقات الحمض النووي الوحيدة التي تقطعت بها السبل للمحركات والفلوبوريس. تصاميم الشاسيه المحددة والسمات قد تكون مفيده لسبر اسئله معينه حول السلوك الناشئة من الفرق المحركات. علي سبيل المثال ، وقد استخدمت قضبان جامده لتطوير المعرفة التاسيسيه لكيفيه تاثير عدد النسخ يؤثر علي النقل من قبل فرق من dyneins و kinesins7،15،18، وقد استخدمت منصات 2d لدراسة فرقه ميوزين الملاحة من شبكات الاكتين22. وقد استخدمت الهياكل ذات المرونة المتغيرة أو القابلة للتوقد لفهم ادوار الاقتران المرن بين المحركات والتحقيق في كيفيه تاثير التزامن المتدرج علي الحركة8،24. وفي الاونه الاخيره ، يتم استخدام الهياكل الكروية لاكتساب نظره ثاقبه حول كيفيه تاثير القيود الهندسية علي الربط الحركي للمسار علي ديناميات الحركة25.
في هذا البروتوكول ، نحن نقدم خطوات محدده لتجارب الفرقة علي الشاسيه مجزاه مع صلابة متغير. ويشار أحيانا إلى المواقع الملزمة علي الشاسيه باسم "المقابض" ، بينما يطلق علي سلاسل الحمض النووي التكميلية التي تربط هذه المقابض "مضادات المقابض". يتم تحديد عدد من المحركات علي هذه الشاسيه من قبل الشرائح التي تحتوي علي الدبابيس مقبض الموسعة مع التكامل إلى اليغو مضاده للمقبض علي المحركات المسمي اليغو. يسمح استخدام تسلسلات مختلفه من المؤشرات علي أجزاء مختلفه بربط أنواع مختلفه من المحركات بمواقع محدده علي الشاسيه. يتكون الهيكل المفصل هنا من 7 قطع جامده متسلسلة ، يتالف كل منها من 12 من الحمض النووي المزدوج الذي يتم ترتيبه في حلقتين من الحلقتين المتمركزتين8. الأجزاء جامده تحتوي علي مقابض المحركات وترتبط من خلال المناطق التي يمكن ان تكون مرنه اما الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل أو جامده مزدوجة تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، اعتمادا علي غياب أو وجود ، علي التوالي ، من المواد الغذائية "رابط". التالي فان الامتثال للهيكل هيكل يتحدد من خلال وجود أو غياب هذه "رابط" المواد الغذائية. انظر التقارير السابقة لمزيد من التفاصيل وتسلسل الحمض النووي المحدد8. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام طرق متعددة لتنقيه الشاسيه26. ويرد هنا وصف لطرد التدرج الجلسرين بالنسبة للمناطق المعدلة27 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

المحركات cytoskeletal هي المسؤولة عن مجموعه واسعه من الوظائف في الخلايا النواة ، بما في ذلك الانقسام ، ونقل البضائع ، والحركية الخلوية ، وغيرها. العديد من هذه الوظائف تتطلب المحركات للعمل في الفرق. علي الرغم من ثروة من المعرفة حول أليات المحركات خلوي الفردية ، نسبيا اقل من المعروف عن أليات والسلوكيات الناشئة من الفرق الحركية ، والامثله التي تشمل التغييرات علي الفرقة processivity والسرعة مع تغيير عدد المحركات والموقع والتكوين. الهيكلية الحمض النووي التكنولوجيا النانويه ، وتقنيه محدده من اوريغامي الحمض النووي ، وتمكن من البناء الجزيئي لابنيه محدده جيدا من الفرق الحركية. يمكن السيطرة علي شكل هياكل البضائع وكذلك نوع وعدد ووضع المحركات علي الهيكل. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولات مفصله لإنتاج هذه الفرق ومراقبتها باستخدام مجموع المجهر الداخلي التفكير المجهري. علي الرغم من ان هذه التقنيات قد تم تطبيقها علي وجه التحديد للمحركات خلوي ، وأساليب قابله للتعميم إلى البروتينات الأخرى التي تجمع في المجمعات لإنجاز مهامهم. وعموما ، فان طريقه اوريغامي الحمض النووي لخلق الفرق المحددة جيدا من البروتينات الحركية يوفر أداه قويه لتشريح أليات التي تؤدي إلى سلوك متحرك الناشئة.

