Name: high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00
Duration: 14 min 9 s
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作者要感谢欧洲研究理事会（授予B.S.A.第336716号）。作者还要感谢伊拉蒂·拉格弗拉瓜在录制和编辑视频方面提供的宝贵帮助。

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）层的制备
<ol><li>准备 10：1 组合 Sylgard 184 单体和固化剂。</li>
	<li>将混合物放入真空室，直到气泡消失。</li>
	<li>将 1.7 克 PDMS 混合物倒入 3.5 英寸（直径）培养皿的中心。</li>
	<li>将培养皿放在旋转外套机的真空夹头上。</li>
	<li>在 900 rpm 转速下旋转培养皿 20 s，加速度为 75 rpm/s。</li>
	<li>在50°C下将盘子固化至少2小时。</li>
</ol>2. 样品制备
<ol><li>
波导清洁
	<ol>
<li>在去离子 （DI） 水中制备 100 mL 的 1% 稀释洗涤剂浓缩液 （材料表）。</li>
		<li>使用晶圆钳将芯片放入玻璃培养皿中，并用洗涤剂溶液完全覆盖。</li>
		<li>将培养皿放在 70°C 的热盘上 10 分钟。</li>
		<li>当仍然在热板上时，用洁净室组织拭子擦拭表面。</li>
		<li>从培养皿中取出芯片。用至少 100 mL 的 DI 水冲洗。</li>
		<li>用至少100 mL的异丙醇冲洗，注意溶剂不会在表面上干燥，以防止蒸发污渍。</li>
		<li>用至少 100 mL 的 DI 水冲洗。用氮气枪将芯片吹干。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
室准备
	<ol>
<li>在培养皿中制备一层150μm聚甲基硅氧烷（PDMS）。</li>
		<li>使用手术刀从 PDMS 层切割 1.5 厘米 x 1.5 厘米框架。</li>
		<li>用钳子将框架从培养皿中提起。将其平放在干净抛光的芯片上。该示例现已准备好进行细胞种子设定。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
荧光贴标
	<ol>
<li>制备以下化学品：磷酸盐缓冲盐水溶液、染料溶液、dSTORM成像缓冲液。</li>
		<li>细胞播种后，从介质中取出芯片。</li>
		<li>使用移液器从 PDMS 造型室外清除多余的液体。</li>
		<li>用移液器从 PDMS 腔室中取出当前液体，同时添加约 60 μL 的清洁 PBS。 注： 添加到造型室的金额必须根据造型室大小进行更改。小心不要从细胞表面去除所有介质。</li>
		<li>用60μL的清洁PBS替换PBS，让它孵育1分钟。</li>
		<li>重复上一步，让它孵育5分钟。</li>
		<li>拆下 PBS 并将其替换为 60 μL 的染料溶液。让样品孵育约15分钟，使其免受光线照射。 注：此步骤可能必须显著更改，具体取决于使用的荧光染料。我们使用细胞掩码深红色来标记这个实验的细胞膜</li>
		<li>按照步骤 2.3.3-2.3.5 中的步骤，用 PBS 清洗样品。</li>
		<li>取出 PBS 并同时将其替换为 40 μL 的成像缓冲液。 注： 对于不同的荧光染料，有几个不同的成像缓冲液。</li>
		<li>将盖玻片放在顶部，防止气泡在下方形成。轻轻按压成像室的盖玻片，以去除任何多余的介质。</li>
		<li>使用移液器清除盖玻片外的任何多余介质。用水湿拭子清洁盖玻片外区域，以避免干燥浸渍介质残留物形成的晶体。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 成像程序
<ol><li>组件设置 注：此版本的设置由三个主要组件组成：显微镜、耦合阶段和样品级。请参阅材料表。<ol>
<li>使用带滤光片支架、白色光源、照相机和物镜的显微镜。</li>
		<li>使用带光纤耦合激光器和耦合透镜的 3 轴压电耦合级。</li>
		<li>使用带尖端和倾斜的单轴手动样品级和真空支架。</li>
		<li>将耦合和样品级安装在 2 轴电动级上，以便进行样品平移。</li>
	</ol></li>
	<li>波导耦合
	<ol>
<li>将芯片放在真空夹头上，使耦合面朝向耦合目标。确保芯片距离耦合目标大约一个焦距。</li>
		<li>打开真空泵。</li>
		<li>将激光打开至 1 mW。粗略调整芯片高度，使光束击中其边缘。关闭激光。</li>
		<li>打开白色光源。选择低放大倍率物镜（例如 10 倍）。将显微镜聚焦在波导上。</li>
