Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Vi tackar K. Chau, J. Morgan, och A. Driller-Colangelo för att bidra till de tekniker för segmenterade DNA origami chassit. Vi tackar också tidigare medlemmar i Reck-Peterson och Shih laboratorier för hjälpsamma diskussioner och bidrag till den ursprungliga utvecklingen av dessa tekniker. Vi tackar J. Wopereis och Smith College Center för mikroskopi och Imaging och L. Bierwert och Smith College Center för molekylärbiologi. Vi erkänner tacksamt NSF MRI program för förvärv av en TIRF Mikroskop.

1. tillväxt, uttryck och skörd av motorproteiner som styrs av en galaktoinducerad promotor
<ol><li>Med hjälp av en jäst-Peptone-dextros (YPD) kultur plattan och en steril vaccinera pinne, strimma önskade frysta jäst stam och inkubera för 3-4 dagar vid 30 ° c.</li>
	<li>Dag 1 av kultur tillväxt: på eftermiddagen, tillsätt 10 mL av YP kultur media med 2% dextros till en 1 "diameter glas kultur röret och Inokulera det med en enda koloni från plattan. Växa i en snabbt roterande rulltrumma vid 30 ° c över na...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

Den molekylära konstruktions tekniker av DNA origami ger ett unikt sätt att konstruera motor ensembler med definierade arkitekturer, motornummer, och typer, möjliggör studier av hur framväxande beteende uppstår från specifika motoriska konfigurationer31. Eftersom strukturella och cellulära studier fortsätter att belysa exempel på cytoskeletala motorer som arbetar i team, tekniker för att isolera och undersöka de biofysiska och biokemiska mekanismerna hos motorer i ensembler växer i ny...

Dynein och kinesinet är cytoskeletala motorproteiner som ansvarar för otaliga funktioner i eukaryotiska celler1. Genom att omvandla den kemiska energin av ATP hydrolys till produktivt arbete, dessa motorer translocate på mikrotubuli att dra och distribuera olika intracellulära Cargos. De samordnar också i den massiva intracellulära rearrangemang i samband med Mitos, där de uppvisar orkesyrade krafter som bidrar till positionering och separation av kromosomer. Strukturella, biokemiska och biofysiska analyser, inklusive enstaka molekyl observationer, har avslöjat mekanismerna för dessa motorer på individnivå (väl granskade i tidigare verk2,3,4). Men många av motorns uppgifter kräver att de arbetar i små ensembler av både liknande och blandade motortyper. Jämförelsevis mindre förstås om de mekanismer som samordnar verksamheten och ultimata framväxande motilitet av dessa ensembler5,6. Denna kunskapsklyfta beror delvis på svårigheten att skapa ensembler med kontrollerbara funktioner, såsom motor typ och kopierings nummer. Under det senaste decenniet har de molekylära konstruktions teknikerna för DNA-origami använts för att lösa detta problem. För mikrotubule baserade motorer, några exempel på dessa undersökningar omfattar enstaka molekyl observationer av ensembler av cytoplasmiska dynein-17,8,9, intraflagellar dynein11, olika kinesinmotorer12,13, och blandningar av både dyneiner och kinesins7,14,15. Här ger vi Detaljer om rening och oligonukleotid märkning av motorer från jäst7,16,17,18,19,20, vikning och rening av segmenterad DNA origami med avstämbara överensstämmelse8, och avbildning av jästmotorer driver chassi strukturer7,18.
Konstruera motor ensembler för in vitro enda molekyl observation kräver tre primära ansträngningar. Den första är uttrycket, rening och märkning av motorkonstruktioner som lämpar sig för att fästa till DNA origami. Den andra är produktion och rening av definierade DNA origami strukturer (kallas ofta "chassi"). Och den tredje är konjugering av motorerna till chassi strukturen följt av observation med hjälp av total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Här tillhandahåller vi etablerade protokoll för denna process för rekombinanta Microtubule-baserade motorer renas från jästen Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. DNA origami-baserade motor ensembler har undersökts med hjälp av både rekombinant kinesinet15 och dynein7,8,18 konstruktioner som produceras i denna jäst Expression system16 ,17,18,19. Detta protokoll är giltigt för dessa konstruktioner, med tanke på att de styrs av galaktos inducerad promotor, och smält till samma proteintaggar för rening (ZZ och TEV proteashämmare Linker) och för DNA oligo konjugation (SNAPtag).
