Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Ringraziamo K. Chau, J. Morgan e A. Driller-Colangelo per aver contribuito alle tecniche del telaio segmentato di origami di DNA. Ringraziamo anche gli ex membri dei laboratori Reck-Peterson e Shih per le discussioni utili e i contributi allo sviluppo originale di queste tecniche. Ringraziamo J. Wopereis e lo Smith College Center for Microscopy and Imaging e L. Bierwert e lo Smith College Center for Molecular Biology. Ringraziamo con gratitudine il programma di risonanza magnetica NSF per l'acquisizione di un microscopio TIRF.

1. Crescita, espressione e raccolta di proteine motorie controllate da un promotore indotto da galactose
<ol><li>Utilizzando un piatto di coltura lievito-peptone-dextrose (YPD) e un bastone sterile inoculante, striscia desiderata ceppo di lievito congelato e incubare per 3-4 giorni a 30 .</li>
	<li>Giorno 1 della crescita culturale: nel pomeriggio, aggiungere 10 mL di media di cultura YP con 2% di decaforo a un tubo di coltura del vetro di 1" di diametro e inocularlo con una singola colonia dal piatto. Crescere in un t...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

Le tecniche di costruzione molecolare degli origami del DNA forniscono un modo unico per costruire insiemi motori con architetture definite, numeri motori e tipi, consentendo studi su come il comportamento emergente deriva da specifiche configurazioni motorie31. Mentre gli studi strutturali e cellulari continuano a chiarire esempi di motori citoscheletrici che lavorano in team, le tecniche per isolare e studiare i meccanismi biofisici e biochimici dei motori negli insiemi stanno crescendo in utili...

