Name: production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation
Uploaded: 2019-10-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

K. Chau, J. Morgan ve A. Driller-Colangelo'ya parçalı DNA origami şasisinin tekniklerine katkıda bulunanlara teşekkür ederiz. Ayrıca Reck-Peterson ve Shih laboratuvarlarının eski üyelerine bu tekniklerin orijinal gelişimine yararlı tartışmalar ve katkılar için teşekkür ederiz. J. Wopereis'e ve Smith College Mikroskobu ve Görüntüleme Merkezi'ne ve L. Bierwert'e ve Smith College Moleküler Biyoloji Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bir TIRF mikroskobu satın alınması için NSF MRI programını minnetle kabul ediyoruz.

1. Galaktose indüklenen bir organizatör tarafından kontrol edilen motor proteinlerin büyümesi, ekspresyonu ve hasadı
<ol><li>Maya-pepton-dekstroz (YPD) kültür plakası ve steril aşıçubuğu kullanılarak, 30 °C'de 3-4 gün boyunca dondurulmuş maya ve kuluçka makinesi istenir.</li>
	<li>Kültür büyüme günü 1: Öğleden sonra, 1 "çapı cam kültür tüpü için% 2 dekstroz ile YP kültür medya 10 mL ekleyin ve plaka tek bir koloni ile aşılamak. Bir gecede 30 °C'de hızla dönen bir silindir tamburd...

<ol>
	<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+motor+toolbox+for+intracellular+transport.">The molecular motor toolbox for intracellular transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+regulation+of+cytoplasmic+dynein.">Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).</li><li>Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+and+mechanics+of+dynein+motor+proteins.">Functions and mechanics of dynein motor proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kinesin-1+Chemomechanical+Cycle:+Stepping+Toward+a+Consensus.">The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus.</a> Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).</li><li>McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+dynamics+of+processive+cytoskeletal+motors.">Collective dynamics of processive cytoskeletal motors.</a> Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).</li><li>Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+cargo+transport:+moving+beyond+tug+of+war.">Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).</li><li>Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tug-of-war+in+motor+protein+ensembles+revealed+with+a+programmable+DNA+origami+scaffold.">Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold.</a> Science. 338 (6107), 662-665 (2012).</li><li>Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cargo+rigidity+affects+the+sensitivity+of+dynein+ensembles+to+individual+motor+pausing.">Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing.</a> Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).</li><li>Torisawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoinhibition+and+cooperative+activation+mechanisms+of+cytoplasmic+dynein.">Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein.</a> Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).</li><li>Urnavicius, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+shows+how+dynactin+recruits+two+dyneins+for+faster+movement.">Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement.</a> Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).</li><li>Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraflagellar+transport+dynein+is+autoinhibited+by+trapping+of+its+mechanical+and+track-binding+elements.">Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).</li><li>Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+collective+transport+by+defined+numbers+of+processive+and+nonprocessive+kinesin+motors.">Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).</li><li>Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+interference+dominates+collective+transport+of+kinesin+motors+in+the+absence+of+load.">Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+dynein-dynactin+complex+is+a+strong+opponent+to+kinesin+in+a+tug-of-war+competition.">The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition.</a> Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).</li><li>Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+dynein+transport+to+the+microtubule+plus+end+by+kinesin.">Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin.</a> eLife. 3, e02641 (2014).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4,+Probing+the+force+generation+and+stepping+behavior+of+cytoplasmic+Dynein.">Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein.</a> Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).</li><li>Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+defined+motor+ensembles+with+DNA+origami.">Engineering defined motor ensembles with DNA origami.