Specifika jäststammar producerar specifika motorkonstruktioner. Till exempel, den dynein som används för att studera betydelsen av Last överensstämmelse renades från stam RPY10847,8. I allmänhet kan stammar som innehåller motorkonstruktioner med lämpliga genetiska modifikationer för uttryck och rening begäras från de laboratorier som har publicerat användningen av dessa motorer. Konstruktioner med nya attribut såsom mutationer eller taggar kan göras med hjälp av rekombinanta genetiska tekniker, såsom litiumacetat Transformation21 och kommersiella kit. Detaljerade protokoll för att skapa modifierade motorproteiner i jäst för enstaka Molekylstudier har publicerats19. Förutom att motorerna är smält till SNAPtag, de oligos används för att märka motorerna måste konjugerat till SNAP substrat, benzylguanine (BG); tidigare publicerade protokoll beskriver bildandet och reningen av BG-oligo-konjugaterna18. Den övergripande strategi som beskrivs här har också använts för Actin-baserade motorer (se tidigare verk för exemplen22,23,24) och motorer som renats från andra organismer och uttrycks system (se tidigare fungerar för exempel7,9,10,11,12,13,14).
Polymeriserade mikrotubuli (MTs) används i dessa experiment i två olika procedurer. MT affinitetsrening av funktionella motorer kräver MTs som inte är märkta med andra funktionella grupper, medan motorn-Ensemble motilitet TIRF analysen kräver MTs märkt med biotin och fluoroforer. I samtliga fall, MTs stabiliseras med Taxol att förhindra denaturering. MT affinitetsrenings steget används för att avlägsna alla icke-motila motorer med hög MT-affinitet, eftersom dessa motorer kan förändra ensemblen motilitet om konjugerat till ett chassi. Under denna process, aktiva motorer Unbind MTs och förbli i lösning, medan tight-bindande motorer snurra ner i MT pelleten. Detta bidrar till att säkerställa att alla motorer på chassit är från en aktiv population.
En mängd olika DNA origami strukturer har använts för att studera cytoskelett motor ensembler. Eftersom mekanistisk förståelse av Ensemble transport har ökat, DNA origami strukturer som används i experiment har vuxit i komplexitet. I princip kan varje struktur anpassas för detta ändamål, förutsatt att den ändras så att den omfattar ensträngade DNA-fästplatser för motorer och fluorofoforer. Specifika chassi mönster och attribut kan vara användbart för att sondera särskilda frågor om det framväxande beteendet hos motorer ensembler. Till exempel har stela stavar använts för att utveckla grundläggande kunskaper om hur kopierings nummer påverkar transport av grupper av dyneiner och kinesins7,15,18och 2D-plattformar har använts för att studera myosin Ensemble Navigation av aktin Networks22. Strukturer med variabel eller avstämbar flexibilitet har använts för att förstå rollerna av Elastisk koppling mellan motorer och att söka hur stegning synkronisering påverkar motilitet8,24. På senare tid, sfäriska strukturer används för att få insikt i hur geometriska begränsningar för motor-Track bindning påverka dynamiken i motilitet25.
I detta protokoll erbjuder vi specifika steg för Ensemble experiment på segmenterat chassi med variabel styvhet. Bindningsställen på chassit kallas ibland "handtag", medan kompletterande DNA-sekvenser som binder dessa handtag kallas "antihandles". Antalet motorer på dessa chassi bestäms av vilka segment som innehåller utökade handtag häftklamrar med komplementaritet med antihandle oligo på oligo-märkta motorer. Genom att använda olika handtags sekvenser på olika segment kan man binda olika typer av motorer till specifika platser på chassit. Chassit beskrivs här består av 7 sekventiella stela segment, vardera består av 12 dubbelsträngade DNA alfahelixar arrangerade i 2 koncentriska ringar8. De stela segmenten innehåller motor handtagen och ansluts genom regioner som kan vara antingen flexibla enkelsträngade DNA eller stela dubbelsträngade DNA, beroende på frånvaron eller närvaron av "länkare" häftklamrar. Överensstämmelsen av chassi strukturen bestäms således av närvaron eller frånvaron av dessa "länkare" häftklamrar. Se tidigare rapporter för mer information och specifika DNA-sekvenser8. Dessutom kan flera metoder användas för att rena chassi26. Den kurs-Zonal glycerolgradientcentrifugering metod27 beskrivs här.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Cytoskeletala motorer är ansvariga för en mängd olika funktioner i eukaryotiska celler, inklusive Mitos, Last transport, cellulära motilitet, och andra. Många av dessa funktioner kräver motorer för att fungera i ensembler. Trots en mängd kunskap om mekanismerna för enskilda cytoskeletala motorer, jämförelsevis mindre är känt om mekanismerna och framväxande beteenden av motor ensembler, exempel på som inkluderar förändringar av Ensemble processivitet och hastighet med ändra motornummer, plats och konfiguration. Strukturell DNA nanoteknik, och den specifika tekniken av DNA origami, möjliggör molekylär konstruktion av väldefinierade arkitekturer av motor ensembler. Formen på Last strukturer samt typ, antal och placering av motorer på strukturen kan alla styras. Här ger vi detaljerade protokoll för att producera dessa ensembler och observera dem med hjälp av total inre reflektion fluorescens mikroskopi. Även om dessa tekniker har specifikt tillämpats för cytoskeletala motorer, metoderna är generaliserbara till andra proteiner som samlas i komplex för att utföra sina uppgifter. Sammantaget, DNA origami metoden för att skapa väldefinierade ensembler av motorproteiner ger ett kraftfullt verktyg för dissekera de mekanismer som leder till framväxande motila beteende.

