Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
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Agradecemos a K. Chau, J. Morgan y A. Driller-Colangelo por contribuir a las técnicas del chasis segmentado de origami de ADN. También agradecemos a los antiguos miembros de los laboratorios Reck-Peterson y Shih por sus útiles discusiones y contribuciones al desarrollo original de estas técnicas. Agradecemos a J. Wopereis y al Smith College Center for Microscopy and Imaging y a L. Bierwert y al Smith College Center for Molecular Biology. Agradecemos el programa NSF MRI por la adquisición de un microscopio TIRF.

1. Crecimiento, expresión y cosecha de proteínas motoras controladas por un promotor inducido por galactosa
<ol><li>Usando una placa de cultivo de levadura-peptona-dextrosa (YPD) y un palo inoculante estéril, la raya deseada cepa de levadura congelada e incubar durante 3-4 días a 30 oC.</li>
	<li>Día 1 de crecimiento del cultivo: Por la tarde, añadir 10 mL de medios de cultivo YP con 2% de dextrosa a un tubo de cultivo de vidrio de 1" de diámetro e inocularlo con una sola colonia de la placa. Crece en un tambor ...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

Las técnicas de construcción molecular del origami de ADN proporcionan una manera única de construir conjuntos motores con arquitecturas definidas, números de motor y tipos, permitiendo estudios de cómo el comportamiento emergente surge de configuraciones motoras específicas31. A medida que los estudios estructurales y celulares continúan dilucidando ejemplos de motores citoesqueléticos que trabajan en equipos, las técnicas para aislar e investigar los mecanismos biofísicos y bioquímico...