La dineina e la cinesia sono proteine motorie citoscheletriche responsabili di una miriade di funzioni nelle cellule eucariotiche1. Convertendo l'energia chimica dell'idrolisi ATP in lavoro produttivo, questi motori traslocano sui microtubuli per trasportare e distribuire vari carichi intracellulari. Si coordinano anche nei massicci riarrangiamenti intracellulari associati alla mitosi, dove esibiscono forze orchestrate che contribuiscono al posizionamento e alla separazione dei cromosomi. I saggi strutturali, biochimici e biofisici, comprese le osservazioni su singola molecola, hanno rivelato i meccanismi di questi motori a livello individuale (ben esaminati nei lavori precedenti2,3,4). Tuttavia, molti dei compiti dei motori richiedono loro di lavorare in piccoli gruppi di motori simili e misti. Comparativamente meno si intende i meccanismi che coordinano l'attività e la motilità emergente finale di questi insiemi5,6. Questa lacuna di conoscenze è dovuta, in parte, alla difficoltà di creare insiemi con caratteristiche controllabili, come il tipo di motore e il numero di copia. Nell'ultimo decennio, le tecniche di costruzione molecolare degli origami di DNA sono state impiegate per risolvere questo problema. Per i motori basati su microtubuli, alcuni esempi di queste indagini includono osservazioni a singola molecola di insiemi di dineeina citoplasmica-17,8,9, dineina intraflagellare11, vari motori kinesin12,13, e miscele di dine e kinesins7,14,15. Qui, forniamo dettagli sulla purificazione e l'etichettatura oligonucleotide dei motori da lievito7,16,17,18,19,20, il piegamento e purificazione degli origami di DNA segmentato con conformità regolabile8e l'imaging dei motori di lievito che prospettano le strutture del telaio7,18.
Costruire insiemi motori per l'osservazione in vitro a singola molecola richiede tre sforzi primari. Il primo è l'espressione, la purificazione e l'etichettatura dei costrutti motori adatti per l'attaccamento agli origami di DNA. Il secondo è la produzione e la purificazione di strutture definite di origami di DNA (spesso chiamato "telaio"). E la terza è la coniugazione dei motori alla struttura del telaio seguita dall'osservazione utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF). Qui, forniamo protocolli stabiliti per questo processo per motori ricombinanti a base di microtubuli purificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Sono stati studiati insiemi motori basati su origami di DNA utilizzando sia kinesin ariente15 che dynein7,8,18 costrutti prodotti in questo sistema di espressione del lievito16 ,17,18,19. Questo protocollo è valido per questi costrutti, dato che sono controllati dal promotore indotto da galactose, e fusi agli stessi tag proteici per la purificazione (linker proteasete TEV) e per la coniugazione dell'oligo del DNA (SNAPtag).
Ceppi di lievito specifici producono costrutti motori specifici. Ad esempio, la dineina utilizzata per studiare il ruolo della conformità del carico è stata purificata dal ceppo RPY10847,8. In generale, i ceppi contenenti costrutti motori con le opportune modifiche genetiche per l'espressione e la purificazione possono essere richiesti ai laboratori dopo aver pubblicato l'uso di tali motori. I costrutti con nuovi attributi come mutazioni o tag possono essere realizzati utilizzando tecniche genetiche ricombinanti, come la trasformazione acetato di litio21 e i kit commerciali. Sono stati pubblicati protocolli dettagliati per la creazione di proteine motorie modificate nel lievito per studi su singole molecole19. Oltre ai motori fusi al SNAPtag, le oligo utilizzate per etichettare i motori devono essere coniugate al substrato SNAP, benzylguanine (BG); Protocolli pubblicati in precedenza descrivono la formazione e la purificazione dei coniugi BG-oligo18. La strategia globale qui descritta è stata impiegata anche per motori basati su actin (vedi lavori precedenti per gli esempi22,23,24) e motori purificati da altri organismi e sistemi di espressione (vedi precedenti funziona per gli esempi7,9,10,11,12,13,14).
I microtubuli polimerizzati (MT) vengono utilizzati in questi esperimenti in due diverse procedure. La purificazione dell'affinità MT dei motori funzionali richiede MT che non sono etichettati con altri gruppi funzionali, mentre l'analisi motilità motor-ensemble TIRF richiede MT etichettati con biotina e fluorofori. In tutti i casi, le MT sono stabilizzate con taxol per prevenire la denaturazione. Il passaggio di purificazione dell'affinità MT viene utilizzato per rimuovere tutti i motori non motile con un'elevata affinità MT, in quanto questi motori possono alterare la motilità dell'insieme se coniugati a un telaio. Durante questo processo, i motori attivi dislegano le MT e rimangono in soluzione, mentre i motori a legame stretto girano verso il basso nel pellet MT. Questo aiuta a garantire che tutti i motori sul telaio provengono da una popolazione attiva.
Una varietà di strutture di origami di DNA sono stati utilizzati per studiare gli insiemi motori citoscheletrici. Con l'aumentare della comprensione meccanicistica del trasporto di insiemi, le strutture di origami del DNA impiegate negli esperimenti sono cresciute in complessità. In linea di principio, qualsiasi struttura potrebbe essere adattata a questo scopo a condizione che venga modificata per includere siti di fissaggio del DNA a filamento singolo per motori e fluorofori. Specifici progetti e attributi del telaio possono essere utili per sondare particolari domande sul comportamento emergente dei motori incui. Ad esempio, le aste rigide sono state utilizzate per sviluppare una conoscenza fondamentale di come il numero di copie influenzi il trasporto da parte di squadre di dine e kinesins7,15,18e piattaforme 2D sono state utilizzate per studiare l'ensemble di miosina navigazione delle reti actin22. Strutture con flessibilità variabile o regolabile sono state utilizzate per comprendere i ruoli di accoppiamento elastico tra motori e per sondare come la sincronizzazione passo influisce sulla sincronizzazione influisce sulla motilità8,24. Più recentemente, le strutture sferiche vengono utilizzate per ottenere informazioni su come i vincoli geometrici alla rilegatura del motore influenzano la dinamica della motilità25.
In questo protocollo, offriamo passaggi specifici per esperimenti di ensemble su telai segmentati con rigidità variabile. I siti di legame sullo chassis sono a volte indicati come "maniglie", mentre le sequenze di DNA complementari che legano queste maniglie sono chiamate "antihandle". Il numero di motori su questi telai è determinato da quali segmenti contengono punti metallici estesi con complementarità all'oligo antihandle sui motori con etichetta oligo. L'utilizzo di sequenze di maniglie diverse su segmenti diversi consente di associare diversi tipi di motori a posizioni specifiche sullo chassis. Il telaio qui dettagliato è composto da 7 segmenti rigidi sequenziali, ciascuno composto da 12 eliche di DNA a doppio filamento disposte in 2 anelli concentrici8. I segmenti rigidi contengono le maniglie del motore e sono collegati attraverso regioni che possono essere sia DNA a filamento singolo flessibile o DNA a doppio filamento rigido, a seconda dell'assenza o della presenza, rispettivamente, di graffette "linker". La conformità della struttura del telaio è quindi determinata dalla presenza o dall'assenza di questi elementi di base "linker". Vedere i rapporti precedenti per ulteriori dettagli e specifiche sequenze di DNA8. Inoltre, è possibile utilizzare più metodi per purificare lo chassis26. Il metodo di centrifugazione del gradiente di glicerolo di tasso-zonale27 è descritto qui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