Framgångsrika reningar av motorer och chassi strukturer har analyserats av gel elektrofores. SDS-PAGE analys bekräftade den framgångsrika utvinning av dynein från jäst (figur 2), som det slutliga filtratet samlats i steg 2.3.7 visade en tydlig, skarp band på positionen för ~ 350 kDa. Som väntat var detta dynein band frånvarande från att och tvätta som avlägsnas oönskade proteiner, och de pärlor som dynein var klyvs. Observationen antyder att IgG...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Målet med detta protokoll är att bilda ensembler av molekylära motorer på DNA origami nanostrukturer och observera helheten motilitet med hjälp av total inre reflektion fluorescens mikroskopi.

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Vårt protokoll är utformat för att undersöka de biofysiska mekanismer som styr transport av last av grupper av identiska eller motsatt riktade cytoskelettmotoriska proteiner. Genom att använda DNA origami för molekylär konstruktion, denna metod kan välja för typ, antal, och placering av motorer på exakt definierade last former. Medan detta protokoll fokuserar på mikrotubuli-baserade motorer dynein och kinesin, är det anpassningsbart till aktin-baserade motor myosin, liksom till andra proteinsystem som fungerar kooperativt.En utmanande aspekt av detta protokoll är att upprätthålla integriteten och aktiviteten hos motorproteiner under hela reningsprocessen, eftersom de är känsliga för värme och mekanisk kraft. För att inducera motorprotein tillväxt och uttryck via galaktos promotor, använd en steril inokulering wand att strimma den frysta jäststammen av intresse på en jäst-pepton-dextros kultur platta för en tre till fyra dagars inkubation vid 30 grader Celsius. På dag fyra av kultur, när den optiska densiteten vid 600 nanometer är mellan 1,5 och två, samla in jästcellerna genom centrifugeringen, och återanvända pelleten i vatten för att tvätta dem och konsolidera cellerna i en enda flaska.Snurra cellerna igen för insamling, och återanvänd pelleten i cirka två milliliter dubbeldestillerat vatten. Använd sedan en 10-milliliter pipett för att långsamt fördela cellen slurry i flytande kväve en droppe i taget för att producera frysta jästcell pellets. För motorprotein rening, använd en blad-typ kaffekvarn förkyld med flytande kväve för att mala frysta jäst pellets till ett fint pulver, och överföra jästpulver i en pre-kyld, 100-milliliter, glasbägare på is.Tillsätt en liten volym av nyberedd 4X lysbuffert med tillskott till pulvret så att buffertens slutliga koncentration inte överstiger 1X, och placera bägaren i ett 37-graders Celsius vattenbad med kontinuerlig omrörning med en spatel för att snabbt tina pulvret. Lägg till ytterligare 4X buffert med kosttillskott för att få den slutliga buffertkoncentrationen till 1X i lysate. Den slutliga volymen är ofta mellan 25 och 30 milliliter.Samla sedan jästcellerna genom centrifugering och överför det lösliga protein som innehåller supernatant till ett nytt koniskt röret på 50 milliliter på is. För IgG affinitet rening, tillsätt 200 mikroliter av tvättad affinitet pärla suspension till proteinextraktet, och inkubera blandningen vid fyra grader Celsius i en timme med skonsam rotation. I slutet av inkubationen, filtrera blandningen genom samma kromatografi kolumn som används för att förbereda pärlorna vid fyra grader Celsius, följt av två tvättar med fem milliliter tvättbuffert per tvätt på is.Efter den andra tvätten, skölj pärlorna på is med fem milliliter TEV buffert, vilket gör att bufferten helt rinna ur kolonnen. För DNA oligonukleotid märkning, locket kromatografi kolumnen, och inkubera motorpärlor med 100 mikroliters av TEV buffert kompletteras med 10 till 20 mikromolar av den renade bensylguanin