Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Wir danken K. Chau, J. Morgan und A. Driller-Colangelo für ihren Beitrag zu den Techniken des segmentierten DNA-Origami-Chassis. Wir danken auch ehemaligen Mitgliedern der Laboratorien Reck-Peterson und Shih für hilfreiche Diskussionen und Beiträge zur ursprünglichen Entwicklung dieser Techniken. Wir danken J. Wopereis und dem Smith College Center for Microscopy and Imaging und L. Bierwert und dem Smith College Center for Molecular Biology. Wir danken dem NSF MRT-Programm für die Anschaffung eines TIRF-Mikroskops.

1. Wachstum, Expression und Ernte von motorischen Proteinen, die von einem Galactose-induzierten Promotor gesteuert werden
<ol><li>Mit einer Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Kulturplatte und einem sterilen Impfstab, Streifen gewünschte gefrorene Hefe-Stamm und inkubieren für 3-4 Tage bei 30 °C.</li>
	<li>Tag 1 des Kulturwachstums: Am Nachmittag 10 ml YP-Kulturmedien mit 2% Dextrose zu einem Glaskulturrohr mit 1" Durchmesser hinzufügen und mit einer einzigen Kolonie von der Platte impfen. Wachsen Sie in einer schnell roti...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

Die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami bieten eine einzigartige Möglichkeit, Motorensembles mit definierten Architekturen, Motorzahlen und Typen zu konstruieren, was Studien darüber ermöglicht, wie das entstehende Verhalten aus bestimmten Motorkonfigurationen entsteht31. Da strukturelle und zelluläre Studien weiterhin Beispiele von Zytoskelettmotoren aufklären, die in Teams arbeiten, werden Techniken zur Isolierung und Untersuchung der biophysikalischen und biochemischen Mecha...

Dynein und Kinesin sind zytoskelettale motorische Proteine, die für unzählige Funktionen in eukaryotischen Zellen verantwortlich sind1. Durch die Umwandlung der chemischen Energie der ATP-Hydrolyse in produktive Arbeit, diese Motoren translozieren auf Mikrotubuli, um zu schleppen und zu verteilen verschiedene intrazelluläre Ladungen. Sie koordinieren auch in den massiven intrazellulären Umlagerungen im Zusammenhang mit Mitose, wo sie orchestrierte Kräfte aufweisen, die zur Positionierung und Trennung von Chromosomen beitragen. Strukturelle, biochemische und biophysikalische Assays, einschließlich Einzelmolekülbeobachtungen, haben die Mechanismen dieser Motoren auf individueller Ebene aufgedeckt (gut in früherenArbeiten2,3,4). Viele der Aufgaben der Motoren erfordern jedoch, dass sie in kleinen Ensembles ähnlicher und gemischter Motortypen arbeiten. Vergleichsweise weniger wird über die Mechanismen verstanden, die die Aktivität und die endgültige Beweglichkeit dieser Ensembles koordinieren5,6. Diese Wissenslücke ist zum Teil auf die Schwierigkeit zurückzuführen, Ensembles mit steuerbaren Merkmalen wie Motortyp und Kopiernummer zu erstellen. In den letzten zehn Jahren wurden die molekularen Konstruktionstechniken von DNA-Origami eingesetzt, um dieses Problem zu lösen. Für die Mikrotubuli-basierten Motoren sind einige Beispiele dieser Untersuchungen einzelmolekulare Beobachtungen von Ensembles von zytoplasmatischem Dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, verschiedene Kinesinmotoren12,13, und Mischungen von Dyneins und Kinesinen7,14,15. Hier stellen wir Details der Reinigung und Oligonukleotid-Etikettierung von Motoren aus Hefe7,16,17,18,19,20, die Faltung und Reinigung von segmentierten DNA-Origami mit abstimmbarer Konformität8und die Abbildung der Hefemotoren, die die Fahrwerksstrukturenantreiben 7,18.