</a> Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).</li><li>Rao, L., H&#252;lsemann, M., Gennerich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Structure-Function+and+Single-Molecule+Studies+on+Cytoplasmic+Dynein.">Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein.</a> Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).</li><li>Qiu, W., Derr, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+achieves+processive+motion+using+both+stochastic+and+coordinated+stepping.">Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).</li><li>Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Transformation+by+the+LiAc/SS+Carrier+DNA/PEG+Method.">Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method.</a> Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).</li><li>Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+lever+arm+directs+collective+motion+on+cellular+actin+network.">Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).</li><li>Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teams+of+myosin+Vc+motors+coordinate+their+stepping+for+efficient+cargo+transport+on+actin+bundles.">Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).</li><li>Hariadi, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+coordination+in+motor+ensembles+revealed+using+engineered+artificial+myosin+filaments.">Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments.</a> Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).</li><li>Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spherical+DNA+Origami+as+a+Programmable+Cargo+Structure+for+Investigating+the+Emergent+Motility+of+Dynein+and+Kinesin+Ensembles.">Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles.</a> Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).</li><li>Wagenbauer, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+We+Make+DNA+Origami.">How We Make DNA Origami.</a> Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).</li><li>Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+DNA+origami+packed+on+hexagonal+and+hybrid+lattices.">Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+molecules+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(TIRFM).">Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Derr, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Multiple+Dynein+Motors+Studied+Using+DNA+Scaffolding.">Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding.</a> Handbook of Dynein. , (2019).</li><li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns.">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).</li></ol>

DNA origami moleküler inşaat teknikleri tanımlanmış mimarileri, motor numaraları ve türleri ile motor topluluklar oluşturmak için benzersiz bir yol sağlar, nasıl acil davranış belirli motor yapılandırmaları31ortaya çıkar çalışmaları sağlayan. Yapısal ve hücresel çalışmalar ekipler halinde çalışan sitoskeletal motorların örneklerini açıklığa kavuşturmaya devam ettikçe, topluluklar halindeki motorların biyofiziksel ve biyokimyasal mekanizmalarını izole etme ...

Dynein ve kinesin ökaryotik hücrelerde sayısız fonksiyonlardan sorumlu sitoskeletal motor proteinlerdir1. ATP hidroluzunun kimyasal enerjisini verimli bir işe dönüştürerek, bu motorlar çeşitli hücre içi kargoları taşımak ve dağıtmak için mikrotübüller üzerinde transren. Ayrıca mitoz bölünmeile ilişkili büyük hücre içi yeniden düzenlemeleri koordine, onlar konumlandırma ve kromozomların ayrılmasına katkıda bulunan düzenlenmiş kuvvetler sergiler. Yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel tahliller, tek molekül gözlemleri de dahil olmak üzere, bireysel düzeyde bu motorların mekanizmaları ortaya koymuştur (öncekiçalışmalardaiyi gözden 2,3,4). Ancak, motorların görevlerinin çoğu, benzer ve karma motor tiplerinde küçük topluluklar halinde çalışmalarını gerektirir. Nispeten daha az bu toplulukların faaliyet ve nihai acil hareketlilik koordine mekanizmaları hakkında anlaşılmaktadır5,6. Bu bilgi boşluğu, kısmen, motor türü ve kopya numarası gibi denetlenebilir özelliklere sahip topluluklar oluşturmadaki güçlüklerden kaynaklanmaktadır. Son on yılda, DNA origami moleküler inşaat teknikleri bu sorunu çözmek için istihdam edilmiştir. Mikrotübül bazlı motorlar için, bu araştırmaların bazı örnekleri sitoplazmik dinamin topluluklarının tek molekülgözlemleri içerir-17,8,9, intraflagellar dynein11, çeşitli kinesin motorları12,13, ve hem dyneins ve kinesin karışımları7,14,15. Burada,maya7,16,17, 18,19,20, motorların saflaştırma ve oligonükleotid etiketleme ayrıntıları nı sağlamak katlanır ve tunable uyum ile segmentli DNA origami saflaştırma8, ve şasi yapıları itici maya motorların görüntüleme7,18.