oligo vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter, försiktigt resu utgifterna pärlorna en gång i minuten. Vid slutet av inkubationen, tvätta pärlorna fyra gånger med färsk TEV buffert per tvätt som just visats, innan recapping botten av röret för att tillåta resuspension av motorpärlorna i högst 200 mikroliter av färsk TEV buffert.För TEV-klyvning, överför motorpärlorsupphängningen till ett två-milliliter- rundbottn- och mikrocentrifugrör, och inkubera motorpärlorna med cirka 0,3 enheter TEV-proteas per mikroliter av motorpärlablandning vid 16 grader Celsius i en timme med skonsam rotation. I slutet av inkubationen, centrifugera motorpärlorna, och samla blandningen i botten av röret. Använd därefter en skuren P1000 pipettspets för att överföra blandningen till en spinnkolonn, och centrifug blandningen som just visats.Samla upp filtratet som innehåller TEV-klyvda, renade motorer, och alikvoten i 50-mikrolitervolymer för mikrotubuli-affinitetsrening. Sedan flash frysa alikvoterna i flytande kväve för minus 80-grader Celsius lagring. För chassirening, på sen eftermiddag dagen före reningen, försiktigt lager 80 mikroliter var av koncentration av glycerol i origami vikning buffert i en centrifug röret.Gränserna mellan lagren ska vara något synliga. Efter en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius, lager 10%glycerol i origami vikning buffert i vikta chassi lösning över det översta lagret av lutningen, och centrifug lutningen med chassit. I slutet av centrifugeringen samlar du 50 mikroliterfraktioner av gradienten i en topp-till-botten-riktning och laddar fem mikroliter av varje fraktion i enskilda brunnar av en 2%-agarosgel.Efter 90 till 120 minuter vid 70 volt, bild gelen med hjälp av förhållanden som lämpar sig för DNA gel fläcken används. Kvantifierade koncentrationer av de valda fraktionerna av intresse kan bestämmas med hjälp av lämpliga standardspektroskopiska metoder. SDS-PAGE analys kan användas för att bekräfta en framgångsrik utvinning av dynein från jäst, eftersom det slutliga filtratet visar ett tydligt, skarpt band vid cirka 350 kilodalton.TEV proteas finns också i det slutliga filtratet och bildar ett tydligt band vid cirka 50 kilodalton. Efter mikrotubuli affinitet rening, dynein visas som en tydlig, enda band på 350 kilodaltons, medan kinesin kan observeras som något smetar, flera band på ca 120 kilodalton. Förutom TEV-proteasen kan även en märkbar mängd tubulin observeras i den slutliga supernatanten.Vikning av DNA origami strukturer kan analyseras av agarosgelelektrofores, med en förskjutning i rörlighet mellan den rena ovikta byggnadsställningen strand och vikning reaktion som indikerar origami vikning. Dessutom indikerar den vikbara reaktionen närvaron av viss multimerisering av chassistrukturer. Motility av motor chassi ensembler är lätt detekterbar och mätbara på kymographs genereras från TIRF filmer, som kymographs av flexibla chassi konjugerade till sju dynein proteiner visar mycket processaiska körs på relativt konsekvent hastigheter.Det är livsviktigt att noggrant kontrollera temperaturen på motorproteinerna vid varje steg i proceduren. Efter reningen av motorproteinerna och DNA origami chassi, de två komponenterna kan konjugeras för motility analyser av ensembler under en TIRF mikroskop. Denna metod gör det möjligt att de biofysiska och biokemiska mekanismer som styr motorensemblernas framväxande motilitet dechiffreras.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Konventionella BODIPY konjugat för Live-Cell Super-Resolution Mikroskopi och single-molecule tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Enmolekylär avbildning av EWS-FLI1-kondensat som monteras på DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...