Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

우리는 분할 된 DNA 종이 접기 섀시의 기술에 기여 K. 차우, J. 모건, A. 드릴러 - 콜란젤로 감사합니다. 우리는 또한 이러한 기술의 원래 개발에 도움이 토론과 기여에 대한 렉 피터슨과 시 연구소의 전 회원에게 감사드립니다. 우리는 J. Wopereis와 현미경 검사법 및 화상 진찰을 위한 스미스 대학 센터 및 L. Bierwert 및 분자 생물학을 위한 스미스 대학 센터를 감사합니다. 우리는 TIRF 현미경의 취득을 위한 NSF MRI 프로그램을 감사하게 인정합니다.

1. 갈락토제 유도 프로모터에 의해 조절되는 모터 단백질의 성장, 발현 및 수확
<ol><li>효모-펩톤-덱스트로스(YPD) 배양 플레이트 및 멸균 접종 스틱을 사용하여, 30°C에서 3-4일 동안 냉동 효모 균주를 원하고 배양하였다.</li>
	<li>배양 1일차: 오후에 10 mL의 YP 배양 배지를 1" 직경의 유리 배양튜브에 2% 덱스트로스를 넣고 플레이트에서 단일 콜로니로 접종합니다. 밤새 30°C에서 빠르게 회전하는 롤러 ?...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

DNA 종이 접기의 분자 구성 기술은 정의 된 아키텍처, 모터 번호 및 유형으로 모터 앙상블을 구성하는 독특한 방법을 제공하여 특정 모터 구성31에서출현 하는 행동이 어떻게 발생하는지에 대한 연구를 가능하게합니다. 구조 및 세포 연구가 팀에서 작동하는 세포골격 모터의 예를 계속 해명함에 따라 앙상블에서 모터의 생물 물리학 및 생화학 적 메커니즘을 격리하고 조사하는 기...

