Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
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Agradecemos K. Chau, J. Morgan, e A. Driller-Colangelo por contribuir para as técnicas do chassi de origami de DNA segmentada. Também agradecemos aos antigos membros dos laboratórios Reck-Peterson e Shih por discussões úteis e contribuições para o desenvolvimento original dessas técnicas. Agradecemos a J. Wopereis e o Smith College Center for microscopia and Imaging e L. Bierwert e o Smith College Center for molecular biology. Nós reconhecemos agradavelmente o programa da NSF MRI para a aquisição de um microscópio de TIRF.

1. crescimento, expressão e colheita de proteínas motoras controladas por um promotor induzido por galactose
<ol><li>Usando uma placa de cultura de levedura-peptona-dextrose (YPD) e uma vara de inocular estéril, raia desejada estirpe de levedura congelada e incubar por 3-4 dias a 30 ° c.</li>
	<li>Dia 1 de crescimento da cultura: na parte da tarde, adicione 10 mL de mídia de cultura YP com dextrose a 2% a um tubo de cultura de vidro de 1 "de diâmetro e inocula-o com uma única colônia da placa. Cresça em um cil...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

As técnicas de construção molecular do DNA origami proporcionam uma maneira única de construir conjuntos de motores com arquiteturas definidas, números de motores e tipos, possibilitando estudos de como o comportamento emergente surge a partir de configurações específicas do motor31. Como os estudos estruturais e celulares continuam a elucidar exemplos de motores citoesqueléticos que trabalham em equipes, técnicas para isolar e investigar os mecanismos biofísicos e bioquímicos dos moto...

