Name: high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

המחברים מתבקשים להכיר במועצת המחקר האירופאית (למענק מס ' 336716 לB.S.A.). המחברים גם רוצה להודות Irati Lagfragua על הסיוע שלה יסולא בפז עם הקלטה ועריכה של וידאו.

1. הכנת שכבת פולידימתיל (PDMS)
<ol><li>הכינו שילוב 10:1 של סילגארד 184 מונומר ומרפא סוכן.</li>
	<li>הניחו את התערובת בחדר ואקום עד שבועות האוויר יעלמו.</li>
	<li>יוצקים 1.7 g של תערובת PDMS במרכז של 3.5 אינץ ' (קוטר) צלחת פטרי.</li>
	<li>מניחים את צלחת פטרי על שואב ואקום של מסתובב ספין.</li>
	<li>ספין מעיל צלחת פטרי עבור 20 s ב 900 סל ד, עם האצה של 75 rpm/s.</li>
	<li>מרפאת את הצלחת על פלטה ב 50 ° c לפחות 2 h.</li>
</ol>2. הכנה לדוגמא
<ol><li>
מדריך גל לניקוי
	<ol>
<li>הכינו 100 מ ל של 1% דילול של תרכיז ניקוי כביסה (טבלת חומרים) במים מפוהים (DI).</li>
		<li>מניחים את השבב בצלחת פטרי מזכוכית באמצעות טוויצר וופל ומכסים לחלוטין את התמיסה עם חומרי הניקוי.</li>
		<li>מניחים את צלחת פטרי על צלחת חמה ב 70 ° c עבור 10 דקות.</li>
		<li>בזמן שהוא עדיין על הצלחת החם, לשפשף את פני השטח עם ספוגית רקמות חדר נקי.</li>
		<li>הסר את השבב מהצלחת פטרי. לשטוף עם לפחות 100 mL של מים DI.</li>
		<li>לשטוף עם לפחות 100 mL של איזופנול, לטפל כי ממס אינו יבש על פני השטח כדי למנוע כתמי אידוי.</li>
		<li>לשטוף עם לפחות 100 mL של מים DI. . לפוצץ את השבב עם אקדח חנקן</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה קאמרית
	<ol>
<li>הכינו שכבה של 150 יקרומטר polydiמתיל siloxane (pdms) בצלחת פטרי (סעיף 1).</li>
		<li>השתמש באזמל כדי לחתוך מסגרת 1.5 ס"מ x 1.5 ס מ משכבת PDMS.</li>
		<li>הרם את המסגרת מצלחת פטרי עם טוויצר. הפקיד את הדירה בשבב נקי ומצוחצח. הדגימה מוכנה כעת. לזריעת תאים</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תיוג פלורסנט
	<ol>
<li>הכינו את הכימיקלים הבאים: תמיסת מלח באגירה של פוספט, תמיסתצבע (s), מאגר הדמיה של הסופה.</li>
		<li>לאחר זריעת תאים, הסר את השבב מהמדיה.</li>
		<li>השתמש בפיפטה כדי להסיר כל נוזל עודף מחוץ לחדר PDMS.</li>
		<li>להסיר את הנוזל הנוכחי מתוך החדר PDMS עם פיפטה תוך הוספת כ 60 μL של הPBS נקי באותו זמן. הערה: הסכום שיתווסף לחדר יהיה חייב להשתנות בהתאם לגודל החדר. היזהר שלא להסיר את כל המדיה ממשטח התא.</li>
		<li>החלף את ה-PBS עם 60 μL של הערוץ הנקי ולתת לו לעבור במשך 1 דקות.</li>
		<li>חזור על הצעד הקודם, ולתת לו לדגירה 5 דקות הפעם.</li>
		<li>הסר את ה-PBS והחלף אותו ב-60 μL של פתרון הצבע. השאירו את הדגימה לדגירה במשך 15 דקות, הגנה אותו מפני האור. הערה: ייתכן ששלב זה ישתנה באופן משמעותי, בהתאם לצבע הפלורסנט שבשימוש. כדי לתייג את קרום התא לניסוי הזה</li>
		<li>לשטוף את המדגם עם PBS כמו בשלבים 2.3.3-2.3.5.</li>
		<li>הסר את ה-PBS והחלף אותו ב-40 μL של מאגר ההדמיה בו. הערה: קיימים מספר מאגרי דימות שונים עבור צבעי פלורסנט שונים.</li>
		<li>מניחים שמיכות למעלה, מונע בועות אוויר להרכיב מתחת. לחץ בעדינות על הכיסויים נגד חדר ההדמיה כדי להסיר מדיה עודפת כלשהי.</li>
		<li>השתמש בפיפטה כדי להסיר. את כל המדיה העודפת מחוץ למסווה לנקות את האזור מחוץ coverslip עם משטח לח מים כדי למנוע גבישים שנוצרו על ידי שאריות מדיה טבילה מיובשים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הליך הדמיה
<ol><li>הגדרת רכיב הערה: גרסה זו של הכיוונון מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: המיקרוסקופ, שלב הצימוד והשלב המדגם. ראה את רשימת החומרים.<ol>
<li>השתמש במיקרוסקופ עם בעל מסנן, אור לבן מקור, מצלמה, ואת האקדח האובייקטיבי.</li>