Die Konstruktion von Motorensembles für die In-vitro-Einzelmolekülbeobachtung erfordert drei Hauptanstrengungen. Die erste ist die Expression, Reinigung und Kennzeichnung von Motorkonstrukten, die für die Befestigung an DNA-Origami geeignet sind. Die zweite ist die Produktion und Reinigung definierter DNA-Origami-Strukturen (oft als "Chassis" bezeichnet). Und die dritte ist die Konjugation der Motoren an die Chassis-Struktur gefolgt von Beobachtung mit totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF). Hier stellen wir etablierte Protokolle für diesen Prozess für rekombinante Mikrotubuli-basierte Motoren bereit, die aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18 gereinigt werden. 19. DNA-Origami-basierte Motorensembles wurden sowohl mit rekombinanten Kinesin15 als auch mit Dynein7,8,18 In diesem Hefeexpressionssystem hergestellten Konstrukten untersucht16 ,17,18,19. Dieses Protokoll gilt für diese Konstrukte, da sie vom galaktoseinduzierten Promotor kontrolliert und mit denselben Protein-Tags zur Reinigung (ZZ und TEV Protease Linker) und für DNA-Oligokonjugation (SNAPtag) verschmolzen werden.
Spezifische Hefestämme erzeugen spezifische Motorkonstrukte. Zum Beispiel wurde das Dynein, das verwendet wurde, um die Rolle der Ladungskonformität zu untersuchen, von der Sorte RPY10847,8gereinigt. Im Allgemeinen können Stämme, die Motorkonstrukte mit den entsprechenden genetischen Modifikationen für die Expression und Reinigung enthalten, von den Laboratorien angefordert werden, die die Verwendung dieser Motoren veröffentlicht haben. Konstrukte mit neuartigen Attributen wie Mutationen oder Tags können mit rekombinanten genetischen Techniken wie Lithiumacetat-Transformation21 und kommerziellen Kits erstellt werden. Detaillierte Protokolle zur Herstellung modifizierter motorischer Proteine in Hefe für Einzelmolekülstudien wurden veröffentlicht19. Zusätzlich zu den Motoren, die mit dem SNAPtag verschmolzen werden, müssen die Oligos, die zur Kennzeichnung der Motoren verwendet werden, mit dem SNAP-Substrat Benzylguanin (BG) konjugiert werden; zuvor veröffentlichte Protokolle beschreiben die Bildung und Reinigung von BG-Oligo-Konjugaten18. Die hier beschriebene Gesamtstrategie wurde auch für actin-basierte Motoren (siehe frühere Arbeiten für Beispiele22,23,24) und Motoren verwendet, die von anderen Organismen und Expressionssystemen gereinigt wurden (siehe vorherige arbeitet für Beispiele7,9,10,11,12,13,14).
Polymerisierte Mikrotubuli (MTs) werden in diesen Experimenten in zwei verschiedenen Verfahren eingesetzt. Mt AffinitätSreinigung von Funktionsmotoren erfordert MTs, die nicht mit anderen funktionellen Gruppen gekennzeichnet sind, während die Motor-Ensemble-Motilität TIRF Assay MTs erfordert, die mit Biotin und Fluorophoren gekennzeichnet sind. In allen Fällen werden MTs mit Taxol stabilisiert, um eine Denaturierung zu verhindern. Der MT-Affinitätsreinigungsschritt wird verwendet, um alle nicht-motilen Motoren mit einer hohen MT-Affinität zu entfernen, da diese Motoren die Beweglichkeit des Ensembles verändern können, wenn sie mit einem Chassis konjugiert werden. Dabei binden aktive Motoren die MTs und bleiben in lösungsweise, während sich im MT-Pellet eng bindende Motoren drehen. Dadurch wird sichergestellt, dass alle Motoren auf dem Chassis aus einer aktiven Population stammen.
Eine Vielzahl von DNA-Origami-Strukturen wurden verwendet, um zytoskelettale motorische Ensembles zu studieren. Mit zunehmendem mechanistischen Verständnis des Ensembletransports sind die in Experimenten verwendeten DNA-Origami-Strukturen immer komplexer geworden. Grundsätzlich könnte jede Struktur für diesen Zweck angepasst werden, sofern sie so geändert wird, dass sie einsträngige DNA-Anhaftungsstellen für Motoren und Fluorophore umfasst. Spezifische Chassis-Designs und Attribute können nützlich sein, um bestimmte Fragen über das auftauchende Verhalten von Motoren-Ensembles zu untersuchen. Zum Beispiel wurden starre Stäbe verwendet, um grundlegende Kenntnisse darüber zu entwickeln, wie die Kopiernummer den Transport von Teams von Dyneins und Kinesinen beeinflusst7,15,18und 2D-Plattformen wurden verwendet, um Myosin-Ensemble zu studieren Navigation von actin-Netzwerken22. Strukturen mit variabler oder abstimmbarer Flexibilität wurden verwendet, um die Rollen der elastischen Kopplung zwischen Motoren zu verstehen und zu untersuchen, wie sich die Schrittsynchronisierung auf die Beweglichkeit8,24auswirkt. In jüngerer Zeit werden sphärische Strukturen verwendet, um Einen Einblick in die Auswirkungen geometrischer Abhängigkeiten auf die Motor-Track-Bindung auf die Dynamik der Beweglichkeit25zu gewinnen.