In vitro tek molekül gözlem için motor toplulukları inşa üç birincil çaba gerektirir. Bunlardan ilki, DNA origamisine bağlanmaya uygun motor yapılarının ekspresyonu, saflaştırılması ve etiketlenmesidir. İkincisi, tanımlanmış DNA origami yapılarının üretimi ve saflaştırılmasıdır (genellikle "şasi" olarak adlandırılır). Ve üçüncüsü ise motorların şasi yapısına çekimi ve ardından toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopisi kullanılarak gözlemlenmesidir. Burada, maya Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18arındırılmış rekombinant mikrotübül bazlı motorlar için bu süreç için kurulan protokoller sağlamak, 19. DNA origami tabanlı motor topluluklar hem rekombinant kinesin15 ve dynein7,8,18 yapılar bu maya ifade sistemi16 üretilen kullanılarak araştırılmıştır ,17,18,19. Bu protokol, galaktoz indüklenen organizatör tarafından kontrol edildikleri ve saflaştırma (ZZ ve TEV proteaz bağlayıcısı) ve DNA oligo çekimi (SNAPtag) için aynı protein etiketlerine kaynaşmış olmaları göz önüne alındığında, bu yapılar için geçerlidir.
Belirli maya suşları belirli motor yapılar üretmek. Örneğin, kargo uyumunun rolünü incelemek için kullanılan dynein, RPY10847,8'denarındırıldı. Genel olarak, ekspresyon ve arınma için uygun genetik modifikasyonlar ile motor yapıları içeren suşlar, bu motorların kullanımını yayınlayan laboratuvarlardan istenebilir. Mutasyonlar veya etiketler gibi yeni özelliklere sahip yapılar lityum asetat dönüşümü21 ve ticari kitleri gibi rekombinant genetik teknikler kullanılarak yapılabilir. Tek moleküllü çalışmalar için mayamodi motor proteinleri oluşturmak için ayrıntılı protokoller yayınlanmıştır19. SNAPtag'a kaynaşmış motorlara ek olarak, motorları etiketlemek için kullanılan oligolar SNAP substratı benzilguanine (BG) konjuge edilmelidir; daha önce yayınlanan protokoller oluşumu ve BG-oligo conjugates arıtma açıklar18. Burada açıklanan genel strateji de aktin bazlı motorlar için istihdam edilmiştir (örnekler için önceki çalışmalara bakın22,23,24), ve diğer organizmalar ve ifade sistemlerinden arındırılmış motorlar (önceki bakınız örnekler için çalışır7,9,10,11,12,13,14).
Polimerize mikrotübüller (MTs) bu deneylerde iki farklı prosedürde kullanılmaktadır. Fonksiyonel motorların MT arinatifliği diğer fonksiyonel gruplarla etiketlenmeyen MT'ler gerektirirken, motor-topluluk hareketliliği TIRF tsayı biotin ve floroforlarla etiketlenmiş MT'ler gerektirir. Her durumda, MTs denatürasyonu önlemek için taxol ile stabilize edilir. MT yakınlık saflaştırma adımı, yüksek MT afinitesine sahip hareketli olmayan motorları kaldırmak için kullanılır, çünkü bu motorlar bir şasiye konjuge edilirse topluluk hareketliliğini değiştirebilir. Bu işlem sırasında, aktif motorlar MT'leri bağlar ve çözeltide kalır, sıkı bağlayıcı motorlar MT peletinde aşağı doğru döner. Bu, şasi üzerindeki tüm motorların aktif bir popülasyondan olmasını sağlamaya yardımcı olur.
Dna origami yapıları çeşitli sitosiskelet motor toplulukları çalışma için kullanılmıştır. Topluluk taşımacılığının mekanistik anlayışı arttıkça, deneylerde kullanılan DNA origami yapıları karmaşıklık içinde büyümüştür. Prensip olarak, herhangi bir yapı motorlar ve floroforlar için tek iplikli DNA eki siteleri içerecek şekilde modifiye edilmesi koşuluyla bu amaca uyarlanabilir. Belirli şasi tasarımları ve özellikleri motor topluluklarının acil davranışı hakkında belirli soruları araştırmak için yararlı olabilir. Örneğin, sert çubuklar kopya numarası nın dyneins ve kinesin takımları tarafından ulaşımı nasıl etkilediği ne kadar temel bilgi geliştirmek için kullanılmıştır7,15,18, ve 2D platformlar miyozin topluluğu nu incelemek için kullanılmıştır actin ağları nın navigasyon22. Değişken veya sabit esnekliğe sahip yapılar, motorlar arasındaki elastik bağlantının rollerini anlamak ve adımlama senkronizasyonunun hareketliliği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılmıştır8,24. Daha yakın zamanlarda, küresel yapılar motor-parça bağlama geometrik kısıtlamaları hareketlilik25dinamiklerini nasıl etkilediğini içgörü kazanmak için kullanılmaktadır.