I motori citoscheletrici sono responsabili di un'ampia varietà di funzioni nelle celle eucariotiche, tra cui mitosi, trasporto merci, motilità cellulare e altri. Molte di queste funzioni richiedono motori per operare in generale. Nonostante la ricchezza di conoscenze sui meccanismi dei singoli motori citoscheletrici, si sa relativamente meno sui meccanismi e sui comportamenti emergenti degli insiemi motori, tra cui esempi di cambiamenti nella processizia e nella velocità dell'insieme con modifica del numero del motore, della posizione e della configurazione. La nanotecnologia del DNA strutturale, e la tecnica specifica degli origami del DNA, consentono la costruzione molecolare di architetture ben definite di insiemi motori. La forma delle strutture di carico così come il tipo, il numero e il posizionamento dei motori sulla struttura possono essere tutti controllati. Qui, forniamo protocolli dettagliati per la produzione di questi insiemi e osservandoli utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna. Anche se queste tecniche sono state specificamente applicate per i motori citoscheletrici, i metodi sono generalizzabili ad altre proteine che si assemblano in complessi per svolgere i loro compiti. Nel complesso, il metodo degli origami del DNA per la creazione di insiemi ben definiti di proteine motorie fornisce un potente strumento per sezionare i meccanismi che portano a un comportamento motile emergente.

Le purificazioni di successo dei motori e delle strutture del telaio sono state svolte dall'elettroforesi in gel. L'analisi SDS-PAGE ha confermato la riuscita estrazione della dineina dal lievito (Figura 2), poiché il filtrato finale raccolto al punto 2.3.7 ha mostrato una banda chiara e nitida alla posizione di 350 kDa. Come previsto, questa banda didina era assente dal flusso e lavaggio che ha rimosso le proteine indesiderate, e le perline da cui la dinein...