다인과 키네신은 진핵 세포에 있는 무수한 기능에 책임 있는 세포골격 모터 단백질1. ATP 가수분해의 화학 적 에너지를 생산적인 작업으로 변환함으로써, 이 모터는 다양한 세포 내 화물을 운반하고 분배하기 위해 미세 소관에 전이합니다. 그(것)들은 또한 염색체의 위치 그리고 분리에 기여하는 편케한 힘을 전시하는 유사분열과 관련되었던 거대한 세포내 재배열에서 조정합니다. 단일 분자 관찰을 포함한 구조적, 생화학적 및 생화학적 분석을 통해 개별 수준에서 이러한 모터의 메커니즘이 밝혀졌습니다(전작2,3,4에서잘 검토됨). 그러나 모터의 많은 작업은 유사 모터 유형과 혼합 모터 유형의 작은 앙상블에서 작동하도록 요구합니다. 비교적 적은 이러한 앙상블의 활성 및 궁극적 인 출현 운동성을 조정하는 메커니즘에 대해 이해5,6. 이러한 지식 격차는 부분적으로 모터 유형 및 복사 번호와 같은 제어 가능한 기능을 갖춘 앙상블을 만드는 데 어려움이 있기 때문입니다. 지난 10 년 동안, DNA 종이 접기의 분자 건설 기술은이 문제를 해결하기 위해 채택되었습니다. 미세소관 계 모터의 경우, 이러한 조사의 몇 가지 예는 세포질 다인-17,8,9,intraflagellar dynein11의앙상블의 단일 분자 관찰을 포함한다. 다양한 키네신 모터12,13,및 다인및 키네신의 혼합물7,14,15. 여기에, 우리는 효모7,16,17,18,19,20에서모터의 정제 및 올리고 뉴클레오티드 라벨링의 세부 사항을 제공합니다. 접이식 및 정제 분할 된 DNA 종이 접기의 조정 준수8,및 섀시 구조를 추진 효모 모터의 이미징7,18.
시험관 내 단일 분자 관찰을 위한 모터 앙상블을 건설하려면 3차적인 노력이 필요합니다. 첫 번째는 DNA 종이 접기에 부착하기에 적합한 모터 구조의 발현, 정제 및 라벨링입니다. 두 번째는 정의 된 DNA 종이 접기 구조의 생산 및 정제 (종종 "섀시"라고도 합니다). 그리고 세 번째는 전체 내부 반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 관찰한 후 섀시 구조에 모터를 융합하는 것입니다. 여기서, 우리는 효모 사카로마이세스 세레비시아7, 16,17,18, 19. DNA 종이 접기 계 모터 앙상블은 재조합 키네신15 및 다인7,8,18 구성을 모두 사용하여 이 효모 발현 시스템에서 생산된구조(16)를 사용하여 조사되었다. ,17,18,19. 이 프로토콜은 갈락토제 유도 프로모터에 의해 제어되고, 정제(ZZ 및 TEV 프로테아제 링커) 및 DNA 올리고 어버전(SNAPtag)을 위한 동일한 단백질 태그에 융합된다는 점을 감안할 때 이들 구조에 대해 유효하다.
특정 효모 균주는 특정 모터 구조를 생성합니다. 예를 들어, 화물 순응의 역할을 연구하는 데 사용되는 다인은 변형성 RPY10847,8로부터정제되었다. 일반적으로, 발현 및 정제를 위한 적절한 유전자 변형을 갖는 모터 구조를 포함하는 균주는 이들 모터의 사용을 공표한 실험실로부터 요청될 수 있다. 돌연변이 또는 태그와 같은 새로운 특성을 갖는 구조는 리튬 아세테이트형질전환(21) 및 상용 키트와 같은 재조합 유전 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 단일 분자 연구를 위한 효모에서 변형된 모터 단백질을 만들기 위한 상세한 프로토콜은19. SNAPtag에 융합되는 모터 이외에, 모터를 라벨에 사용하는 올리고는 SNAP 기판, 벤질구아닌 (BG)에 공액되어야 합니다; 이전에 출판된 프로토콜은 BG-올리고접합부(18)의형성 및 정제를 기술한다. 여기에 설명된 전체 전략은 액틴 기반 모터(예:22,23,24참조) 및 다른 유기체 및 발현 시스템에서 정제된 모터(이전 참조)에도 사용되었습니다. 예제 7,9,10,11,12,13,14)에서작동합니다.
중합 된 미세 소관 (MTs)은 두 가지 다른 절차에서 이러한 실험에 사용됩니다. 기능성 모터의 MT 친화도 정제는 다른 작용기와 함께 라벨이 부착되지 않은 MT를 필요로 하며, 모터 앙상블 운동성 TIRF 분석법은 비오틴과 형광로광으로 표시된 MT를 필요로 합니다. 모든 경우에, MT는 변이를 방지하기 위해 탁솔으로 안정화됩니다. MT 선호도 정제 단계는 이러한 모터가 섀시에 컨쥬게이션된 경우 앙상블 운동성을 변경할 수 있기 때문에 MT 친화성이 높은 비운동성 모터를 제거하는 데 사용됩니다. 이 과정에서 액티브 모터는 MT를 결합해제하고 용액에 남아 있는 반면, 타이트 바인딩 모터는 MT 펠릿에서 스핀다운됩니다. 이를 통해 섀시에 있는 모든 모터가 활성 집단에서 온 것을 확인할 수 있습니다.