		<li>השתמש בשלב צימוד שלושה צירים עם לייזר בשילוב סיבים ועדשת צימוד.</li>
		<li>השתמש בשלב לדוגמה ידנית של ציר אחד עם טיפ והטיה ומחזיק ואקום.</li>
		<li>הצמד את הצימוד וגם את השלב לדוגמה בשלב 2-ציר ממונע עבור תרגום לדוגמה.</li>
	</ol></li>
	<li>מצמד מדריך גל
	<ol>
<li>מניחים את השבב על צ'אק ואקום עם פן צימוד לכיוון היעד צימוד. ודא שהשבב נמצא במרחק של אורך מוקד אחד בקירוב ממטרת הצימוד.</li>
		<li>. תדליק את משאבת הוואקום</li>
		<li>הפעל את הלייזר ל-1 mW. כוונן בערך את גובה השבב כך שהקרן תפגע בקצהו. . תכבה את הלייזר</li>
		<li>. תדליק את מקור האור הלבן בחר בעדשת יעד בהגדלה נמוכה (לדוגמה 10x). למקד את המיקרוסקופ על מדריך גל.</li>
		<li>תרגם את המיקרוסקופ לאורך מדריך גל כדי לראות אם הוא מיושר היטב עם הנתיב האופטי. הזיזו את המיקרוסקופ לקצה הצימוד.</li>
		<li>הפעל את הלייזר ב-1 mW או פחות. תרגם את המיקרוסקופ לאורך הקצה צימוד למצוא את אור הלייזר. . למקד את הקרן על קצה השבב</li>
		<li>כוונן את שלב הצימוד לאורך הנתיב האופטי בכיוון המפחית את גודל נקודת האור של הלייזר עד שהוא ייעלם. הקרן עכשיו מעל או מתחת. למשטח השבב</li>
		<li>התאימו את גובה שלב הצימוד עד שנקודת האור מופיעה שוב ומוגדלת.</li>
		<li>חזור על שני השלבים הקודמים עד שלייזר יוצר נקודה ממוקדת.</li>
		<li>הזיזו את המקום הממוקד למדריך העניין.</li>
		<li>תרגם את המיקרוסקופ במרחק קצר מהקצה, כך שנקודת הקרן המתמקדת אינה גלויה עוד. . כבה את האור הלבן</li>
		<li>כוונן את הניגודיות. אם מדריך גל מנחה, האור הפזורים לאורך מדריך גל צריך להיות גלוי בבירור.</li>
		<li>כוונן את צירי שלב הצימוד כדי למקסם את עוצמת האור המתפזרת. . תכבה את הלייזר</li>
		<li>. תדליק את האור הלבן התאימו את הניגוד במידת הצורך.</li>
		<li>נווט לאזור הדימות.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה מוגבלת של עקיפה
	<ol>
<li>התמקד במטרת ההדמיה הרצויה. . תכבה את האור הלבן</li>
		<li>הכנס את מסנן הזריחה והפעל את כוח הלייזר ל-1 mW.</li>
		<li>הגדר את זמן חשיפת המצלמה כ-100 ms. כוונן את הניגודיות לפי הצורך. ודא כי הצימוד עדיין ממוטב.</li>
		<li>אתר אזור מעניין לדימות. הפעל לולאה של הבמה piezo למצב ממוצע החוצה. הערה: טווח סריקה של 20 יקרומטר עם גודל שלב של 50 ננומטר מתאים לרוב מבני מדריך גל.</li>
		<li>לכידת לפחות 300 תמונות.</li>
		<li>טען את ערימת התמונות שנלכדה לפיג באמצעות מחסנית וירטואלית. מתפריט התמונה בפיג, בחרו ' ערימות ' ו'פרוייקט z'.</li>
		<li>חישוב התמונה TIRF על-ידי בחירה בעוצמה ממוצעתשל סוג הקרנה.</li>
	</ol></li>
	<li>ד הדמיית סערות
	<ol>
<li>הפעל את הלייזר ל-1 mW וקבע את זמן חשיפת המצלמה ל-30 אלפיות הראשונה.</li>
		<li>כוונן את הניגודיות והמיקוד.</li>
		<li>להגדיל את כוח הלייזר עד להבהב הוא נצפתה. הערה: ייתכן שפעולה זו עשויה להימשך זמן מה, בהתאם לעוצמת שדה האוונ,.</li>
		<li>התקרבות לאזור קטן בדוגמה.</li>
		<li>כוונן את הניגודיות.</li>
		<li>לכוד כמה תמונות כדי לראות אם הבהובים מופרדים היטב.</li>
		<li>כוונן את זמן חשיפת המצלמה להבהוב האופטימלי. הערה: מיטוב מהבהב היא משימה מורכבת, אבל הרבה ספרות מתאימה זמין12.</li>
		<li>הפעל את הלולאה בשלב הפיזו.</li>
		<li>הקלט מחסנית תמונה של לפחות 30,000 מסגרות, בהתאם לדחיסות המהבהב.</li>
	</ol></li>
	<li>ד שחזור תמונת סופה
	<ol>
<li>פתח את פיג'י וטען את מחסנית הסערה dכתמונות וירטואליות.</li>
		<li>כוונן את הניגודיות, במידת הצורך.</li>
		<li>השתמש בכלי המלבן כדי לבחור את האזור לשחזור.</li>
		<li>פתיחת ניתוח הפעלה בסופת רעמים13 תוסף בפיג.</li>
		<li>קבעו את הגדרות המצלמה הבסיסיות במטרים המתאימים למכשיר. פרמטרי ברירת המחדל הנותרים הם בדרך כלל משביע רצון.</li>