Bu protokolde, değişken rijitliğe sahip parçalı şasi üzerinde topluluk deneyleri için belirli adımlar sunuyoruz. Şasi üzerindeki bağlama siteleri bazen "kulplar" olarak adlandırılırken, bu kolları bağlayan tamamlayıcı DNA dizilerine "antihandles" denir. Bu şasi üzerindeki motor sayısı, segmentlerin oligo etiketli motorlarda antihandle oligo'ya tamamlayıcı olarak genişletilmiş sap zımbaları içerdiği ne göre belirlenir. Farklı segmentlerde farklı tutamaç dizilerinin kullanılması, farklı tipteki motorların şasi üzerindeki belirli konumlara bağlanmasına olanak tanır. Burada ayrıntılı şasi 7 sıralı sert segmentleri oluşur, her biri oluşan 12 çift iplikli DNA helikler 2 eşmerkezli halkalar8düzenlenmiş . Rijit segmentler motor tutamaçları içerir ve "bağlayıcı" zımbaların yokluğuna veya varlığına bağlı olarak esnek tek iplikli DNA veya çift iplikli DNA olabilecek bölgeler aracılığıyla bağlanır. Şasi yapısının uygunluğu böylece bu "bağlayıcı" zımbaların varlığı veya yokluğu ile belirlenir. Daha fazla bilgi ve belirli DNA dizileri8için önceki raporlara bakın. Buna ek olarak, birden fazla yöntem şasi26arındırmak için kullanılabilir. Rate-zonal gliserol gradyan santrifüj yöntemi27 burada açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Round Bottom Tube</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, &#62;99% pure</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T333P-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>356013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC30VV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17096901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7326204EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P8064 Scaffold</td>
			<td>Tilibit</td>
			<td>2 mL at 400nM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Prep Chromatography Columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>731-1550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProTev Protease</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotch Double Sided Tape with Dispenser</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S-500 HR</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17061310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>434302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein (&#62;99% pure): porcine brain</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>T240-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte 647</td>
			<td>Cytoskeleton.com</td>
			<td>TL670M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344090</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of dynein and kinesin motor ensembles on dna origami nanostructures for single molecule observation

Sitoskelet motorları ökaryotik hücrelerde mitoz, kargo taşımacılığı, hücresel hareketlilik ve diğerleri dahil olmak üzere çok çeşitli fonksiyonlardan sorumludur. Bu işlevlerin çoğu, motorların topluluklar halinde çalışmasını gerektirir. Bireysel sitoskeletel motorların mekanizmaları hakkında bilgi zenginliğine rağmen, motor topluluklarının mekanizmaları ve ortaya çıkan davranışları hakkında nispeten daha az bilgi sahibi dir. motor numarasını, konumunu ve yapılandırmayı değiştirme. Yapısal DNA nanoteknolojisi ve DNA origamisinin özel tekniği, motor toplulukların iyi tanımlanmış mimarilerinin moleküler yapılışı sağlar. Yük yapılarının şekli, motorların tipi, sayısı ve yapısıüzerindeki yerleşimleri kontrol edilebilir. Burada, bu toplulukların üretilmesi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak gözlemleme için ayrıntılı protokoller salıyoruz. Bu teknikler özellikle sitoskelet motorlar için uygulanmış olsa da, bu yöntemler görevlerini yerine getirmek için kompleksler halinde biraraya gelen diğer proteinleriçin genelleştirilebilir. Genel olarak, motor proteinlerin iyi tanımlanmış topluluklar oluşturmak için DNA origami yöntemi acil hareketli davranış yol mekanizmaları diseksiyon için güçlü bir araç sağlar.