다양한 DNA 종이 접기 구조가 세포골격 모터 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 앙상블 수송의 기계론적인 이해가 증가함에 따라, 실험에서 채택된 DNA 종이 접기 구조물은 복잡성에서 증가했습니다. 원칙적으로, 모든 구조는 모터 및 형광단에 대한 단일 가닥 DNA 부착 부위를 포함하도록 변형되는 경우 이러한 목적을 위해 적응될 수 있다. 특정 섀시 설계 및 특성은 모터 앙상블의 긴급 한 동작에 대 한 특정 질문을 검색하는 데 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 단단한 막대는 카피 수가 다인과 키네신7,15,18및 2D 플랫폼의 팀에 의한 수송에 미치는 영향에 대한 기초 지식을 개발하는 데 사용되어 미오신 앙상블을 연구하는 데 사용되었습니다. 액틴 네트워크22의네비게이션 . 가변 또는 튜닝 가능한 유연성을 가진 구조는 모터 간의 탄성 결합의 역할을 이해하고 스테핑 동기화가 운동성8,24에미치는 영향을 조사하는 데 사용되었습니다. 최근에는 구형 구조가 모터 트랙 바인딩에 대한 기하학적 제약조건이 운동성25의역학에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되고 있습니다.
이 프로토콜에서는 가변 강성을 가진 분할된 섀시에 대한 앙상블 실험을 위한 특정 단계를 제공합니다. 섀시에 바인딩 사이트는 때때로 "핸들"이라고, 이러한 핸들을 바인딩 하는 상보적인 DNA 서열 은 "안티 핸들"이라고 합니다. 이 섀시에 있는 모터의 수는 올리고 라벨이 부착된 모터의 안티핸들 올리고에 대한 상보성을 갖춘 확장된 핸들 스테이플을 포함하는 세그먼트에 의해 결정됩니다. 서로 다른 세그먼트에서 서로 다른 핸들 시퀀스를 사용하면 섀시에서 특정 위치에 다양한 유형의 모터를 바인딩할 수 있습니다. 여기에 상세한 섀시는 7 개의 순차적 강성 세그먼트로 구성되며, 각각 2 개의 동심원8에배치 된 12 개의 이중 가닥 DNA 나선으로 구성됩니다. 단단한 세그먼트는 모터 손잡이를 포함하고 "링커" 스테이플의 부재 또는 존재에 따라 유연한 단일 가닥 DNA 또는 단단한 이중 가닥 DNA일 수 있는 지구를 통해 연결됩니다. 섀시 구조의 준수는 이러한 "링커" 스테이플의 유무에 의해 결정됩니다. 자세한 내용 및 특정 DNA서열8에대한 이전 보고서를 참조하십시오. 또한, 여러 가지 방법을 사용하여섀시(26)를정화할 수 있다. 속도-글리세롤 그라데이션 원심분리방법(27)은 여기에 기재되어 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
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production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Cytoskeletal 모터는 진핵 세포에 있는 다양한 기능에 책임 있습니다, 유사분열, 화물 수송, 세포 운동성, 및 그 외를 포함하여. 이러한 기능 의 대부분은 앙상블에서 작동 모터가 필요합니다. 개별 cytoskeletal 모터의 메커니즘에 대한 풍부한 지식에도 불구하고, 상대적으로 적은 모터 앙상블의 메커니즘과 출현 행동에 대해 알려져있다, 그 예로 는 앙상블 프로세스성 및 속도에 대한 변화를 포함 모터 번호, 위치 및 구성을 변경합니다. 구조 DNA 나노 기술 및 DNA 종이 접기의 특정 기술은 모터 앙상블의 잘 정의 된 아키텍처의 분자 구조를 가능하게합니다. 화물 구조의 모양뿐만 아니라 구조에 모터의 유형, 수 및 배치를 모두 제어 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 앙상블을 생성하고 총 내부 반사 형광 현미경 검사법을 사용하여 그(것)들을 관찰하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 기술은 특히 세포골격 모터에 적용되었지만, 방법은 자신의 작업을 수행하기 위해 복합체에서 조립하는 다른 단백질에 일반화 할 수 있습니다. 전반적으로, 모터 단백질의 잘 정의된 앙상블을 만들기 위한 DNA 종이 접기 방법은 출현한 운동성 행동으로 이끌어 내는 기계장치를 해부하기 위한 강력한 공구를 제공합니다.