		<li>. התחל בשחזור הערה: עבור שדה התצוגה המלא, ייתכן שיהיה צורך לחלק את הנתונים בערימות משנה, עקב גודל הקובץ הגדול.</li>
		<li>סנן את רשימת הלוקליזציה שסופקה על-ידי תוכנת השחזור כדי להסיר לוקליזציה לא ספציפית. אפל תיקון הסחף נוסף אם יש צורך בכך.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Wazawa, T., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+single+molecule+nanobioscience.">Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).</li><li>Jalali, B., Fathpour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+photonics.">Silicon photonics.</a> Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).</li><li>Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., &#216;ie, C. I., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+on-a-chip:+super-resolution+imaging+on+the+millimeter+scale.">Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale.</a> Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).</li><li>Diekmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+wide+field-of-view+nanoscopy.">Chip-based wide field-of-view nanoscopy.</a> Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).</li><li>Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+waveguide+platform+for+fluorescence+microscopy+of+living+cells.">Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells.</a> Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).</li><li>Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Helles&#248;, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+propulsion+of+red+blood+cells+on+waveguide+surfaces.">Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces.</a> Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).</li><li>Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-Based+Resonance+Raman+Spectroscopy+Using+Tantalum+Pentoxide+Waveguides.">Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides.</a> IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).</li><li>Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: <a target="_blank" href="https://arxiv.org/abs/1903.05512v1">https://arxiv.org/abs/1903.05512v1</a> (2019)</li><li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Samples+for+Optimizing+STORM+Super-Resolution+Microscopy.">Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waveguide-PAINT+offers+an+open+platform+for+large+field-of-view+super-resolution+imaging.">Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).</li></ol>

בסיס הרפואה החלה עבור 1606268.9 בזיכרון הפטנטים עבור ננוסקופיה אופטית מבוססת שבב. המחברים האחרים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הדמיה מבוססת שבב דומה הדמיית הסערה dקונבנציונאלי. איכות התמונה יכול ובכך להיות מגויח באמצעות אותן גישות כמו עבור הדמיה מסורתית הסערה d. ההבדל העיקרי בפני המשתמש הוא ששקופית הזכוכית השקופה מוחלפים באמצעות כופל בורדו. למרות שהם נראים שונים מאוד, הטיפול במדגם הוא למעשה אנלוגי לשקופית זכוכית. השבבים הם חזקים למדי והוא יכול בקלות להיות מטופלים באמצעות מלקחיים וופל. הליך ההדמיה ושחזור התמונה זהה לניסוי בסערה רגילה. הגדרת מיקרוסקופ מבוסס שבב פונקציונלי לא דורש רכיבים מיוחדים, למעט שבבי פוטוני. פרטים נוספים על הגדרת ניתן למצוא בעבודה הקודמת6,7. השבבים המשמשים בעבודה זו הפוברק באמצעות פוטוגרפיה סטנדרטית8.