		<li>沿波导翻译显微镜，看它是否与光学路径完全对齐。将显微镜移到耦合边缘。</li>
		<li>以 1 mW 或更少的速度打开激光。沿耦合边缘翻译显微镜以找到激光。将光束聚焦在芯片边缘上。</li>
		<li>沿光路调整耦合级，减小激光束光斑大小，直到其消失。光束现在位于芯片表面的上方或下方。</li>
		<li>调整耦合级高度，直到光束点重新出现并最大化。</li>
		<li>重复上述两个步骤，直到激光形成聚焦点。</li>
		<li>将焦点移动到感兴趣的波导。</li>
		<li>将显微镜与边缘距离较短的距离平移，使聚焦的光束点不再可见。关闭白灯。</li>
		<li>调整对比度。如果波导是引导的，则波导沿波导的散射光应清晰可见。</li>
		<li>调整耦合级的轴，以最大化散射光强度。关闭激光。</li>
		<li>打开白灯。如有必要，调整对比度。</li>
		<li>导航到成像区域。</li>
	</ol></li>
	<li>衍射有限成像
	<ol>
<li>以所需的成像目标为焦点。把白灯关掉。</li>
		<li>插入荧光滤光片，将激光功率调至 1 mW。</li>
		<li>将相机曝光时间设置为约 100 毫秒。确保联轴器仍然经过优化。</li>
		<li>找到成像感兴趣的区域。打开压电阶段循环以平均出模式。 注：20 μm 扫描范围，步长大小为 50 nm，适用于大多数波导结构。</li>
		<li>捕获至少 300 张图像。</li>
		<li>使用虚拟堆栈将捕获的映像堆栈加载到斐济。在斐济的图像菜单中，选择"堆栈"和"z 项目"。</li>
		<li>通过选择投影类型平均强度来计算 TIRF 图像。</li>
	</ol></li>
	<li>d斯托姆成像
	<ol>
<li>将激光打开到 1 mW，并将相机曝光时间设置为 30 毫秒。</li>
		<li>调整对比度和焦点。</li>
		<li>增加激光功率，直到看到闪烁。 注： 这可能需要一段时间，具体取决于消逝的场强度。</li>
		<li>放大样本的一小部分区域。</li>
		<li>调整对比度。</li>
		<li>捕获一些图像，以查看闪烁是否很好地分隔。</li>
		<li>调整相机曝光时间，以获得最佳闪烁效果。 注意：优化闪烁是一项复杂的任务，但有很多合适的文献是可用的12。</li>
		<li>打开压电阶段循环。</li>
		<li>根据闪烁密度，记录至少 30，000 帧的图像堆栈。</li>
	</ol></li>
	<li>dSTORM 图像重建
	<ol>
<li>打开斐济并加载dSTORM 堆栈作为虚拟映像。</li>
		<li>如有必要，调整对比度。</li>
		<li>使用矩形工具选择要重建的区域。</li>
		<li>开放运行分析在雷雨13插件在斐济。</li>
		<li>在雷雨中设置与设备对应的基本摄像机设置。其余默认参数通常令人满意。</li>
		<li>开始重建。 注： 对于整个视野，由于文件大小较大，数据可能需要分成子堆栈。</li>
		<li>筛选重建软件提供的本地化列表以删除未特定的本地化。如有必要，苹果会额外修正漂移。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-Based+Resonance+Raman+Spectroscopy+Using+Tantalum+Pentoxide+Waveguides.">Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides.</a> IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).</li><li>Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: <a target="_blank" href="https://arxiv.org/abs/1903.05512v1">https://arxiv.org/abs/1903.05512v1</a> (2019)</li><li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Samples+for+Optimizing+STORM+Super-Resolution+Microscopy.">Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waveguide-PAINT+offers+an+open+platform+for+large+field-of-view+super-resolution+imaging.">Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).</li></ol>