La dinneina y la quinesina son proteínas motoras citoesqueléticas responsables de innumerables funciones en las células eucariotas1. Al convertir la energía química de la hidrólisis ATP en trabajo productivo, estos motores se translocan en microtúbulos para transportar y distribuir diversas cargas intracelulares. También se coordinan en los reordenamientos intracelulares masivos asociados con la mitosis, donde exhiben fuerzas orquestadas que contribuyen al posicionamiento y separación de los cromosomas. Ensayos estructurales, bioquímicos y biofísicos, incluidas observaciones de moléculas únicas, han revelado los mecanismos de estos motores a nivel individual (bien revisados en trabajos anteriores2,3,4). Sin embargo, muchas de las tareas de los motores requieren que trabajen en pequeños conjuntos de tipos de motores similares y mixtos. Comparativamente menos se entiende sobre los mecanismos que coordinan la actividad y la última motilidad emergente de estos conjuntos5,6. Esta brecha de conocimiento se debe, en parte, a la dificultad de crear conjuntos con características controlables, como el tipo de motor y el número de copia. Durante la última década, se han empleado las técnicas de construcción molecular del origami de ADN para resolver este problema. Para los motores basados en microtúbulos, algunos ejemplos de estas investigaciones incluyen observaciones de molécula única de conjuntos de dinneina citoplásmica-17,8,9, dinneina intraflagelar11, varios motores de kinesina12,13, y mezclas de dineinas y kinesinas7,14,15. Aquí, proporcionamos detalles de la purificación y etiquetado de oligonucleótidos de motores de levadura7,16,17,18,20, plegado y purificación de origami de ADN segmentado con conformidad ajustable8, y la toma de imágenes de los motores de levadura propulsando las estructuras del chasis7,18.
La construcción de conjuntos motores para la observación in vitro de molécula única requiere tres esfuerzos primarios. La primera es la expresión, purificación y etiquetado de construcciones motoras adecuadas para adherirse al origami de ADN. La segunda es la producción y purificación de estructuras de origami de ADN definidas (a menudo denominadas "chasis"). Y la tercera es la conjugación de los motores a la estructura del chasis seguida de la observación utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Aquí, proporcionamos protocolos establecidos para este proceso para motores recombinantes a base de microtúbulos purificados de la levadura Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. Se han investigado conjuntos motores a base de origami de ADN utilizando kinesina recombinante15 y dinaína7,8,18 construcciones producidas en este sistema de expresión de levadura16 ,17,18,19. Este protocolo es válido para estas construcciones, dado que están controladas por el promotor inducido por galactosa, y fusionadas a las mismas etiquetas proteicas para la purificación (vinculador de proteasa ZZ y TEV) y para la oligoconjugación de ADN (SNAPtag).
Las cepas de levadura específicas producen construcciones motoras específicas. Por ejemplo, la dinneina utilizada para estudiar el papel del cumplimiento de la carga se purificó a partir de la cepa RPY10847,8. En general, se pueden solicitar cepas que contengan construcciones motoras con las modificaciones genéticas apropiadas para la expresión y la purificación a los laboratorios que han publicado el uso de dichos motores. Las construcciones con atributos novedosos como mutaciones o etiquetas se pueden hacer utilizando técnicas genéticas recombinantes, como la transformación de acetato de litio21 y kits comerciales. Se han publicado protocolos detallados para la creación de proteínas motoras modificadas en levaduras para estudios de molécula única19. Además de los motores que se fusionan con el SNAPtag, los oligos utilizados para etiquetar los motores deben conjugarse con el sustrato SNAP, la bencileguanina (BG); Los protocolos publicados anteriormente describen la formación y purificación de BG-oligo conjugados18. La estrategia general descrita aquí también se ha empleado para motores basados en actina (véanse los trabajos anteriores, por ejemplo,22,23,24), y los motores purificados de otros organismos y sistemas de expresión (véase funciona por ejemplo7,9,10,11,12,13,14).
Los microtúbulos polimerizados (MT) se utilizan en estos experimentos en dos procedimientos diferentes. La purificación de afinidad MT de motores funcionales requiere MT que no estén etiquetados con otros grupos funcionales, mientras que el ensayo TIRF de motilidad de conjunto motor requiere MTs etiquetados con biotina y fluoróforos. En todos los casos, los MT se estabilizan con taxol para evitar la desnaturalización. El paso de purificación de afinidad MT se utiliza para eliminar cualquier motor no móvil con una alta afinidad MT, ya que estos motores pueden alterar la motilidad del conjunto si se conjugan a un chasis. Durante este proceso, los motores activos desuntan los MT y permanecen en solución, mientras que los motores de unión ajustada giran hacia abajo en el pellet MT. Esto ayuda a garantizar que todos los motores del chasis sean de una población activa.