הכנת הדוגמא מקיפה את הכנת חדר הדגימה. בעת חיבור מסגרת PDMS לשבב, זה חיוני כדי למנוע כל קפלי קטן או קורע איפה האוויר יכול להיכנס. אם pdms קפלי בעת הצמדת אותו, פשוט להסיר אותו בזהירות עם פינצטה ולחבר אותו. כאשר המדגם מוכן בתוך התא PDMS, הcoverglass יש ללחוץ עליו, איטום האזור. חשוב להימנע כל בועות אוויר שעשוי להיווצר בעת חיבור הcoverglass. אם נוצר בועת אוויר, להסיר בעדינות את שמיכות ולהוסיף PBS לחדר לדוגמה כדי להבטיח כי המדגם מכוסה. ההכנה וההחזקה של שובר הכיסוי יכולים פשוט להיות משופץ.
האור הצימוד לתוך מדריך הגל הוא פשוט באמצעות הפרוטוקול המוצע בנייר זה. עם זאת, ישנם כמה אתגרים נפוצים שיכולים להגביל את הצימוד. ראשית, אם השבב לא נוקה כראוי, כל שאריות PBS הוסרו לחלוטין, יכול להיות לכלוך או מגובש PBS על מדריך גל. זה יכול להציג הפסדים גדולים, וכתוצאה מכך מעט מאוד כוח באזור ההדמיה. שימוש בספוגית לח כדי לנקות את האזור מחוץ לזכוכית המכסה יכול לשפר את הכוח באופן משמעותי. שנית, אם ההיבט הצימוד של מדריך גל ניזוק (למשל, על ידי טיפול לא נאות), אובדן הצימוד יכול להגביר באופן דרסטי. בדיקה אופטית של הקצה יגלה בדרך כלל נזקים בקלות. ההיבט הצימוד כולו של השבב יכול להיות מלוטש בזהירות, בדומה סיבים אופטיים, והוא ייתן פן צימוד חלקים, אשר לאחר מכן מגביר את הכוח ביחד.
לאחר שהאור משולב, הליך ההדמיה זהה לכל הגדרות הסערותהרגילות. אם התמונה היא בעלת עירור הומוגניות, כפי שמתואר באיור 2A, סביר להניח שהמצב בממוצע לא עבד היטב. שתי הסיבות השכיחות ביותר לכך הן: 1) מעט מדי תמונות שנתפסו כדי ליצור מחסנית ממוצעת 2) קצר מדי של מרחק תנודה/גדול מדי של גודל השלב. איסוף מעט מדי תמונות יכול להשאיר כמה דפוסי עירור והממוצע יהיה ובכך להיות הומוגנית. ניתן לפתור זאת בקלות על-ידי הגדלת מספר התמונות במחסנית הממוצעת. קצר מדי של מרחק תנודות יכול גם לגרום לתמונה לא הומוגנית, כמו לא מספיק דפוסי מצב מתרגשים. ניתן גם לפתור זאת בקלות על-ידי הגברת מרחק התנודה ו/או הקטנת גודל השלב. בעבודה זו השתמשנו בשלב piezo כדי לסרוק את קרן לייזר קלט מעל 20 יקרומטר ולרכוש לפחות 300 תמונות. גישה אחרת יכולה להיות להשתמש galvo מהירות גבוהה כדי לסרוק את האור על פני ההיבט מדריך גל קלט בתוך זמן הרכישה בודד, כגון 10-30 ms. אפשרות זו מתאימה ליצירת הדמיה של TIRF בשידור חי, היכן שהאורגלים הסלולאריים בתנועה מתמדת.