A dynein e a cinesina são proteínas do motor citoesquelético responsáveis por inúmeras funções em células eucarióticas1. Convertendo a energia química da hidrólise de ATP em trabalho produtivo, estes motores translocam em microtúbulos para transportar e distribuir várias cargas intracelulares. Eles também coordenam os rearranjos intracelulares maciços associados à mitose, onde exibem forças orquestradas que contribuem para o posicionamento e separação dos cromossomas. Ensaios estruturais, bioquímicos e biofísicos, incluindo observações de moléculas únicas, revelaram os mecanismos desses motores no nível individual (bem revisado em trabalhos anteriores2,3,4). No entanto, muitas das tarefas dos motores exigem que trabalhem em pequenos conjuntos de tipos de motor semelhantes e mistos. Comparativamente menos é compreendido sobre os mecanismos que coordenam a atividade e a motilidade emergente final destes conjuntos5,6. Essa lacuna de conhecimento é devida, em parte, à dificuldade em criar conjuntos com características controláveis, como tipo de motor e número de cópia. Durante a última década, as técnicas de construção molecular de DNA origami têm sido empregadas para resolver este problema. Para os motores baseados em microtúlulas, alguns exemplos dessas investigações incluem a única molécula de observações de conjuntos de dynein citoplasmático-17,8,9, dynein intraflagellar11, vários motores de cinesina12,13, e misturas de ambos os dyneins e kinesins7,14,15. Aqui, nós fornecemos detalhes da purificação e oligonucleotide rotulagem de motores de levedura7,16,17,18,19,20, o dobradura e purificação de origami de DNA segmentada com conformidade sintonável8, e a imagem dos motores de levedura impulsionando as estruturas do chassi7,18.
Construir conjuntos de motor para a observação in vitro da molécula única exige três esforços preliminares. O primeiro é a expressão, purificação e rotulagem de construções motoras adequadas para anexar ao DNA origami. O segundo é a produção e purificação de estruturas de origami DNA definido (muitas vezes denominado "chassis"). E a terceira é a conjugação dos motores à estrutura do chassi seguida da observação usando a microscopia interna total da fluorescência da reflexão (TIRF). Aqui, nós fornecemos protocolos estabelecidos para este processo para os motores microtubule-baseados de recombinação purificados do fermento Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. os conjuntos de motor baseados em Origami de DNA foram investigados usando ambos os cinesina recombinante15 e dynein7,8,18 construções produzidas neste sistema de expressão de levedura16 ,17,18,19. Este protocolo é válido para estas construções, dado que são controlados pelo promotor induzido galactose, e fundidos aos mesmos Tag da proteína para a purificação (linker do protease de ZZ e de TEV) e para a conjugação do oligo do ADN (SNAPtag).
Cepas específicas de levedura produzem construções motoras específicas. Por exemplo, o dynein usado para estudar o papel da conformidade da carga foi purified da tensão RPY10847,8. Em geral, as cepas contendo construções motoras com as modificações genéticas apropriadas para expressão e purificação podem ser solicitadas a partir dos laboratórios que publicaram o uso desses motores. Construções com novos atributos como mutações ou Tags podem ser feitas usando técnicas genéticas recombinantes, como a transformação de acetato de lítio21 e kits comerciais. Os protocolos detalhados para criar proteínas de motor modificadas no fermento para estudos da única molécula foram publicados19. Além dos motores que estão sendo fundidos ao SNAPtag, os oligos usados para rotular os motores devem ser conjugados ao substrato SNAP, a benzilguanina (BG); os protocolos previamente publicados descrevem a formação e a purificação de conjugados de BG-oligo18. A estratégia global descrita aqui também foi empregada para motores baseados em Actin (ver trabalhos anteriores para exemplos22,23,24), e motores purificados de outros organismos e sistemas de expressão (ver anterior trabalhos para exemplos7,9,10,11,12,13,14).
Microtúbulos polimerizados (MTs) são utilizados nestes experimentos em dois procedimentos diferentes. A purificação da afinidade do MT de motores funcionais exige o MTs que não são etiquetados com outros grupos funcionais, quando o ensaio do TIRF da motilidade do motor-Ensemble exigir o MTs etiquetado com a biotina e os Fluorophores. Em todos os casos, os MTs são estabilizados com Taxol para evitar a desnaturação. A etapa da purificação da afinidade do MT é usada para remover todos os motores não-motile com uma afinidade elevada do MT, porque estes motores podem alterar a motilidade do conjunto se conjugados a um chassi. Durante este processo, os motores activos desligam os MTs e permanecem em solução, enquanto os motores de ligação apertada giram para baixo no pellet MT. Isso ajuda a garantir que todos os motores do chassi sejam de uma população ativa.