B.S. Ahluwalia 已申请专利 GB1606268.9 用于基于芯片的光学纳米显微镜。其他作者声明没有相互竞争的经济利益。

基于芯片的成像类似于传统的dSTORM 成像。因此，可以使用与传统dSTORM 成像相同的方法来测量图像质量。用户的主要区别是透明玻璃滑块与不透明的 Si 晶圆交换。虽然它们看起来非常不同，但样品处理实际上类似于玻璃幻灯片。芯片非常坚固，可以很容易地使用晶圆钳处理。成像过程和图像重建与常规dSTORM 实验中相同。设置基于芯片的功能显微镜不需要特殊组件，光子芯片除外。有关设置的进一步详情，可在先前的工作6、7中找到。这项工作中使用的芯片是使用标准光刻8制造的。
样品制备包括样品室的制备。将 PDMS 机架连接到芯片时，避免空气可能进入的任何小褶皱或裂口至关重要。如果 PDMS 在连接时折叠，只需用钳子小心地将其拆下并重新连接即可。当样品在 PDMS 腔室内准备好时，必须将盖玻片压住，密封该区域。请务必避免在连接盖玻璃时可能出现的任何气泡。如果形成气泡，请轻轻取下盖玻璃，并将 PBS 添加到样品室，以确保样品被覆盖。然后，盖玻片的准备和附件可以简单地重新处理。
利用本文提出的方案，简化了将光耦合到波导中。但是，有一些常见的挑战可以限制耦合。首先，如果芯片未正确清洁，且任何剩余 PBS 完全去除，则波导上可能有污垢或结晶 PBS。这会带来重大损失，导致成像区域的功率极小。使用湿拭子清洁盖玻璃外部的区域可以显著提高功率。其次，如果波导的耦合面损坏（例如，处理不当），耦合损耗可能会急剧增加。对边缘的光学检查通常会很容易发现任何损坏。芯片的整个耦合面可以像光纤一样仔细抛光，并给出平滑的耦合面，从而增加耦合功率。
耦合光后，成像过程与任何传统的dSTORM 设置相同。如果图像具有不均匀的激发（如图 2A所示，则很可能平均模式不起作用）。其中最常见的两个原因是：1） 捕获的图像太少，以创建平均堆栈;2） 太短的振荡距离/太大的步长大小。收集太少的图像可以排除一些激励模式，因此平均值将是不均匀的。这可以通过增加平均堆栈中的映像数来轻松解决。振荡距离过短也会导致图像不均匀，因为没有足够的模式模式激发。这也可以通过增加振荡距离和/或减小步长大小来轻松解决。在这项工作中，我们使用压电级扫描超过20μm的输入激光束，并获取至少300个图像。另一种方法可能是使用高速电镜在单个采集时间内扫描输入波导面上的光线，例如 10-30 ms。 此选项适用于活细胞 TIRF 成像，其中亚细胞细胞器处于恒定运动状态。
基于芯片的dSTORM 提供前所未有的大面积 TIRF 激发，非常适合高通量成像。紧凑的特性允许对商业系统进行改造，其中芯片可以倒置放置，用于倒置设置或开发透明基板。芯片是大批量生产的，可以修改，以满足许多需求。目前，主要限制是仅限于 2D。离波导表面仅约200纳米的消声场可用，因此只有该区域内的荧光道才会兴奋。总之，集成光学领域通过解决新的成像问题以及为现有问题提供新的可能性，在不远的将来为基于芯片的显微镜提供了许多机会。