מבוסס שבב dסטורם מציע אזור גדול חסר תקדים tirf עירור, מה שהופך אותו אידיאלי מתאים לדימות תפוקה גבוהה. הדמות הקומפקטית מאפשרת התאמה למערכות מסחריות, שם ניתן למקם את השבב למטה עבור הגדרות הפוך או מצעים שקופים ניתן לפתח. האסימונים הם מפוברק המוניים ניתן לשנות כדי להתאים לצרכים רבים. כיום, ההגבלה העיקרית היא שהוא מוגבל ל-2D. שדה אוונקו זמין רק כ 200 ננומטר הרחק משטח המדריך גל, אז רק fluorophores בתוך אזור זה יהיה נרגש. לגמרי, תחום האופטיקה המשולבת מציע הזדמנויות רבות עבור מיקרוסקופ מבוסס שבב בעתיד הקרוב, על ידי התמודדות עם שאלות הדמיה חדשות, כמו גם מתן אפשרויות חדשות הקיימות.

מאז ההפגנה הראשונית של מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת, וריאציות רבות פותחו כדי לפתור אתגרים שונים1,2,3. אתגר אחד שנשאר, עם זאת, הוא שדה גדול של תצוגת dSTORM הדמיה. רבים הגדרות הסערה dלהשתמש בעדשה אובייקטיבית זהה הן להלהיב את המדגם לדמות אותו. על מנת להגדיל את שדה הראייה, יש צורך בעדשת הגדלה נמוכה. הגדלה נמוכה וצמצם מספרי נמוך (NA) עדשות אובייקטיבי בדרך כלל יש עומק גדול של השדה, וכתוצאה מכך אות מחוץ למטוס שיפחית את דיוק הלוקליזציה. יעדי TIRF משמשים בדרך כלל כדי להגדיל את ניגוד התמונה על-ידי הפחתת הזריחה מהמטוס. דרך TIRF, עירור מוגבל עובי אופטי של כ 150 ננומטר מהמשטח באמצעות שדה אוונסי4. עדשות האובייקטיבי tirf דורשים NA גדול וכתוצאה מכך שדה קטן של תצוגה (fov) (g., 50 x 50 יקרומטר2), אשר מגביל את התפוקה באופן משמעותי. עם זאת, ישנן דרכים חלופיות. ליצירת שדה אוונ,
מדריך גל אופטי הוא מבנה אשר להגביל ולהנחות אור אם הוא מצמידים לתוך המבנה. בדרך כלל, מדריכי גל משמשים בתקשורת מבוססת סיבים. נעשה מאמץ גדול כדי לפתח מדריכי גל משולבים דו-ממדית כמרכיב העיקרי של מעגלים משולבים פוטוני. הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה בדיית מדריכי-גל אופטיים בעלי הפסד נמוך מובנים ננו ניתן לעשות באופן שגרתי5. כיום, ניתן להשתמש בכמה המייסדים ברחבי העולם כדי לפתח מעגלים משולבים פוטוני. מדריכי גל מדריך אור באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת גם מציג שדה אוונקו על פני השטח. באמצעות עיצוב קפדני של מבנה מדריך גל, עוצמה גבוהה ניתן להשיג בשדה אוונקו. מדגם הממוקם ישירות על גבי משטח מדריך גל יכול להיות גם מואר על ידי שדה אוונקו עבור יישומי דימות. שדה האוונקו יופק לאורך כל אורכו ורוחבו של מדריך גל, ולכן ניתן לעשות זאת באופן שרירותי וגדול6.