Uma variedade de estruturas do origami do ADN foi usada para estudar conjuntos do motor do cytoesquelético. Como a compreensão mecanicista do transporte de Ensemble aumentou, as estruturas de DNA origami empregadas em experimentos têm crescido em complexidade. Em princípio, qualquer estrutura poderia ser adaptada para este fim, desde que seja modificada para incluir sítios de fixação de ADN de ligação única para motores e fluoróforos. Os projetos e os atributos específicos do chassi podem ser úteis para sondar perguntas particulares sobre o comportamento emergente de conjuntos dos motores. Por exemplo, hastes rígidas têm sido usadas para desenvolver o conhecimento fundamental de como o número de cópias afeta o transporte por equipes de dyneins e kinesins7,15,18e 2D plataformas têm sido usadas para estudar miosina Ensemble navegação das redes actina22. As estruturas com flexibilidade variável ou sintonizável foram usadas para compreender as funções do acoplamento elástico entre motores e para sondar como a sincronização de piso afeta a motilidade8,24. Mais recentemente, as estruturas esféricas estão sendo usadas para obter a introspecção em como as limitações geométricas à ligação da motor-trilha afetam a dinâmica da motilidade25.
Neste protocolo, nós oferecemos etapas específicas para experiências do conjunto no chassi segmentado com rigidez variável. Os locais de ligação no chassi são chamados às vezes como "punhos", quando as seqüências complementares do ADN que ligam estes punhos forem denominadas "antihandles". O número de motores nestes chassis é determinado pelo qual os segmentos contêm grampos extendidos do punho com complementaridade ao oligo do antihandle nos motores oligo-etiquetados. O uso de diferentes sequências de alça em diferentes segmentos permite a vinculação de diferentes tipos de motores a locais específicos no chassi. O chassi detalhado aqui é compor de 7 segmentos rígidos sequenciais, cada um compreendido de 12 hélices dobro-encalhado do ADN arranjados em 2 anéis concêntricos8. Os segmentos rígidos contêm os punhos do motor e são conectados através das regiões que podem ser o ADN único-encalhado flexível ou o ADN dobro-encalhado rígido, dependendo da ausência ou da presença, respectivamente, de grampos do "linker". A conformidade da estrutura do chassi é determinada assim pela presença ou pela ausência destes grampos do "linker". Veja os relatórios precedentes para mais detalhes e seqüências específicas8do ADN. Além disso, vários métodos podem ser usados para purificar o chassi26. O método de centrifugação de gradiente de glicerol taxa-zonal27 é descrito aqui.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Os motores do citoesqueleto são responsáveis para uma grande variedade de funções em pilhas eucarióticas, incluindo o mitosis, o transporte da carga, a motilidade celular, e outro. Muitas dessas funções exigem motores para operar em conjuntos. Apesar de uma riqueza de conhecimento sobre os mecanismos dos motores citoesqueléticos individuais, comparativamente menos se sabe sobre os mecanismos e comportamentos emergentes de conjuntos de motores, exemplos dos quais incluem mudanças na processividade do conjunto e velocidade com alterando o número do motor, a localização e a configuração. A nanotecnologia de DNA estrutural, e a técnica específica de DNA origami, permite a construção molecular de arquiteturas bem definidas de conjuntos de motores. A forma das estruturas da carga assim como o tipo, o número e a colocação dos motores na estrutura podem tudo ser controlados. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para produzir estes conjuntos e observá-los usando a microscopia de fluorescência interna total da reflexão. Embora essas técnicas tenham sido especificamente aplicadas para os motores citoesqueléticos, os métodos são generalizáveis para outras proteínas que se reúnem em complexos para realizar suas tarefas. Globalmente, o método de DNA origami para a criação de conjuntos bem definidos de proteínas do motor fornece uma poderosa ferramenta para dissecação dos mecanismos que levam ao comportamento motile emergente.