自从首次演示单分子定位显微镜以来，已经开发出许多变异来解决不同的挑战1，2，3。然而，仍然存在的一个挑战是大视场dSTORM成像。许多dSTORM 设置使用相同的客观镜头来激发样品并进行图像成像。为了增加视野，需要低放大倍率镜头。低放大率和低数值光圈 （NA） 物镜通常具有较大的景深，从而导致平面外信号增加，从而降低定位精度。TIRF 物镜通常用于通过减少平面外荧光来增加图像对比度。通过TIRF，激发被限制在距表面约150nm的光学厚度，通过消逝场4。TIRF 物镜需要一个大的 NA，从而产生一个小视场 （FOV）（例如 50 x 50 μm2），这极大地限制了吞吐量。然而，有其它方法可以生成一个消逝的场。
光波导是一种结构，如果将光耦合到结构中，它将限制和引导光。最常见的是，波导用于光纤通信。为了开发二维集成波导作为光子集成电路的主要组件，我们做出了巨大的努力。该技术已经发展到一个点，制造低损耗纳米结构的光波导可以例行完成5。如今，世界各地的几家铸造厂可用于开发光子集成电路。波导引导光通过总内部反射也表现出一个在表面的消逝场。通过对波导结构的精心设计，可以在消逝领域实现高强度。因此，直接放置在波导表面顶部的样品也可以通过图像应用的消逝场进行照明。消逝场将沿波导的整个长度和宽度生成，因此可以任意大6。
我们提出了一种新方法的TIRF dSTORM，它提供了一个任意大的视野。而不是使用TIRF镜头的激励和收集，我们激发使用从光波导的消逝场。这种分离使激发和集合光通路分离，允许沿集合光路径实现完全自由，同时不影响波导芯片照明提供的给定波长的光切片。因此，低放大倍率镜头可用于在 TIRF 模式下拍摄非常大的区域，尽管较小的 NA 会降低横向分辨率。此外，使用波导7也大大简化了多色成像，因为无需重新调整系统即可引导和检测多个波长。这有利于dSTORM，因为低波长可用于增强荧光闪烁和多色成像。值得注意的是，消逝场的穿透深度会随着波长的函数而变化，尽管它不会影响成像过程的进行方式。该芯片与活细胞成像8兼容，是微流体集成等应用的理想选择。每个芯片可以包含几十个波导，可以允许用户在不同条件下成像或应用光学陷印9和拉曼光谱10。
基于芯片的系统同样适用于衍射受限和超高分辨率成像。2005年，一种类似的方法被引入，使用棱镜产生消逝的场激发4。光子芯片也通过消逝场激发，但采用现代波导制造技术，可以生成带有波导的奇异光图案。目前的基于芯片的纳米显微镜实现仅限于2D成像，因为激发场被锁定在波导表面。未来的开发将针对 3D 应用。此外，其他超分辨率技术，如结构化照明显微镜正在开发使用相同的芯片显微镜11。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-axis sample stage</td>
			<td>Standa</td>
			<td>7T173-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-axis sample translation stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis NanoMax stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MAX311D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXFM microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red, Life technologies</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom grade swabs</td>
			<td>MRC Technology</td>
			<td>MFS-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-coupled laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>Flamenco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Holder</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Cleaning detergent concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-E0433314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Coupling lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LMPLFLN 50x/0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>Mix according to descriptions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HWV001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Tweezers Type 2W</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGT5051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip

全内反射荧光 （TIRF） 通常用于基于单分子定位的超分辨率显微镜，因为它由于光学切片而增强了对比度。传统方法是使用高数值孔径显微镜 TIRF 物用于激励和收集，严重限制了视野和吞吐量。我们提出了一种利用光学波导（称为基于芯片的纳米显微镜）为成像生成 TIRF 激发的新方法。此协议的目的是演示如何在已构建的设置中执行基于芯片的映像。基于芯片的纳米显微镜的主要优点是激励和收集通路是分离的。然后，可以使用低放大倍率镜头进行成像，从而产生大视场 TIRF 图像，分辨率会小到降低。肝正弦内皮细胞（LSECs）使用直接随机光学重建显微镜（dSTORM）成像，显示其分辨率可与传统的超分辨率显微镜相媲美。此外，我们还通过低放大镜头对 500 μm x 500 μm 区域进行成像，提供 76 nm 的分辨率，从而演示了高通量能力。基于芯片的成像技术具有紧凑的特性，可以改装成最常见的显微镜，并与其他片上光学技术（如片上传感、光谱学、光学陷印等）相结合。因此，该技术非常适合高通量 2D 超分辨率成像，但也为多模态分析提供了绝佳的机会。