وكانت التنقيات الناجحة من المحركات وهياكل الشاسيه المدعومة من قبل الكهربائي هلام. وأكد تحليل SDS-PAGE الاستخراج الناجح لل dynein من الخميرة (الشكل 2) ، كما الترشيح النهائي التي تم جمعها في الخطوة 2.3.7 أظهرت واضحة ، والفرقة حاده في موقف ~ 350 كده. كما هو متوقع ، وكان ه?...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

والهدف من هذا البروتوكول هو تشكيل الفرق من المحركات الجزيئية علي الحمض النووي النانو اوريغامي ومراقبه الحركة الفرقة باستخدام المجهر الداخلي انعكاس الكلي.

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

تم تصميم بروتوكولنا للتحقيق في الآليات الفيزيائية الحيوية التي تحكم نقل البضائع من قبل فرق من البروتينات الحركية السيوتو الهيكلية المتطابقة أو الموجهة عكسًا. باستخدام الحمض النووي اوريغامي للبناء الجزيئي، يمكن لهذه الطريقة اختيار لنوع، عدد، وموقع المحركات على أشكال الشحن محددة بدقة. في حين أن هذا البروتوكول يركز على المحركات القائمة على microtubule dynein و kinesin ، فإنه قابل للتكيف مع الميوسين المحرك القائم على actin ، وكذلك إلى أنظمة البروتين الأخرى التي تعمل بشكل تعاوني.أحد الجوانب الصعبة لهذا البروتوكول هو الحفاظ على سلامة ونشاط البروتينات الحركية طوال عملية التنقية ، حيث أنها حساسة للحرارة والقوة الميكانيكية. للحث على نمو البروتين الحركي والتعبير عن طريق مروج galactose ، استخدم عصا تلقيح عقيمة لتسطط سلالة الخميرة المجمدة من الاهتمام على لوحة ثقافة الخميرة - بيبتون - ديكستروز لاحتضان لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 30 درجة مئوية. في اليوم الرابع من الثقافة ، عندما تكون الكثافة البصرية في 600 نانومتر بين 1.5 واثنين ، وجمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تثبيت بيليه في الماء لغسلها وتوحيد الخلايا في زجاجة واحدة.تدور الخلايا مرة أخرى لجمع، وإعادة تعليق بيليه في حوالي ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة. ثم استخدام ماصة 10 ملليلتر لصرف ببطء الطين الخلية في النيتروجين السائل قطرة واحدة في وقت واحد لإنتاج كريات خلية الخميرة المجمدة. لتنقية البروتين الحركي، استخدم طاحونة قهوة من نوع الشفرة مبردة مسبقًا مع النيتروجين السائل لطحن كريات الخميرة المجمدة إلى مسحوق ناعم، ونقل مسحوق الخميرة إلى كوب زجاجي مُبرد مسبقًا و100 ملليلتر على الجليد.إضافة حجم صغير من عازلة تحلل 4X أعدت حديثا مع ملاحق للمسحوق بحيث لا يتجاوز التركيز النهائي من العازلة 1X، ووضع الكأس في حمام الماء 37 درجة مئوية مع اثارة مستمرة مع ملعقة لذوبان المسحوق بسرعة. إضافة 4X إضافية العازلة مع المكملات لتحقيق تركيز المخزن المؤقت النهائي إلى 1X في lysate. وغالبا ما يكون حجم النهائي بين 25 و 30 ملليلتر.ثم جمع خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي، ونقل البروتين القابل للذوبان التي تحتوي على عظمى في أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر على الجليد. لتنقية التقارب IgG، إضافة 200 ميكرولتر من تعليق حبة تقارب غسلها إلى مستخلص البروتين، واحتضان الخليط في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة مع تناوب لطيف. في نهاية الحضانة، تصفية الخليط من خلال نفس العمود الكروماتوغرافيا المستخدمة لإعداد الخرز في أربع درجات مئوية، تليها اثنين من يغسل مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة لكل غسل على الجليد.