Se ha utilizado una variedad de estructuras de origami de ADN para estudiar conjuntos motores citoesqueléticos. A medida que la comprensión mecanicista del transporte de conjuntos ha aumentado, las estructuras de origami de ADN empleadas en experimentos han crecido en complejidad. En principio, cualquier estructura podría adaptarse para este fin siempre que se modifique para incluir sitios de unión de ADN de una sola cadena para motores y fluoróforos. Los diseños y atributos específicos del chasis pueden ser útiles para sondear preguntas particulares sobre el comportamiento emergente de los conjuntos de motores. Por ejemplo, se han utilizado varillas rígidas para desarrollar conocimientos fundamentales de cómo el número de copia afecta al transporte por equipos de dininyins y kinesins7,15,18y 2D plataformas se han utilizado para estudiar el conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina navegación de las redes actin22. Se han utilizado estructuras con flexibilidad variable o ajustable para comprender las funciones del acoplamiento elástico entre motores y para sondear cómo la sincronización escalonada afecta a la motilidad8,24. Más recientemente, las estructuras esféricas se utilizan para obtener información sobre cómo las restricciones geométricas a la unión de vías motoras afectan a la dinámica de la motilidad25.
En este protocolo, ofrecemos pasos específicos para experimentos de conjunto en chasis segmentados con rigidez variable. Los sitios de enlace en el chasis a veces se conocen como "manijas", mientras que las secuencias de ADN complementarias que unen estas asas se denominan "antimanijas". El número de motores en estos chasis está determinado por el cual los segmentos contienen grapas de mango extendidas con complementariedad con el oligo handle en los motores oligoetiquetados. El uso de diferentes secuencias de mango en diferentes segmentos permite la unión de diferentes tipos de motores a ubicaciones específicas en el chasis. El chasis detallado aquí se compone de 7 segmentos rígidos secuenciales, cada uno compuesto por 12 hélices de ADN de doble cadena dispuestas en 2 anillos concéntricos8. Los segmentos rígidos contienen las manijas del motor y están conectados a través de regiones que pueden ser ADN flexible de una sola cadena o ADN rígido de doble cadena, dependiendo de la ausencia o presencia, respectivamente, de grapas "linker". Por lo tanto, el cumplimiento de la estructura del chasis viene determinado por la presencia o ausencia de estas grapas "linker". Véanse los informes anteriores para obtener más detalles y secuencias de ADN específicas8. Además, se pueden utilizar varios métodos para purificar el chasis26. El método de centrifugación de gradiente de glicerol zonal de velocidad27 se describe aquí.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Los motores citoesqueléticos son responsables de una amplia variedad de funciones en las células eucariotas, incluyendo mitosis, transporte de carga, motilidad celular, y otros. Muchas de estas funciones requieren motores para funcionar en conjuntos. A pesar de una gran cantidad de conocimientos sobre los mecanismos de los motores citoesqueléticos individuales, comparativamente menos se sabe acerca de los mecanismos y comportamientos emergentes de los conjuntos motores, ejemplos de los cuales incluyen cambios en la procesabilidad y velocidad del conjunto con cambiar el número de motor, la ubicación y la configuración. La nanotecnología de ADN estructural, y la técnica específica del origami de ADN, permite la construcción molecular de arquitecturas bien definidas de conjuntos motores. La forma de las estructuras de carga, así como el tipo, número y colocación de los motores en la estructura se pueden controlar. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para producir estos conjuntos y observarlos utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Aunque estas técnicas se han aplicado específicamente para motores citoesqueléticos, los métodos son generalizables a otras proteínas que se ensamblan en complejos para realizar sus tareas. En general, el método de origami de ADN para crear conjuntos bien definidos de proteínas motoras proporciona una poderosa herramienta para disección de los mecanismos que conducen a un comportamiento móvil emergente.