TIRF 显微镜是一种流行的技术，因为它可去除平面外荧光，增加对比度，从而提高图像质量，并且与其他基于荧光的显微镜技术相比，光毒性更低。与传统的基于目标的方法相比，基于芯片的显微镜提供TIRF激励，而无传统的TIRF镜头附带的有限吞吐量。在图 1A中，可以概述所呈现的设置。我们展示了从小鼠中提取的肝正弦内皮细胞（LSEC）的衍射受限图像和dSTORM图像。还演示了标有微图布林的LSE的大屏幕视场图像，展示了高通量成像的能力。使用油浸 TIRF 镜头（60 倍或 100 倍放大倍数）的常规dSTORM 设置通常可拍摄 50 μm x 50 μm 的面积，比图2中基于芯片的图像小 100 倍，以 25 倍、0.8 NA 目标成像。
在此方法中，我们使用多模 Si3N4波导进行激励。利用的芯片由沉积在硅芯片的2μm氧化层上的150纳米Si3N4的带状蚀刻导向层组成。芯片的原理图见图1B。波导宽度可在200至1000 μm之间变化。通过传播模式之间的干扰，激发光将没有均匀的强度分布，而是空间变化的模式。图 2A显示了具有清晰可见模式模式的图像。此干扰模式将随激光束在波导边缘的位置而变化。为了在最终图像中实现均匀激发，我们使用压电级沿耦合面振荡。在成像过程中，干扰模式存在足够的变化，以便可以求平均值，从而消除图像中的强度波动。图像堆栈将由多个图像组成，如图2A所示，虽然具有不同的模式，但平均时，堆栈将生成具有均质激发的图像，如图2B。另一种方法是使用绝热锥化来实现宽，单模波导8，14，这消除了模式平均的必要性。然而，要保持单模状态，需要几毫米的锥度长度，才能达到100μm波导宽度。多模式波导可规避这种逐渐减少的必要性，对结构宽度没有限制。除了照明模式之外，模式的高效折射率为结构化照明显微镜11和波动显微镜方法7提供了前所未有的可能性。
成像的第一步是收集衍射受限图像。实验产生大约 300 个图像的堆栈，最终图像是通过取堆栈的平均值来制作的。在图2中，我们使用60x、1.2 NA水浸物目标，对标有细胞掩蔽深红色的LSE的衍射有限和dSTORM成像进行了演示。图 2A显示了由于模式平均不足而导致的不均匀照明。成功模式平均显示在图2B中。图 2C是同一区域的dSTORM 图像，其标记区域如图2D所示。肝正弦内皮细胞在血浆膜15中具有纳米大小的毛孔，在这里可以看到。傅立叶环相关分析提供了 46 nm 的分辨率。
图 3显示了 500 μm x 500 μm 区域的dSTORM 图像，演示了该技术的高吞吐量能力。图 3A的缩放图像对应于典型的dSTORM 视场，与图3B中的衍射有限图像一起显示。傅立叶环关联，以估计分辨率被执行，产生76纳米的值。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> 图1：成像系统和波导。（A） 成像系统的照片.样品放在样品台上的真空夹头上，波导的耦合面朝向耦合目标。光纤耦合激光器和耦合物被放置在 3D 压电级的顶部。带成像镜头的镜头炮塔从上面捕获图像并将其中继到相机。（B） 带耦合和成像透镜的波导图。耦合透镜将光线耦合到波导中。样品（橙色珠子）保存在密封的PDMS腔内。沿波导的消逝场将激发样品，成像目标将捕获发射的荧光。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> 图 2：衍射限制和dSTORM 图像。（A） 肝正弦内皮细胞图像，模式平均值不足，产生清晰可见的激发模式。（B） 与 （A） 中的同一区域， 但具有足够的模式平均，导致同质激发.（C） 分集的衍射有限图像 （B）;（D）同一区域的 STORM 图像。（E） （D） 的内分 ， 清楚地显示细胞血浆膜中的芬芳.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> 图3：d大鼠LSEC的STORM图像。（A） 大视场dSTORM 图像的 Alexa 647 彩色图布林在大鼠 LSEC.比例尺 = 50 μm. （B） 来自 （A） 较大的标记区域，比较衍射限制（左下）和dSTORM 图像（右上）。（C） 来自 （A） 的标记区域较小。刻度条 = 1 μm。图像的分辨率为 76 nm。改编从海尔等人的许可，20196.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