Purificações bem-sucedidas de motores e estruturas de chassis foram ensaiadas por eletroforese em gel. A análise de SDS-PAGE confirmou a extração bem sucedida de dynein do fermento (Figura 2), porque o filtrado final coletado na etapa 2.3.7 mostrou uma faixa desobstruída, afiada na posição de ~ 350 kDa. Como esperado, esta faixa do dynein era ausente do flowthrough e da lavagem que removeram proteínas indesejadas, e os grânulos de que o dynein foi c...

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

O objetivo deste protocolo é formar conjuntos de motores moleculares em nanoestruturas de DNA origami e observar a motilidade do conjunto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total.

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Nosso protocolo foi projetado para sondar os mecanismos biofísicos que regem o transporte de carga por equipes de proteínas motoras citoesqueletal idênticas ou opostas. Usando origami de DNA para construção molecular, este método pode escolher o tipo, número e localização dos motores em formas de carga precisamente definidas. Embora este protocolo se concentre nos motores baseados em microtúbulos dynein e quinase, ele é adaptável à miosina motora baseada em actina, bem como a outros sistemas proteicos que funcionam cooperativamente.Um aspecto desafiador deste protocolo é manter a integridade e a atividade das proteínas motoras durante todo o processo de purificação, pois são sensíveis ao calor e à força mecânica. Para induzir o crescimento e a expressão da proteína motora através do promotor galactose, use uma varinha de inoculação estéril para esticar a levedura congelada de interesse em uma placa de cultura levedura-peptone-dextrose para uma incubação de três a quatro dias a 30 graus Celsius. No quarto dia da cultura, quando a densidade óptica em 600 nanômetros está entre 1,5 e 2, recolhe as células de levedura por centrifugação, e resuspensa a pelota na água para lavá-las e consolidar as células em uma única garrafa.Gire as células novamente para coleta, e resuspense a pelota em cerca de dois mililitros de água duplamente destilada. Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para distribuir lentamente o chorume celular em nitrogênio líquido uma gota de cada vez para produzir pelotas de células de levedura congeladas. Para purificação de proteínas motoras, use um moedor de café do tipo lâmina pré-refrigerado com nitrogênio líquido para moer as pelotas de levedura congelada em um pó fino, e transfira o fermento em um béquer de vidro pré-refrigerado, de 100 mililitros, no gelo.Adicione um pequeno volume de tampão de lise 4X recém-preparado com suplementos ao pó para que a concentração final do buffer não exceda 1X, e coloque o béquer em um banho de água Celsius de 37 graus com agitação contínua com uma espátula para descongelar rapidamente o pó. Adicione tampão 4X adicional com suplementos para levar a concentração final do buffer para 1X no lysate. O volume final é muitas vezes entre 25 e 30 mililitros.Em seguida, colete as células de levedura por centrifugação, e transfira a proteína solúvel contendo supernante em um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Para purificação de afinidade IgG, adicione 200 microliter de suspensão de contas de afinidade lavada ao extrato de proteína, e incubar a mistura a quatro graus Celsius por uma hora com rotação suave. No final da incubação, filtre a mistura através da mesma coluna de cromatografia usada para preparar as contas a quatro graus Celsius, seguida por duas lavagens com cinco mililitros de tampão de lavagem por lavagem no gelo.Após a segunda lavagem, enxágue as contas no gelo com cinco mililitros de tampão TEV, permitindo que o tampão escorra totalmente da coluna. Para rotulagem de oligonucleotídeos de DNA, cape a coluna de cromatografia e incuba as contas motoras com 100 microliters de tampão TEV suplementados com 10 a 20 micromolar do oligo de benzocaína purificada à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos, suavemente ressuse as contas uma vez por minuto. No final da incubação, lave as contas quatro vezes com tampão TEV fresco por lavagem como apenas demonstrado, antes de recapitular a parte inferior do tubo para permitir a ressuspensão das contas motoras em não mais do que 200 microliters de tampão TEV fresco.Para o decote TEV, transfira a suspensão do motor para um tubo de microcentrifus de dois mililitros, fundo redondo, microcentrifuus e incubar as contas motoras com aproximadamente 0,3 unidades de protease TEV por microliter de mistura de contas motoras a 16 graus Celsius por uma hora com rotação suave. No final da incubação, centrifufique as contas do motor e colete a mistura na parte inferior do tubo. Em seguida, use uma ponta de pipeta P1000 cortada para transferir a mistura para uma coluna de spin, e centrifugar a mistura como apenas demonstrado.Colete o filtrado contendo os motores tev-cleaved, purificado e alíquota do filtrado em volumes de 50 microliter para purificação de afinidade de microtúbulos. Em seguida, o flash congele as alíquotas em nitrogênio líquido para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para purificação do chassi, no final da tarde do dia anterior à purificação, coloque suavemente 80 microliters cada uma de concentração de glicerol em tampão dobrável de origami em um tubo de centrífuga.As fronteiras entre as camadas devem ser ligeiramente visíveis. Após uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius, camada 10% glicerol em buffer dobrável de origami na solução de chassi dobrado sobre a camada superior do gradiente, e centrífuga o gradiente com o chassi. No final da centrifugação, colete frações de 50 microliteres do gradiente em uma direção de cima para baixo, e carregue cinco microlitadores de cada fração em poços individuais de um gel de 2% de agarose.Após 90 a 120 minutos a 70 volts, imagem o gel usando condições adequadas para a mancha de gel de DNA usada. Concentrações quantificadas das frações de interesse selecionadas podem ser determinadas usando os métodos espectroscópicos padrão apropriados. A análise SDS-PAGE pode ser usada para confirmar a extração bem sucedida de dynein de levedura, já que o filtrado final mostra uma faixa clara e afiada a aproximadamente 350 kilodaltons.A protease TEV também está presente no filtrado final e forma uma banda clara em cerca de 50 kilodaltons. Após a purificação da afinidade com microtúbulos, dynein aparece como uma banda clara e única a 350 kilodaltons, enquanto a cinesina pode ser observada como ligeiramente manchada, múltiplas bandas em cerca de 120 kilodaltons. Além da protease TEV, uma quantidade notável de tubulina também pode ser observada no supernanato final.A dobra das estruturas de origami de DNA pode ser avaliada pela eletroforese do gel agarose, com uma mudança de mobilidade entre o fio puro desdobrado do andaime e a reação dobrável indicando a dobra de origami. Além disso, a reação dobrável indica a presença de alguma multimerização das estruturas do chassi. A motilidade dos conjuntos de chassis motorizados é facilmente detectável e mensurável em kymographs gerados a partir de filmes TIRF, já que os kymogramas de chassis flexíveis conjugados a sete proteínas dynein demonstram corridas altamente processivas em velocidades relativamente consistentes.É vital controlar cuidadosamente a temperatura das proteínas motoras em cada etapa do procedimento. Após a purificação das proteínas motoras e do chassi de origami de DNA, os dois componentes podem ser conjugados para ensaios de motilidade dos conjuntos sob um microscópio TIRF. Este método permite que os mecanismos biofísicos e bioquímicos que regem a motilidade emergente dos conjuntos motores sejam decifrados.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Bioquímica

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulação de único-molécula de G-quadruplexes por pinça magnética

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conjugados BODIPY convencionais para microscopia de super-resolução de células vivas e rastreamento de moléculas únicas

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...