Las purificaciones exitosas de motores y estructuras de chasis fueron analizadas por electroforesis de gel. El análisis SDS-PAGE confirmó la extracción exitosa de dinaína de la levadura(Figura 2),ya que el filtrado final recogido en el paso 2.3.7 mostró una banda clara y afilada en la posición de 350 kDa. Como era de esperar, esta banda de dynein estaba ausente del flujo y lavado que eliminaba las proteínas no deseadas, y las perlas de las que se ausen...

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Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

El objetivo de este protocolo es formar conjuntos de motores moleculares en nanoestructuras de origami de ADN y observar la motilidad del conjunto utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Nuestro protocolo está diseñado para sondear los mecanismos biofísicos que rigen el transporte de carga por equipos de proteínas motoras citoesqueléticas idénticas o dirigidas opuestamente. Mediante el uso de origami de ADN para la construcción molecular, este método puede elegir el tipo, el número y la ubicación de los motores en formas de carga definidas con precisión. Mientras que este protocolo se centra en los motores basados en microtúbulos dynein y kinesina, es adaptable a la miosina motora basada en actina, así como a otros sistemas de proteínas que funcionan de forma cooperativa.Un aspecto desafiante de este protocolo es mantener la integridad y la actividad de las proteínas motoras durante todo el proceso de purificación, ya que son sensibles al calor y a la fuerza mecánica. Para inducir el crecimiento y la expresión de proteínas motoras a través del promotor de la gactosa, utilice una varita de inoculación estéril para rayar la cepa de levadura congelada de interés en una placa de cultivo de levadura-peptona-dextrosa para una incubación de tres a cuatro días a 30 grados centígrados. En el cuarto día de cultivo, cuando la densidad óptica a 600 nanómetros está entre 1,5 y dos, recoger las células de levadura por centrifugación, y resuspender el pellet en agua para lavarlas y consolidar las células en una sola botella.Girar las células de nuevo para la recolección, y resuspender el pellet en unos dos mililitros de agua de doble destilado. Luego use una pipeta de 10 mililitros para dispensar lentamente la lodo celular en nitrógeno líquido una gota a la vez para producir pellets de células de levadura congeladas. Para la purificación de proteínas de motor, utilice una trituradora de café de tipo cuchilla pre-enfriada con nitrógeno líquido para moler los pellets de levadura congelada en un polvo fino, y transfiera el polvo de levadura a un vaso de vidrio pre-enfriado, de 100 mililitros, sobre hielo.Añadir un pequeño volumen de tampón de lisis 4X recién preparado con suplementos al polvo para que la concentración final del tampón no exceda 1X, y colocar el vaso de precipitados en un baño de agua Celsius de 37 grados con agitación continua con una espátula para descongelar rápidamente el polvo. Añadir tampón 4X adicional con suplementos para llevar la concentración de búfer final a 1X en el lisato. El volumen final es a menudo entre 25 y 30 mililitros.Luego recoger las células de levadura por centrifugación, y transferir la proteína soluble que contiene sobrenadante en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para la purificación de afinidad IgG, agregue 200 microlitro de suspensión de cordón de afinidad lavado al extracto de proteína, e incubar la mezcla a cuatro grados Centígrados durante una hora con rotación suave. Al final de la incubación, filtrar la mezcla a través de la misma columna de cromatografía utilizada para preparar las cuentas a cuatro grados Celsius, seguido de dos lavados con cinco mililitros de tampón de lavado por lavado en hielo.Después del segundo lavado, enjuague las perlas sobre hielo con cinco mililitros de tampón TEV, permitiendo que el tampón drene completamente de la columna. Para el etiquetado de oligonucleótidos de ADN, tape la columna de cromatografía e incubar las perlas del motor con 100 microlitros de Tampón TEV complementados con 10 a 20 micromolares del oligo de bencilguanina purificado a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos, reutilizando suavemente las perlas una vez por minuto. Al final de la incubación, lave las perlas cuatro veces con tampón TEV fresco por lavado como acaba de demostrarse, antes de recapetute la parte inferior del tubo para permitir la resuspensión de las perlas del motor en no más de 200 microlitros de tampón TEV fresco.Para el escote TEV, transfiera la suspensión del cordón del motor a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, fondo redondo, e incubar las perlas del motor con aproximadamente 0,3 unidades de proteasa TEV por microlitro de mezcla de perlas de motor a 16 grados Celsius durante una hora con rotación suave. Al final de la incubación, centrifugar las perlas del motor, y recoger la mezcla en la parte inferior del tubo. A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 cortada para transferir la mezcla a una columna de centrifugado, y centrifugar la mezcla como se acaba de demostrar.Recoger el filtrado que contiene los motores tev-cortados, purificados, y alícuota el filtrado en volúmenes de 50 microlitros para la purificación de la afinidad de microtúbulos. A continuación, congele las alícuotas en nitrógeno líquido para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para la purificación del chasis, a última hora de la tarde del día anterior a la purificación, caparga suavemente 80 microlitros cada uno de la concentración de glicerol en el tampón plegable de origami en un tubo centrífugo.Los límites entre las capas deben ser ligeramente visibles. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados, capa 10%glicerol en tampón plegable de origami en la solución de chasis plegado sobre la capa superior del gradiente, y centrifugar el gradiente con el chasis. Al final de la centrifugación, recoge fracciones de 50 microlitros del gradiente en una dirección de arriba a abajo, y carga cinco microlitros de cada fracción en pozos individuales de un gel de agarosa del 2%.Después de 90 a 120 minutos a 70 voltios, imagen del gel utilizando condiciones adecuadas para la mancha de gel de ADN utilizada. Las concentraciones cuantificadas de las fracciones de interés seleccionadas se pueden determinar utilizando los métodos espectroscópicos estándar adecuados. El análisis SDS-PAGE se puede utilizar para confirmar la extracción exitosa de dynein de levadura, ya que el filtrado final muestra una banda clara y afilada a aproximadamente 350 kilodaltons.TEV proteasa también está presente en el filtrado final y forma una banda clara a unos 50 kilodaltons. Después de la purificación de la afinidad de microtúbulos, dynein aparece como una banda clara, una sola a 350 kilodaltones, mientras que la kinesina se puede observar como un poco manchado, múltiples bandas a unos 120 kilodaltons. Además de la proteasa del TEV, también se puede observar una cantidad notable de tubulina en el sobrenadante final.El plegado de las estructuras de origami de ADN puede ser ensayado por electroforesis de gel de agarosa, con un cambio en la movilidad entre el hilo de andamios desdoblado puro y la reacción plegable que indica el plegado de origami. Además, la reacción de plegado indica la presencia de alguna multimerización de las estructuras del chasis. La motilidad de los conjuntos de chasis de motor es fácilmente detectable y medible en los kymographs generados a partir de películas TIRF, ya que los kymographs de chasis flexible conjugados con siete proteínas de dynein demuestran corridas altamente procesivas a velocidades relativamente consistentes.Es vital controlar cuidadosamente la temperatura de las proteínas motoras en cada paso del procedimiento. Tras la purificación de las proteínas motoras y el chasis de origami de ADN, los dos componentes se pueden conjugar para ensayos de motilidad de los conjuntos bajo un microscopio TIRF. Este método permite descifrar los mecanismos biofísicos y bioquímicos que rigen la motilidad emergente de los conjuntos motores.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Investigación

Bioquímica

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...