모터와 섀시 구조의 성공적인 정제는 겔 전기 동거의 분석되었다. SDS-PAGE 분석은 효모로부터다인의 성공적인 추출을확인(도 2)2.3.7단계에서 수집된 최종 여과액은 ~350 kDa의 위치에서 명확하고 날카로운 대역을 나타내보였다. 예상대로, 이 다인 밴드는 원치 않는 단백질을 제거하는 흐름과 세척에서 결석하고, 다인이 갈라진 구슬. 관측은 IgG 친화성 정...

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

우리의 프로토콜은 동일하거나 반대 방향 사이토스켈레탈 모터 단백질의 팀에 의해화물의 운송을 지배하는 생물 물리학 메커니즘을 조사하도록 설계되었습니다. 분자 구조에 DNA 종이 접기를 사용 하 여, 이 방법은 정확 하 게 정의 된 화물 모양에 모터의 종류, 수, 그리고 위치에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마이크로튜블러 기반 모터 다인과 키네신에 초점을 맞추고 있지만, 액틴 기반 모터 묘신뿐만 아니라 협력적으로 작동하는 다른 단백질 시스템에 적응할 수 있습니다.이 프로토콜의 한 가지 어려운 측면은 열및 기계적 힘에 민감하기 때문에 정제 공정 전반에 걸쳐 모터 단백질의 무결성과 활동을 유지하는 것입니다. 갈라토제 프로모터를 통한 모터 단백질 성장 및 발현을 유도하기 위해, 멸균 접종 지팡이를 사용하여 효모-펩톤-덱스트로스 배양 판에 대한 관심의 얼어붙은 효모 균주를 30°C에서 3-4일 간 배양한다. 배양 4일째에 600나노미터의 광학밀도가 1.5~2년 사이일 때, 원심분리에 의해 효모세포를 수집하고, 이를 세척하고 세포를 한 병에 통합하기 위해 물에서 펠릿을 재연한다.수집을 위해 세포를 다시 회전시키고, 이중 증류수의 약 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 세포 슬러리를 액체 질소 1방울로 천천히 분배하여 냉동 효모 세포 펠릿을 생성합니다. 모터 단백질 정제를 위해 액체 질소로 미리 냉각된 블레이드 형 커피 그라인더를 사용하여 냉동 효모 펠릿을 미세 한 분말로 갈아서 효모 분말을 얼음 위에 100 밀리리터, 유리 비커로 옮춥니다.완충제의 최종 농도가 1X를 초과하지 않도록 분말에 보충제를 사용하여 소량의 갓 준비된 4X 용해 버퍼를 추가하고, 주걱으로 연속 교반하여 37도 의 수조에 비커를 배치하여 분말을 빠르게 해동시합니다. 보충교재와 함께 추가 4X 버퍼를 추가하여 최종 버퍼 농도를 1X로 끌어올래로 연결합니다. 최종 볼륨은 종종 사이 25 그리고 30 밀리 리터.그런 다음 원심분리에 의해 효모 세포를 수집하고, 얼음에 새로운 50 밀리리터 원피스 튜브로 슈퍼나탄을 함유하는 용해성 단백질을 전달한다. IgG 선호도 정제의 경우, 200 마이크로리터의 세척된 친화성 비드 현탁액을 단백질 추출물에 넣고, 부드러운 회전으로 1시간 동안 섭씨 4도에서 혼합물을 배양한다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 구슬을 준비하는 데 사용되는 동일한 크로마토그래피 컬럼을 통해 혼합물을 필터링하고 얼음에 세척당 세척 버퍼 5 밀리리터가 있는 2개의 세척을 합니다.두 번째 세척 후, TEV 버퍼의 5 밀리리터와 얼음에 구슬을 헹구어 버퍼가 열에서 완전히 배출할 수 있도록 합니다. DNA 올리고뉴클레오티드 라벨링의 경우 크로마토그래피 컬럼을 캡팅하고, 10~15분 동안 실온에서 정제된 벤질구아닌 올리고의 10~20마이크로몰라로 보충된 TEV 버퍼 100 마이크로리터로 모터 비즈를 배양하여 1분에 한 번 부드럽게 비드를 재연한다. 