Motorların ve şasi yapılarının başarılı arınmaları jel elektroforezi ile titreştirilmiştir. SDS-PAGE analizi, 2.3.7 adımda toplanan son filtrasyon ~350 kDa pozisyonunda net ve keskin bir bant gösterdiğinden, mayadan(Şekil 2)dynein'in başarılı bir şekilde çıkarını doğruladı. Beklendiği gibi, bu dynein bant akan ve istenmeyen proteinler kaldırıldı yıkama yoktu, ve hangi dynein cleaved boncuklar. Gözlem, IgG arınma ve TEV proteaz...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation at JoVE.com

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Protokolümüz, aynı veya zıt yönlendirilmiş sitosiskelet elmotor proteinlerinden oluşan ekipler tarafından kargonun taşınmasını yöneten biyofiziksel mekanizmaları araştırmak için tasarlanmıştır. Moleküler yapı için DNA origami kullanarak, bu yöntem, tam olarak tanımlanmış kargo şekilleri üzerinde motorların türü, sayısı ve konumu için seçebilirsiniz. Bu protokol mikrotübül bazlı motorlar dynein ve kinesin üzerinde duruluyor iken, aktin tabanlı motor miyozin yanı sıra işbirliği içinde çalışan diğer protein sistemlerine uyarlanabilir.Bu protokolün zorlu bir yönü, ısı ve mekanik kuvvete duyarlı oldukları için motor proteinlerinin saflaştırma süreci boyunca bütünlüğünü ve etkinliğini korumaktır. Galaktoz organizatörü aracılığıyla motor protein büyümesi ve ekspresyonu teşvik etmek için, 30 santigrat derecede üç ila dört günlük kuluçka için bir maya-pepton-dekstroz kültür plakası üzerinde ilgi dondurulmuş maya zorlanma çizgi steril bir aşılama değnek kullanın. Kültürün dördüncü gününde, 600 nanometredeki optik yoğunluk 1,5 ile 2 arasında olduğunda, maya hücrelerini santrifüj le toplayın ve suda bulunan peletleri yıkayın ve hücreleri tek bir şişede birleştirin.Toplama için hücreleri tekrar döndürün ve peleti yaklaşık iki mililitre çift distile su yla yeniden askıya alın. Sonra yavaş yavaş dondurulmuş maya hücre pelet üretmek için bir seferde bir damla sıvı azot içine hücre bulamaç dağıtmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. Motor protein arınması için, dondurulmuş maya peletlerini ince bir toz haline getirmek için sıvı nitrojenle önceden soğutulmuş bir bıçak tipi kahve öğütücüsi kullanın ve maya tozunu önceden soğutulmuş, 100 mililitrelik cam kabına buz üzerinde aktarın.Tampon son konsantrasyonu 1X aşmaması için toz takviyeleri ile taze hazırlanmış 4X lysis tampon küçük bir hacim ekleyin ve hızlı bir şekilde toz eritmek için bir spatula ile sürekli karıştırma ile 37 derecelik santigrat su banyosunda beaker yerleştirin. Lysate 1X son tampon konsantrasyonu getirmek için takviyeleri ile ek 4X tampon ekleyin. Son hacmi genellikle 25 ve 30 mililitre arasındadır.Sonra santrifüj ile maya hücreleri toplamak ve buz üzerinde yeni bir 50 mililitrekonik tüp içine supernatant içeren çözünür protein aktarın. IgG yakınlık arınma için, protein ekstresi için yıkanmış afinite boncuk süspansiyon 200 mikrolitre ekleyin ve nazik rotasyon ile bir saat boyunca dört derece santigrat karışımı kuluçka. Kuluçka sonunda, karışımı, boncukları dört santigrat derecede hazırlamak için kullanılan kromatografi sütununa süzün, ardından buzüzerinde yıkama başına beş mililitre yıkama tamponu ile iki yıkama yapın.