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

L'obiettivo di questo protocollo è quello di formare insiemi di motori molecolari sulle nanostrutture di origami del DNA e osservare la motilità dell'insieme utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Il nostro protocollo è progettato per sondare i meccanismi biofisici che regolano il trasporto del carico da parte di squadre di proteine motorie citoscheletriche identiche o dirette in senso opposto. Utilizzando gli origami di DNA per la costruzione molecolare, questo metodo può scegliere per il tipo, il numero e la posizione dei motori su forme di carico definite con precisione. Mentre questo protocollo si concentra sui motori a base di microtubuli dynein e kinesin, è adattabile alla miosina motoria a base di actina, così come ad altri sistemi proteici che funzionano in modo cooperativo.Un aspetto impegnativo di questo protocollo è mantenere l'integrità e l'attività delle proteine motorie durante tutto il processo di purificazione, in quanto sono sensibili al calore e alla forza meccanica. Per indurre la crescita e l'espressione delle proteine motorie tramite il promotore del galattosio, utilizzare una bacchetta sterile per striare il ceppo di lievito congelato di interesse su un piatto di coltura di lievito-peptone-destrosio per un'incubazione da tre a quattro giorni a 30 gradi Celsius. Il quarto giorno di coltura, quando la densità ottica a 600 nanometri è compresa tra 1,5 e due, raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione e rimospendare il pellet in acqua per lavarle e consolidare le cellule in un'unica bottiglia.Ruotare di nuovo le cellule per la raccolta e rimondere il pellet in circa due millilitri di acqua doppia distillata. Quindi utilizzare una pipetta da 10 millilitri per erogare lentamente il liquame cellulare in azoto liquido una goccia alla volta per produrre pellet di cellule di lievito congelate. Per la purificazione delle proteine motorie, utilizzare un macinino da caffè di tipo lama pre-refrigerato con azoto liquido per macinare i pellet di lievito congelati in una polvere fine e trasferire la polvere di lievito in un bicchiere di vetro pre-refrigerato da 100 millilitri sul ghiaccio.Aggiungere un piccolo volume di tampone di lisi 4X appena preparato con integratori alla polvere in modo che la concentrazione finale del tampone non superi 1X e posizionare il becher in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius con agitazione continua con una spatola per scongelare rapidamente la polvere. Aggiungere ulteriore tampone 4X con integratori per portare la concentrazione finale del buffer a 1X nel lisato. Il volume finale è spesso compreso tra 25 e 30 millilitri.Quindi raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione e trasferire la proteina solubile contenente supernatante in un nuovo tubo conico da 50 millilitri sul ghiaccio. Per la purificazione dell'affinità IgG, aggiungere 200 microliter di sospensione di perline di affinità lavate all'estratto proteico e incubare la miscela a quattro gradi Celsius per un'ora con una rotazione delicata. Al termine dell'incubazione, filtrare la miscela attraverso la stessa colonna cromatografica utilizzata per preparare le perline a quattro gradi Celsius, seguita da due lavaggi con cinque millilitri di tampone di lavaggio per lavaggio sul ghiaccio.Dopo il secondo lavaggio, sciacquare le perline sul ghiaccio con cinque millilitri di tampone TEV, consentendo al tampone di drenare completamente dalla colonna. Per l'etichettatura dell'oligonucleotide del DNA, limitare la colonna cromatografica e incubare le perline motorie con 100 microlitri di tampone TEV integrati con da 10 a 20 micromolari dell'oligo di benzilguanina purificato a temperatura ambiente per 10-15 minuti, rimescolando delicatamente le perline una volta al minuto. Al termine dell'incubazione, lavare le perline quattro volte con tampone TEV fresco per lavaggio come appena dimostrato, prima di ricappare il fondo del tubo per consentire la sospensione delle perline motorie in non più di 200 microlitri di tampone TEV fresco.Per la scissione TEV, trasferire la sospensione del tallone del motore su un tubo a due millilitri, fondo rotondo, microcentrifugo e incubare le perline del motore con circa 0,3 unità di proteasi TEV per microlitro di miscela di perline motorie a 16 gradi Celsius per un'ora con rotazione delicata. Alla fine dell'incubazione, centrifugare le perline motorie e raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo. Quindi, utilizzare una punta di pipetta P1000 tagliata per trasferire la miscela su una colonna di spin e centrifugare la miscela come appena dimostrato.Raccogliere il filtrato contenente i motori tev-cleaved, purificati e aliquotare il filtrato in volumi da 50 microliter per la purificazione dell'affinità dei microtubuli. Quindi congelare le aliquote nell'azoto liquido per meno 80 gradi Celsius. Per la purificazione del telaio, nel tardo pomeriggio della giornata precedente la purificazione, strato delicato 80 microlitri ciascuno di concentrazione di glicerolo in tampone pieghevole di origami in un tubo di centrifuga.I limiti tra i livelli devono essere leggermente visibili. Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, strato 10%glicerolo in tampone pieghevole origami in soluzione di telaio piegato sopra lo strato superiore del gradiente, e centrifugare la pendenza con il telaio. Al termine della centrifugazione, raccogliere frazioni di 50 microlitri del gradiente in una direzione dall'alto verso il basso e caricare cinque microlitri di ogni frazione in singoli pozzi di un gel di agarosio al 2%.Dopo 90-120 minuti a 70 volt, immagini il gel utilizzando condizioni adatte alla macchia di gel di DNA utilizzata. Le concentrazioni quantificate delle frazioni di interesse selezionate possono essere determinate utilizzando i metodi spettroscopici standard appropriati. L'analisi SDS-PAGE può essere utilizzata per confermare il successo dell'estrazione della dynein dal lievito, poiché il filtrato finale mostra una banda chiara e affilata a circa 350 kilodaltoni.La proteasi TEV è presente anche nel filtrato finale e forma una banda chiara a circa 50 kilodalton. Dopo la purificazione dell'affinità dei microtubuli, la dyneina appare come una banda chiara e singola a 350 kilodalton, mentre la chiessina può essere osservata come leggermente spalmata, più bande a circa 120 kilodalton. Oltre alla proteasi TEV, una notevole quantità di tubulina può essere osservata anche nel supernatante finale.La piegatura delle strutture degli origami del DNA può essere saggiata dall'elettroforesi del gel di agarosio, con uno spostamento della mobilità tra il filamento di impalcatura puro aperto e la reazione pieghevole che indica la piegatura degli origami. Inoltre, la reazione pieghevole indica la presenza di alcune multimerizzazione delle strutture del telaio. La motilità degli insiemi di telai a motore è facilmente rilevabile e misurabile sui cimografi generati dai film TIRF, poiché i kymografi di telai flessibili coniugati a sette proteine di dynein dimostrano corse altamente processive a velocità relativamente coerenti.È fondamentale controllare attentamente la temperatura delle proteine motorie in ogni fase della procedura. Seguendo la purificazione delle proteine motorie e del telaio degli origami di DNA, i due componenti possono essere coniugati per saggi di motilità degli insiemi al microscopio TIRF. Questo metodo consente di decifrare i meccanismi biofisici e biochimici che regolano la motilità emergente degli insiemi motori.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Ricerca

Biochimica

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione del flusso Stretching Assay implementazione per studiare il trasporto di molecole lungo DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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