인큐베이션이 끝나면, 튜브 의 바닥을 재조정하기 전에 200 마이크로리터의 신선한 TEV 버퍼로 모터 구슬의 재서스펜션을 허용하기 전에, 세척당 신선한 TEV 버퍼로 구슬을 네 번 세척하십시오.TEV 골짜기의 경우 모터 비드 서스펜션을 2밀리리터, 라운드 하부, 미세센심분리기 튜브로 옮기고 모터 비드 혼합물의 마이크로리터당 약 0.3단위로 모터 비드를 16°C의 부드러운 회전으로 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 모터 구슬원심분리하고 튜브의 바닥에 혼합물을 수집합니다. 다음으로, 절단 P1000 파이펫 팁을 사용하여 혼합물을 스핀 컬럼으로 옮기고, 방금 입증된 혼합물을 원심분리한다.미세투막 선호도 정화를 위해 TEV-클리브, 정제 모터 및 알리쿼트에 50 마이크로리터 부피로 여과물을 포함하는 여과물을 수집합니다. 그런 다음 액체 질소에 알리쿼트를 동결하여 섭씨 80도까지 보관합니다. 섀시 정화를 위해, 정화 전날 늦은 오후에, 원심분리기 튜브내 종이 접기 접이식 완충제에서 글리세롤의 각 농도 80 마이크로리터를 부드럽게 층화한다.레이어 사이의 경계가 약간 표시되어야 합니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한 후, 그라데이션의 상부 층 위에 접힌 섀시 용액의 종이 접기 접이식 버퍼에 10% 글리세롤을 층으로, 섀시로 그라데이션을 원심분리한다. 원심 분리의 끝에서, 상부에서 하단 방향으로 그라데이션의 50 마이크로 리터 분획을 수집하고, 2 % 아가로즈 젤의 개별 우물에 각 분획의 다섯 마이크로 리터를로드합니다.70볼트에서 90~120분 후에, 사용된 DNA 젤 얼룩에 적합한 조건을 사용하여 젤을 이미지한다. 선택된 분획의 정량화된 농도는 적절한 표준 분광 방법을 사용하여 결정될 수 있다. SDS-PAGE 분석은 최종 여과가 약 350킬로달톤의 명확하고 날카로운 밴드를 나타내기 때문에 효모로부터 다인의 성공적인 추출을 확인하는 데 사용될 수 있다.TEV 프로테아제는 또한 최종 여과에 존재하며 약 50 킬로달톤에서 선명한 밴드를 형성합니다. 마이크로투불 친화성 정화 후, 다인은 350킬로달톤의 투명 한 단일 밴드로 나타나며, 키네신은 약 120 킬로달톤에서 약간 번짐, 여러 밴드로 관찰 될 수 있습니다. TEV 프로테아제 외에도 최종 상부에서 눈에 띄는 양의 튜룰린을 관찰할 수 있습니다.DNA 종이 접기 구조의 접는 순수한 전개 된 스캐폴드 가닥과 종이 접이식 접이식을 나타내는 접이식 반응 사이의 이동성의 변화와 함께 아가로즈 젤 전기 포에 의해 분석 될 수 있습니다. 또한 접이식 반응은 섀시 구조의 일부 다중 수화의 존재를 나타냅니다. 7개의 다인 단백질에 결합된 유연한 섀시 의 키모그래프가 비교적 일관된 속도로 고도로 처리되는 주행을 보여주기 때문에 모터 섀시 앙상블의 운동성은 TIRF 영화에서 생성된 kymographs에서 쉽게 감지가능하고 측정할 수 있습니다.절차의 각 단계에서 모터 단백질의 온도를 주의 깊게 제어하는 것이 중요합니다. 모터 단백질과 DNA 종이 접기 섀시의 정제에 따라, 두 성분은 TIRF 현미경의 밑에 앙상블의 운동성 분석에 대해 공질될 수 있다. 이 방법은 모터 앙상블의 비상 적인 운동성을 제어하는 생체 물리학 및 생화학 적 메커니즘을 해독 할 수 있게합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

연구

생화학

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

라이브 셀 슈퍼 분해능 현미경 및 단일 분자 추적을 위한 기존의 BODIPY 접합체

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA에 조립되는 EWS-FLI1 응축수의 단일 분자 이미징

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...