אנו מציגים גישה מקורית לסופת TIRF dהמציעה שדה ראייה גדול באופן שרירותי. במקום להשתמש בעדשת TIRF לעירור ולאיסוף, אנו מלהיבות את השימוש בשדה האוונסי מכיוון מדריכי גל אופטיים. זה decouples את הריגוש ואת מסלול אור האוסף, המאפשר חופש מוחלט לאורך הנתיב אור האוסף מבלי להתפשר על האבטחה האופטית של אורך גל נתון שסופקו על ידי התאורה מדריך גל ההארה. עדשות הגדלה נמוכה יכול ובכך לשמש התמונה אזורים גדולים מאוד במצב TIRF, למרות NA קטן יותר תפחית את הרזולוציה לרוחב. יתר על כן, הדמיה ססגוניות הוא גם מאוד פשוט מאוד באמצעות מדריכי גל7, כמו כמה אורכי גל יכול להיות מונחה ומזוהה מבלי לקרוא את המערכת. זהו יתרון עבור הסערה d, כמו אורכי גל נמוך ניתן להשתמש כדי לשפר fluorophore מהבהב עבור הדמיה ססגוניות. ראוי לציין כי עומק החדירה של שדה האוונ, ישתנה כפונקציה של אורך הגל, למרות שהוא אינו משפיע על אופן הביצוע של הליך ההדמיה. השבב תואם הדמיה תא חי8 והוא אידיאלי עבור יישומים כגון שילוב של microfluidics מיקרופלואידיקה. כל שבב יכול להכיל עשרות מדריכי גל, אשר יכול לאפשר למשתמש לדמות בתנאים שונים או להחיל השמנה אופטית9 ו ספקטרוסקופיית מראמאן10.
המערכת המבוססת על שבב פועלת היטב גם עבור הדמיה מוגבלת וברזולוציה סופר באופן שווה. גישה דומה הוצגה בשנת 2005 באמצעות מנסרה כדי ליצור את עירור השדה האוונבי4. השבב הפוטוני מלהיב גם באמצעות שדה אוונטון, אבל עם טכניקות מודרניות לייצור גל, ניתן ליצור דוגמאות אור אקזוטיות עם מדריכי גל. היישום הננו מבוסס שבב הנוכחי מוגבל הדמיה 2D בלבד, כמו שדה עירור נעול בתוך משטח המדריך גל. פיתוח עתידי יכוון ליישומים תלת-ממדיים. בנוסף, טכניקות ברזולוציה סופר אחרות כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה מפותחים באמצעות אותו מיקרוסקופ שבב מבוסס על-ידי שבבים11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-axis sample stage</td>
			<td>Standa</td>
			<td>7T173-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-axis sample translation stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis NanoMax stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MAX311D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXFM microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red, Life technologies</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom grade swabs</td>
			<td>MRC Technology</td>
			<td>MFS-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-coupled laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>Flamenco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Holder</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Cleaning detergent concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-E0433314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Coupling lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LMPLFLN 50x/0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>Mix according to descriptions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HWV001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Tweezers Type 2W</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGT5051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip

סה כ השתקפות פנימית השתקפויות (TIRF) משמש בדרך כלל מיקרוסקופ יחיד מבוסס לוקליזציה ברזולוציה סופר מיקרוסקופית כפי שהיא מעניקה ניגודיות משופרת עקב הפרדה אופטית. הגישה המקובלת היא להשתמש במיקרוסקופ מספריים גבוהה הצמצם יעדי TIRF עבור עירור ואיסוף, באופן חמור להגביל את שדה התצוגה ואת התפוקה. אנו מציגים גישה מקורית ליצירת עירור TIRF להדמיה עם מדריכי גל אופטיים, המכונים ננוסקופיה המבוססת על שבב. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד הדמיה מבוססת שבב מבוצעת בכיוונון שנבנה כבר. היתרון העיקרי של הננו-מבוססי שבב הוא כי את הריגוש ואת מסלולים אוסף הם ופרדים. הדמיה לאחר מכן ניתן לעשות עם עדשת הגדלה נמוכה, וכתוצאה מכך שדה גדול של תצוגת תמונות TIRF, במחיר של ירידה קטנה ברזולוציה. Sinusoidal הכבד תאים אנדותל (LSECs) היו תמונות באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטית (dסערה), מראה רזולוציה המקבילה מיקרוסקופ סופר ברזולוציה מסורתית. בנוסף, אנו מדגימים את היכולות תפוקה גבוהה על ידי דימות 500 יקרומטר x 500 יקרומטר אזור עם עדשת הגדלה נמוכה, מתן רזולוציה של 76 nm. באמצעות האופי הקומפקטי שלה, הדמיה מבוססי שבב יכול להיות מצויד בתוך מיקרוסקופ הנפוץ ביותר והוא יכול להיות משולב עם טכניקות אופטיות אחרות של שבב, כגון חישת שבב, ספקטרוסקופיה, השמנה אופטית, וכו '. הטכניקה היא אפוא מתאים באופן אידיאלי להדמיה גבוהה 2D ברזולוציה סופר, אבל גם מציע הזדמנויות נהדרות עבור ניתוח רב מודאלי.