基于芯片的超分辨率光学显微镜是荧光显微镜的一种新方法，具有成本效益和吞吐量方面的优势。此处显示了用于 TIRF 显微镜和基于定位的超分辨率显微镜的芯片制备和成像协议。

使用光子芯片的高通量总内反射荧光和直接随机光学重建显微镜

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

本手稿的主要目标是介绍新开发的基于光子芯片的 TIRF 显微镜和单分子本地化显微镜（如 dSTORM）的成像过程。这里的主要组件是由光学波导系列构成的光子芯片。光波导内部的光是根据总的内部反射来引导的。有些光以消逝的波的形式存在于表面。那些消逝的波，它们从表面呈指数级衰变，穿透深度为几百纳米。这使得它们适用于 TIRF 照明。通过光波导的TIRF照明可在极大区域使用，该区域由波导几何定义，因此非常适合高通量成像。与我们的方法相比，传统 TIRF 和 dSTORM 设置之间的主要区别在于，我们使用光子芯片来照亮样品，而不是通过成像客观透镜发送光线。我们的方法将照明和收集灯部分分离，为新的成像可能性开辟了。使用晶圆钳子将芯片放在玻璃培养皿中，用 1% 的 Hellmanex 溶液完全覆盖。将培养皿放在 70 度的加热盘上 10 分钟。在加热盘上时，用洁净室组织棉签擦拭表面。从培养皿上取下碎屑。用至少100毫升的去水冲洗。用至少 100 毫升异丙醇冲洗，注意溶剂表面不干燥，以防止蒸发污渍。用至少100毫升的去水冲洗。用氮气枪将芯片吹干。稍后在培养皿中旋转 150 微米 PDMS。使用手术刀从 PDMS 图层切割大约 1.5 1.5 厘米的框架。用钳子从培养皿上提起框架。平放在干净抛光的芯片上。该示例现在已准备就绪，用于细胞种子设定。细胞种子后，从介质上取出芯片。使用移液器从 PDMS 腔室外清除多余的液体。用移液器从 PDMS 腔室内取出电流液体，同时添加大约 60 微升清洁 PBS。用 60 微升清洁 PBS 更换 PBS，让它孵育一分钟。重复上一步，让它孵育五分钟这一次。取出 PBS，然后用 60 微升染料溶液进行更换。让样品孵育约15分钟，保护其免受光线的遮挡。使用前面描述的程序用 PBS 清洗样品。卸下 PBS，同时将其替换为 40 微升的成像缓冲器。将盖玻片放在顶部，防止气泡在下方形成。轻轻按压成像室上的盖玻片，以去除任何多余的介质。使用移液器去除盖玻片外的任何多余的介质。使用水湿拭子清洁盖玻片外区域，以避免干燥浸入式介质残留物形成晶体。此版本的设置由三个主要组件组成。带滤光片支架、白色光源、相机和目标左轮手枪的显微镜。耦合级，这是一个三轴压电级，带光纤耦合激光和耦合透镜。样品级，这是一个单轴手动级，带尖端和倾斜，带真空支架。耦合和样品级都安装在双轴电动级上，用于样品转换。将芯片放在真空卡车上，将耦合面朝向耦合目标。确保芯片与耦合目标大约一焦距。打开真空泵。将激光打开至一毫瓦。大致调整芯片高度，使光束击中其边缘。关闭激光。打开白色光源。选择低放大倍数的客观镜头，例如，10 倍。将显微镜聚焦在波导上。沿波导翻译显微镜，看其是否与光路对齐。将显微镜移动到耦合边缘。以一毫瓦或更少电位打开激光。沿耦合边缘翻译显微镜以找到激光。将光束聚焦在芯片边缘上。沿光路调整耦合级，沿方向减小激光束点大小，直到其消失。光束现在位于芯片表面的上方或下方。调整耦合级高度，直到光束点重新出现并最大化。重复前两个步骤，直到激光形成聚焦点。将焦点移动到感兴趣的波导。将显微镜翻译到离边缘较远的地方，以便聚焦光束点不再可见。关掉白灯。调整对比度。如果波导在引导，则沿波导的散射光应清晰可见。调整耦合级轴以最大化散射光强度。关闭激光。打开白光。如有必要，调整对比度。导航到成像区域。关注所需的想象目标。关闭白灯。插入荧光过滤器，将激光功率转动至一毫瓦。将摄像机曝光时间设置为大约 100 毫秒。根据需要调整对比度。确保联轴器仍经过优化。找到成像感兴趣的区域。打开压电阶段循环以平均出节点。捕获至少 300 张图像。使用虚拟堆栈将捕获的图像堆栈加载到斐济。从斐济的图像菜单中，选择"堆栈"和"Z 项目"。通过选择投影类型"平均强度"来计算 TIRF 图像。将激光打开至一毫瓦，将摄像机曝光时间设置为 30 毫秒。调整对比度和焦点。增加激光功率，直到观察到闪烁。放大示例的小区域。