In diesem Protokoll bieten wir spezifische Schritte für Ensembleexperimente an segmentierten Chassis mit variabler Steifigkeit an. Bindungsstellen auf dem Chassis werden manchmal als "Griffe" bezeichnet, während ergänzende DNA-Sequenzen, die diese Griffe binden, als "Antihandles" bezeichnet werden. Die Anzahl der Motoren auf diesen Chassis wird bestimmt, welche Segmente verlängerte Griffklammern mit Komplementarität zum Antihandle-Oligo auf den Oligo-markierten Motoren enthalten. Die Verwendung unterschiedlicher Griffsequenzen auf verschiedenen Segmenten ermöglicht die Bindung verschiedener Motorentypen an bestimmte Stellen auf dem Chassis. Das hier beschriebene Chassis besteht aus 7 aufeinanderfolgenden starren Segmenten, die jeweils aus 12 doppelsträngigen DNA-Helices bestehen, die in 2 konzentrischen Ringen8angeordnet sind. Die starren Segmente enthalten die Motorgriffe und sind durch Regionen verbunden, die entweder flexible einsträngige DNA oder starre doppelsträngige DNA sein können, je nach Abwesenheit bzw. Vorhandensein von "Linker"-Heftklammern. Die Übereinstimmung der Fahrwerksstruktur wird somit durch das Vorhandensein oder Fehlen dieser "Linker"-Heftklammern bestimmt. Weitere Informationen und spezifische DNA-Sequenzen finden Sie in früheren Berichten8. Darüber hinaus können mehrere Methoden verwendet werden, um Chassis26zu reinigen. Hier wird die rate-zonale Glyzeringradientenzentrifugationsmethode27 beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Zytoskelettmotoren sind verantwortlich für eine Vielzahl von Funktionen in eukaryotischen Zellen, einschließlich Mitose, Frachttransport, Zellbewegung und andere. Viele dieser Funktionen erfordern Motoren, um in Ensembles zu arbeiten. Trotz einer Fülle von Kenntnissen über die Mechanismen einzelner Zytoskelettmotoren ist vergleichsweise weniger über die Mechanismen und das aufkommende Verhalten von Motorensembles bekannt, deren Beispiele Veränderungen der Ensemble-Prozessivität und -geschwindigkeit mit Motornummer, Standort und Konfiguration ändern. Die strukturelle DNA-Nanotechnologie und die spezifische Technik des DNA-Origami ermöglichen die molekulare Konstruktion klar definierter Architekturen von Motorensembles. Die Form der Ladungsstrukturen sowie die Art, Anzahl und Platzierung der Motoren auf der Struktur können alle gesteuert werden. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung dieser Ensembles und deren Beobachtung mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Verfügung. Obwohl diese Techniken speziell für Zytoskelettmotoren angewendet wurden, sind die Methoden auf andere Proteine verallgemeinert, die sich in Komplexen zusammensetzen, um ihre Aufgaben zu erfüllen. Insgesamt bietet die DNA-Origami-Methode zur Schaffung klar definierter Ensembles von motorischen Proteinen ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu sezieren, die zu auftauchendem motilen Verhalten führen.

Erfolgreiche Reinigungen von Motoren und Fahrwerksstrukturen wurden durch Gelelektrophorese geprüft. Die SDS-PAGE-Analyse bestätigte die erfolgreiche Extraktion von Farbstoff aus Hefe (Abbildung 2), da das in Schritt 2.3.7 gesammelte Endfiltrat ein klares, scharfes Band an der Position von 350 kDa zeigte. Wie erwartet, fehlte dieses Dynein-Band in der Durchfluss- und Waschung, die unerwünschte Proteine entfernte, und den Perlen, von denen Dynein spaltete. ...