מיקרוסקופ TIRF היא טכניקה פופולרית כפי שהיא מסירה החוצה של מטוס פלואורסצנטית, מגביר את הניגודיות ובכך משפר את איכות התמונה, והוא פחות פוטוטוקסילעומת אחרים מבוססי קרינה מיקרוסקופית טכניקות. בהשוואה לגישה המסורתית מבוססת המטרה, שבב מבוסס מיקרוסקופ מציע עירור TIRF ללא תפוקה מוגבלת המלווה בדרך כלל עם עדשת TIRF. סקירה של הכיוונון המוצג ניתן למצוא באיור 1א. אנו מציגים עקיפה מוגבלת, כמו גם הסערה dתמונות של תאים sinusoidal אנדותל כבד (lsec) שחולצו מעכברים. שדה גדול של תמונת השקפה של LSECs עם הmicrotubulin המסומנת גם מוצג, הוכחת את היכולות של הדמיה תפוקה גבוהה. ההתקנה קונבנציונאלי dסערה באמצעות שמן טבילה tirf עדשה (או 60x או 100x ההגדלה) בדרך כלל תמונות באזור של 50 יקרומטר x 50 יקרומטר, אשר 100 פעמים קטן יותר מאשר התמונה מבוסס שבב באיור 2, התמונות עם 25x, 0.8 היעד NA.
בשיטה זו, אנו משתמשים מרובי מוסיביות Si3N4 מדריכי גל עבור עירור. שבבי מנוצל מורכב רצועת-חרוט המנחה שכבה של 150 ננומטר Si3N4 הופקד על 2 יקרומטר שכבה תחמוצת של שבב סיליקון. תרשים סכימטי של השבב ניתן למצוא באיור 1ב. רוחב גל מדריך יכול להשתנות בין 200 ו 1000 μm. ניתן למצוא את פרטי הייצור במקום אחר8. באמצעות הפרעה בין מצבי הפצת האור עירור לא תהיה התפלגות עוצמה הומוגנית, אלא דפוס משתנה מרחב. איור 2A מציג תמונה עם דפוסים ברורים של מצב גלוי. תבנית הפרעה זו תשתנה בהתאם למיקום קרן הלייזר בקצה מדריך הגל. על מנת להשיג עירור הומוגנית בתמונות הסופיות, אנו משתמשים בשלב piezo כדי נדנוד לאורך ההיבט מצמידים. במהלך תהליך הדימות, מספיק וריאציה של דפוסי ההפרעות קיימים, כך שניתן יהיה להגיע לממוצע, תוך הסרת תנודות בעוצמה בתמונה. מחסנית התמונה תכלול מספר תמונות כגון באיור 2A, אם כי עם דפוסים שונים, אך כאשר ממוצעים, המחסנית תניב תמונה עם עירור הומוגנית כגון איור 2ב. גישה חלופית היא להשתמש בהחדקות מתיקות כדי להשיג רחב, מדריך גל יחיד מודגש8,14, אשר מסיר את הצורך במצב ממוצע. עם זאת, מספר מילימטרים של אורך הזמן הכרחי כדי לשמור על תנאי במצב אחד כדי להשיג רוחב מדריך 100 יקרומטר גל. מדריכים גל רב-מוכווני לעקוף את הצורך המלא לעשות ולהשאיר הגבלות על רוחב המבנה. מעבר לתבנית התאורה, מדד השבירה היעיל ביותר של המצבים מאפשר אפשרויות חסרות תקדים לקראת מיקרוסקופ תאורה מובנה מיקרוסקופיה מובנית11 ותנודות7.