بعد الغسيل الثاني ، شطف الخرز على الجليد مع خمسة ملليلتر من العازلة TEV ، مما يسمح للمخزن المؤقت باستنزف بالكامل من العمود. لوضع العلامات على oligonucleotide الحمض النووي ، قم بغطاء عمود الكروماتوغرافيا ، واحتضان الخرزات الحركية مع 100 ميكرولترات من العازلة TEV المكملة مع 10 إلى 20 ميكرومولار من القلة البنزيلجوين المنقى في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة ، وإعادة بناء الخرز بلطف مرة واحدة في الدقيقة. في نهاية الحضانة، وغسل الخرز أربع مرات مع عازلة TEV الطازجة في غسل كما هو موضح للتو، قبل recapping الجزء السفلي من الأنبوب للسماح resuspension من الخرز المحرك في ما لا يزيد عن 200 ميكرولترات من عازلة TEV الطازجة.بالنسبة لشق TEV ، قم بنقل تعليق الخرزة الحركية إلى أنبوب 2 ملليلتر ، مستدير القاع ، ميكروسنتريفوج ، واحتضان الخرزات الحركية مع ما يقرب من 0.3 وحدة من TEV protease لكل ميكرولتر من خليط حبة المحرك عند 16 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع دوران لطيف. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الخرز المحرك، وجمع الخليط في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، استخدم طرف ماصة P1000 المقطوعة لنقل الخليط إلى عمود الدوران، والطرد المركزي الخليط كما هو موضح للتو.جمع الترشيحات التي تحتوي على TEV-مشقوق، والمحركات المنقية، و aliquot filrate في 50 ميكرولتر وحدات التخزين لتنقية التقارب. ثم فلاش تجميد aliquots في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتنقية الهيكل، في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم قبل تنقية، طبقة بلطف 80 ميكرولتر كل من تركيز الجلسرين في عازلة طي اوريغامي في أنبوب الطرد المركزي.يجب أن تكون الحدود بين الطبقات مرئية بشكل طفيف. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية, طبقة 10٪ الجلسرين في عازلة طي اوريغامي في حل هيكل مطوية على الطبقة العليا من التدرج, والطرد المركزي التدرج مع الهيكل. في نهاية الطرد المركزي، وجمع 50 ميكرولتر الكسور من التدرج في اتجاه من أعلى إلى أسفل، وتحميل خمسة ميكرولترات من كل كسر في آبار فردية من هلام agarose 2٪.بعد 90 إلى 120 دقيقة في 70 فولت، صورة هلام باستخدام ظروف مناسبة لطخة هلام الحمض النووي المستخدمة. ويمكن تحديد التركيزات الكمية للكسور المختارة من الفائدة باستخدام الطرق الطيفية القياسية المناسبة. يمكن استخدام تحليل SDS-PAGE لتأكيد النجاح في استخراج الدينين من الخميرة ، حيث يظهر filtrate النهائي نطاقًا واضحًا وحاداً بسرعة 350 كيلو دالات تقريبًا.TEV protease هو أيضا موجود في الترشيح النهائي ويشكل شريط واضح في حوالي 50 كيلودالتون. بعد تنقية التقارب microtubule، dynein يظهر كضفيرة واضحة، واحدة في 350 كيلودالون، في حين يمكن ملاحظة kinesin كما تلطيخ قليلا، وعصابات متعددة في حوالي 120 كيلودالتون. بالإضافة إلى بروتياز TEV ، يمكن أيضًا ملاحظة كمية ملحوظة من التبولين في المُنَافق النهائي.يمكن تحليل طي هياكل اوريغامي الحمض النووي بواسطة agarose هلام electrophoresis ، مع تحول في التنقل بين حبلا السقالات النقية المتكشفة ورد فعل قابل للطي يشير إلى طي اوريغامي. بالإضافة إلى ذلك، يشير رد الفعل القابل للطي إلى وجود بعض الهياكل المتعددة للهيكل. حركة مجموعات الهيكل الحركي يمكن اكتشافها بسهولة وقابليتها على الكموغرافيات المتولدة من أفلام TIRF ، حيث أن كيموغرافيات الهيكل المرنة المترافقة مع سبعة بروتينات dynein تظهر أشواطًا عملية للغاية بسرعات ثابتة نسبيًا.من المهم التحكم بعناية في درجة حرارة البروتينات الحركية في كل خطوة من العملية. بعد تنقية البروتينات الحركية وهيكل اوريغامي الحمض النووي، يمكن أن يكون مكونين مترافقة لمقارنات الحركة من الفرق تحت مجهر TIRF. هذه الطريقة تمكن من الآليات البيوفيزيائية والكيميائية الحيوية التي تحكم الحركة الناشئة من الفرق الحركية أن فك رموزها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...