调整对比度。捕获一些图像，以查看闪烁是否分离良好。调整摄像机曝光时间以获得最佳闪烁效果。打开压电阶段循环。根据闪烁密度，录制至少 30，000 帧的图像堆栈。打开斐济，将 dSTORM 堆栈加载为虚拟映像。如有必要，调整对比度。使用矩形工具选择要重建的区域。在斐济的雷暴插件中打开运行分析。在雷暴中设置与您的设备对应的基本摄像机设置。剩余的默认参数通常令人满意。开始重建。将筛选重建软件提供的本地化列表，以删除非特异性本地化。如有必要，将应用额外的漂移校正。基于芯片的成像与传统成像的主要区别在于仪器和数据采集。因此，可以像从商业超分辨率显微镜中评估图像一样评估重建图像的质量。由于使用多模式波导，因此，如果收集的图像太少，生成的图像可能会表现出不均匀的激发。这显示在面板 a 中。增加激发模式的数量应导致不均匀的激发，如面板 B 所示。在这里，我们用荧光标记的血浆膜成像了肝脏正弦内皮细胞。面板 a 和 b 是衍射受限的图像。面板 c 显示面板 b 中插入的衍射受限图像。面板 d 显示同一区域的 dSTORM 图像。肝正弦内皮细胞的血浆膜中具有纳米大小的芬斯特，在面板d的超分辨率图像中清晰可见。基于芯片的超分辨率成像的主要优势之一是可实现的大视野。面板 a 显示了一个 500 微米到 500 微米大的 dSTORM 图像，该图像显示肝脏正弦内皮细胞与荧光标记的微图布林。面板 b 显示面板 a 中的洋红色内嵌，同时显示衍射受限和超分辨率图像进行比较。面板 c 显示面板 a 中的绿色插图。捕获的图像分辨率为 77 纳米。在这段视频中，我们使用光子芯片对肝脏正弦内皮细胞进行了大视场TIRF和dSTORM成像。我们的方法比传统的使用预先数值孔和低视场的显微镜目标执行 TIRF 的方法不那么复杂、更紧凑、更灵活。本地化显微镜（如 dSTORM）是我们使用光子芯片探索的几种超分辨率成像技术之一。例如，光可以更紧密地限制在高折射率光学波导材料内，而不是使用成像物镜。芯片照明的这一特性在提高强度波动光学显微镜法和结构化照明显微镜分辨率方面已占应用。此外，光子芯片还受益于小型化、成本效益和简单的光学设置。作为一种集成技术，它与其他片上光学功能兼容。总之，这使得改装成传统的衍射受限显微镜成为可能，从而能够以较低的成本实现超分辨率。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

使用新型不溶性生色底物检测试剂盒碳水化合物降解酶的高通量筛选

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

科研

生物化学

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

A蛋白制备方法在蛋白质与核余子交互使用LC-MS / MS分析的高通量鉴定

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

使用多柱板适配器的经济性和多功能性高通量蛋白质净化系统

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

同步干涉反射和全内反射荧光显微镜，用于动态微管和相关蛋白质的成像

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

利用微流体和荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝和束的组装动力学

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

通过全内反射荧光（TIRF）显微镜 在体外 可视化肌动蛋白和微管耦合动力学

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

用于重组G蛋白偶联受体高通量筛选的“双加法”钙荧光测定

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

通过微透析 实现 高通量蛋白质结晶

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...