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Unser Protokoll ist darauf ausgelegt, die biophysikalischen Mechanismen für den Transport von Fracht durch Teams identischer oder entgegengesetzter zytoskelettaler motorischer Proteine zu untersuchen. Durch die Verwendung von DNA-Origami für die molekulare Konstruktion kann diese Methode für die Art, Anzahl und Position von Motoren auf genau definierten Ladungsformen wählen. Während sich dieses Protokoll auf die mikrotubulierbasierten Motoren Dynein und Kinesin konzentriert, ist es anpassungsfähig an das aktinbasierte Motormyosin sowie auf andere Proteinsysteme, die kooperativ funktionieren.Ein herausfordernder Aspekt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung der Integrität und Aktivität der motorischen Proteine während des gesamten Reinigungsprozesses, da sie empfindlich auf Hitze und mechanische Kraft reagieren. Um das motorische Proteinwachstum und die Expression über Galaktose-Promotor zu induzieren, verwenden Sie einen sterilen Impfstab, um den gefrorenen Hefestamm von Interesse auf einer Hefe-Pepton-Dextrose-Kulturplatte für eine drei- bis viertägige Inkubation bei 30 Grad Celsius zu streifen. Am vierten Tag der Kultur, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 1,5 und zwei liegt, sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in Wasser wieder auf, um sie zu waschen und die Zellen in einer einzigen Flasche zu konsolidieren.Drehen Sie die Zellen erneut zur Sammlung, und setzen Sie das Pellet in etwa zwei Milliliter doppelliter doppeldestilliertem Wasser wieder aus. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellschlämme langsam in flüssigen Stickstoff zu geben, einen Tropfen nach dem anderen, um gefrorene Hefezellpellets zu produzieren. Zur motorischen Proteinreinigung verwenden Sie eine mit flüssigem Stickstoff vorgekühlte Kaffeemühle vom Klingentyp, um die gefrorenen Hefepellets in ein feines Pulver zu mahlen, und übertragen Sie das Hefepulver in ein vorgekühltes, 100-Milliliter-Glasbecher glasbecherauf Eis.Fügen Sie ein kleines Volumen von frisch zubereiteten 4X LysePuffer mit Ergänzungen zum Pulver, so dass die endgültige Konzentration des Puffers nicht mehr als 1X, und legen Sie das Becherglas in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad mit kontinuierlichem Rühren mit einem Spachtel, um das Pulver schnell aufzutauen. Fügen Sie zusätzlichen 4X Puffer mit Ergänzungen hinzu, um die endgültige Pufferkonzentration auf 1X im Lysat zu bringen. Das Endvolumen liegt oft zwischen 25 und 30 Millilitern.Dann sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation und übertragen Sie das lösliche Protein, das Überstand enthält, in eine neue 50-Milliliter-Konustube auf Eis. Für die IgG-Affinitätsreinigung 200 Mikroliter gewaschene Affinitätsperlensuspension in den Proteinextrakt geben und die Mischung bei vier Grad Celsius für eine Stunde mit sanfter Rotation inkubieren. Filtern Sie die Mischung am Ende der Inkubation durch dieselbe Chromatographiesäule, mit der die Perlen bei vier Grad Celsius zubereitet werden, gefolgt von zwei Wäschen mit fünf Millilitern Waschpuffer pro Waschgang auf Eis.Nach dem zweiten Waschen spülen Sie die Perlen auf Eis mit fünf Millilitern TEV-Puffer, so dass der Puffer vollständig aus der Säule abfließen kann. Für die DNA-Oligonukleotid-Etikettierung die Chromatographie-Säule kappen und die Motorperlen mit 100 Mikrolitern TEV-Puffer bebrüten, ergänzt um 10 bis 20 Mikromolar des gereinigten Benzylguanin-Oligos bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten, wobei die Perlen einmal pro Minute sanft wieder aufgesetzt werden. Waschen Sie die Perlen am Ende der Inkubation viermal mit frischem TEV-Puffer pro Wäsche, wie soeben gezeigt, bevor Sie den Boden des Rohres wieder anbringen, um eine Resuspension der Motorperlen in nicht mehr als 200 Mikroliter frischer TEV-Puffer zu ermöglichen.Für TEV-Spaltung die Motorperlenaufhängung auf ein Zwei-Milliliter-, rundboden-Mikrozentrifugenrohr übertragen und die Motorperlen mit ca. 0,3 Einheiten TEV-Protease pro Mikroliter Motorperlenmischung bei 16 Grad Celsius für eine Stunde bei sanfter Rotation bebrüten. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Motorperlen und sammeln Sie die Mischung an der Unterseite des Rohres. Als nächstes verwenden Sie eine geschnittene P1000 Pipettenspitze, um das Gemisch in eine Spin-Säule zu übertragen, und zentrifugieren Sie das Gemisch, wie gerade gezeigt.Sammeln Sie das Filtrat, das die TEV-gesponnenen, gereinigten Motoren enthält, und aliquotieren Sie das Filtrat in 50-Mikroliter-Volumen für die Mikrotubuli-Affinitätsreinigung. Dann blitzen die Aliquots in flüssigem Stickstoff für minus 80 Grad Celsius Lagerung ein. Zur Fahrwerksreinigung am späten Nachmittag des Tages vor der Reinigung 80 Mikroliter der Konzentration von Glycerin im Origami-Faltpuffer in einem Zentrifugenrohr vorsichtig schichten.Die Grenzen zwischen den Ebenen sollten leicht sichtbar sein. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius 10% Glycerin im Origami-Faltpuffer in gefalteter Chassislösung über die oberste Schicht des Farbverlaufs schichten und den Farbverlauf mit dem Chassis zentrieren. Am Ende der Zentrifugation 50-Mikroliter-Fraktionen des Gradienten in einer Von-boden-Richtung sammeln und fünf Mikroliter jeder Fraktion in einzelne Brunnen eines 2%Agarose-Gels laden.Nach 90 bis 120 Minuten bei 70 Volt, stellen Sie das Gel unter Bedingungen, die für den verwendeten DNA-Gel-Fleck geeignet sind. Quantifizierte Konzentrationen der ausgewählten Zinsfraktionen können mit den entsprechenden standardspektroskopischen Methoden bestimmt werden. Die SDS-PAGE-Analyse kann verwendet werden, um die erfolgreiche Extraktion von Dynein aus Hefe zu bestätigen, da das endgültige Filtrat ein klares, scharfes Band bei ca. 350 Kilodalton enden weist.TEV-Protease ist auch im endletzten Filtrat enthalten und bildet bei etwa 50 Kilodaltonen ein klares Band. Nach der Mikrotubuli-Affinitätsreinigung erscheint Dynein als klares Einzelband bei 350 Kilodaltonen, während Kinesin als leicht verschmiert werden kann, mehrere Bänder bei etwa 120 Kilodaltonen. Neben der TEV-Protease kann auch eine spürbare Menge Tubulin im letzten Überstand beobachtet werden.Die Faltung von DNA-Origami-Strukturen kann durch Agarose-Gel-Elektrophorese beobachtet werden, mit einer Verschiebung der Mobilität zwischen dem reinen, aufgeklappten Gerüststrang und der Faltreaktion, die auf Origamifaltung hinweist. Darüber hinaus weist die Faltreaktion auf eine gewisse Multimerisierung von Fahrwerksstrukturen hin. Die Beweglichkeit von Motorchassis-Ensembles ist leicht nachweisbar und messbar auf Kymographen, die aus TIRF-Filmen generiert werden, da die Kymographen flexibler Chassis, die zu sieben Dynein-Proteinen konjugiert sind, hochgradig prozessive Durchläufe bei relativ konstanten Geschwindigkeiten zeigen.Es ist wichtig, die Temperatur der motorischen Proteine bei jedem Schritt des Verfahrens sorgfältig zu kontrollieren. Nach der Reinigung der motorischen Proteine und des DNA-Origami-Chassis können die beiden Komponenten für Motilitätstests der Ensembles unter einem TIRF-Mikroskop konjugiert werden. Diese Methode ermöglicht die Entschlüsselung der biophysikalischen und biochemischen Mechanismen, die die entstehende Beweglichkeit der Motorensembles steuern.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

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Forschung

Biochemie

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