İkinci yıkamadan sonra, tamponun sütundan tamamen boşalmasını sağlayan beş mililitre TEV tamponuyla boncukları buz üzerinde durulayın. DNA oligonükleotid etiketleme için, kromatografi sütun kapağı, ve TEV tampon 100 mikrolitre ile takviye motor boncuk lar kuluçka 10 ila 15 dakika oda sıcaklığında saflaştırılmış benzilguanin oligo ile takviye, yavaşça dakikada bir kez boncuk yeniden sususpend. Kuluçka sonunda, taze TEV tampon en fazla 200 mikrolitre motor boncuk resuspension izin vermek için tüpün alt recapping önce, sadece gösterildiği gibi yıkama başına taze TEV tampon ile boncukdört kez yıkayın.TEV dekoltesi için, motor boncuk süspansiyonunu iki mililitrelik, yuvarlak alt, mikrosantrifüj tüpe aktarın ve motor boncukları mikrolitre başına yaklaşık 0,3 ünite TEV protaz ile 16 santigrat derecede nazik bir dönüşle inkümal edin. Kuluçka sonunda, motor boncuk santrifüj ve tüpün altındaki karışımı toplamak. Daha sonra, karışımı bir spin sütununa aktarmak için kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın ve karışımı az önce gösterildiği gibi santrifüj edin.TEV-cleaved, saflaştırılmış motorları içeren filtratı toplayın ve mikrotübül afinitesini arındırmak için 50 mikrolitrelik hacimlerde filtratı aliquot layın. Sonra flaş eksi 80 derece santigrat depolama için sıvı nitrojen aliquots dondurmak. Şasi arıtma için, arınma önce günün geç öğleden sonra, hafifçe katman 80 mikrolitre bir santrifüj tüp içinde origami katlanır tampon gliserol konsantrasyonu her.Katmanlar arasındaki sınırlar biraz görünür olmalıdır. Dört derece santigrat bir gecede kuluçka sonra, katman 10% gliserol origami katlanır tampon gradyan üst tabakası üzerinde katlanmış şasi çözeltisi, ve şasi ile gradyan santrifüj. Santrifüj sonunda, bir yukarıdan aşağıya doğru degrade 50 mikrolitre fraksiyonları toplamak ve% 2 agarose jel bireysel kuyular içine her kesir beş mikrolitre yükleyin.70 voltta 90 ila 120 dakika sonra, kullanılan DNA jeli lekesi için uygun koşulları kullanarak jelgörüntü. Seçilen ilgi fraksiyonlarının sayısal laştırılmış konsantrasyonları uygun standart spektroskopik yöntemler kullanılarak belirlenebilir. SDS-PAGE analizi, son filtrat yaklaşık 350 kilodalton net, keskin bir bant gösterir gibi, maya dan dynein başarılı ayıklama onaylamak için kullanılabilir.TEV protease de son filtrat mevcut ve yaklaşık 50 kilodaltons net bir bant oluşturur. Mikrotübül afinite arınması sonra, dynein açık, tek bant olarak görünür 350 kilodaltons, kinesin hafif bulaşma olarak görülebilir ise, yaklaşık 120 kilodaltonbirden fazla bant. TEV proteazek ek olarak, tubulin belirgin bir miktar da son supernatant görülebilir.DNA origami yapılarının katlanması agarose jel elektroforez ilerler, saf unfolded iskele iplikçik ve origami katlama gösteren katlama reaksiyonu arasında hareketlilik bir kayma ile. Ayrıca, katlanır reaksiyon şasi yapılarının bazı multimerization varlığını gösterir. Motor şasi topluluklarının hareketliliği TIRF filmlerinden üretilen kymograflarda kolayca tespit edilebilir ve ölçülebilir, çünkü yedi dinamin proteinine konjuge esnek şasinin kymografları nispeten tutarlı hızlarda son derece alel selakar lık lar gösterir.Prosedürün her adımında motor proteinlerinin sıcaklığını dikkatle kontrol etmek hayati önem taşır. Motor proteinlerve DNA origami şasi saflaştırma sonrasında, iki bileşen bir TIRF mikroskop altında toplulukların hareketlilik tahlilleri için konjuge edilebilir. Bu yöntem, motor toplulukların acil hareketliliğini yöneten biyofiziksel ve biyokimyasal mekanizmaların deşifre edilmesini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Canlı Hücresüper çözünürlüklü mikroskopi ve Tek Moleküllü İzleme için Konvansiyonel BODIPY Konjugeleri

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...