הצעד הראשון בהדמיה הוא לאסוף תמונה מוגבלת עקיפה. הניסוי התוצאות בערימה של סביב 300 תמונות והתמונה הסופית מיוצר על ידי לקיחת ממוצע של המחסנית. באיור 2, אנו מציגים עקיפה מוגבלת והדמייתסופת הסערה של lsecs מתויג עם cellmask אדום עמוק באמצעות 60X, 1.2 NA מטרת טבילה מים. איור 2מראה התאורה הומוגנית נגרמת על ידי ממוצע במצב לא מספיק. חישוב ממוצע במצב מוצלח מוצג באיור 2B. איור 2ג הוא תמונת סערה dשל אותו אזור, עם האזור המסומן המוצג באיור 2ד. בתאי הכבד sinusoidal אנדותל יש נקבוביות ננו בגודל בקרום פלזמה15, אשר ניתן לראות כאן. מתאם הטבעת פורייה לניתוח סיפק רזולוציה של 46 ננומטר.
איור 3 מציג תמונה הסערה dשל 500 יקרומטר x 500 יקרומטר אזור, הדגמת יכולות תפוקה גבוהה של הטכניקה. תמונה מוגדלת של איור 3A, המתאים לשדה הסערה האופייני d-of-view, מוצג יחד עם תמונה מוגבלת עקיפה באיור 3ב. טבעת פורייה מתאם להערכת ההחלטה בוצעה, מניב ערך של 76 ננומטר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> איור 1: מערכת הדמיה ומדריך גל. (א) תצלום של מערכת ההדמיה. המדגם ממוקם על צ ' אק ואקום על הבמה לדוגמה, עם פן צימוד של מדריך גל לקראת המטרה צימוד. סיבים מצמידים לייזר מטרה צימוד ממוקם על גבי הבמה piezo 3D. עדשה צריח עם עדשות הדמיה לוכדת את התמונה מלמעלה ומעביר אותו למצלמה. (ב) סכמטי של מדריך גל עם עדשות הדמיה וצימוד. הצמד העדשות אור לתוך מדריך גל. הדגימות (חרוזים כתומים) נשמרות בתוך תא PDMS אטום. שדה אוונקו לאורך מדריך גל יהיה להלהיב את המדגם ואת מטרת ההדמיה ללכוד את הזריחה הנפלטת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> איור 2: עקיפה-תמונות סערה מוגבלת ו -d. (A) התמונה של תאים sinusoidal אנדותל הכבד עם ממוצע במצב מספיק, וכתוצאה מכך ברור לעין התבנית עירור. (ב) אותו אזור כמו ב (א), אך עם מצב מספיק ממוצע, והתוצאה היא עירור הומוגנית. (ג) עקיפה תמונה מוגבלת של הכניסה פנימה (ב); (D) הסערה התמונה של האזור אותו. (ה) הזחה של (ד), בבירור מראה את הפנומנות בקרום הפלזמה של התא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> איור 3: הסערה dתמונה של החולדה lsecs. (א) שדה גדול של השקפההסערה של התמונה של אלקסה 647 מוכתם טובולין ב החולדה lsecs. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב) אזור מסומן גדול מ (א) השוואת עקיפה-מוגבלת (משמאל למטה) ו -dהסערה (למעלה מימין). (ג) אזור קטן יותר המסומן מ-(א). סרגל קנה מידה = 1 μm. התמונה יש רזולוציה של 76 ננומטר. מותאם להיתר מ-Helle et al. 20196. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.

כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

המטרה העיקרית של כתב יד זה היא להציג הליך הדמיה של מיקרוסקופיה TIRF מבוססת שבב פוטונית שפותחה לאחרונה ומיקרוסקופיה לוקליזציה של מולקולה אחת, כגון dSTORM. המרכיב העיקרי כאן הוא השבב הפוטוני כי הם עשויים מסדרה של waveguide אופטי. האור בתוך הגל האופטי מונחה על סמך השתקפות פנימית מוחלטת.חלק מהאור קיים על פני השטח בצורה של הגלים האוונסנטים. הגלים האוונסנטים האלה, הם נרקבים באופן אקספוננציאלי מפני השטח, עם עומק חדירה של כמה מאות ננומטרים. זה הופך אותם מתאימים לתאורת TIRF.תאורת TIRF באמצעות הגל האופטי זמינה על פני שטח גדול במיוחד, המוגדר על ידי הגיאומטריה של waveguide, ולכן מתאים באופן אידיאלי להדמיית תפוקה גבוהה. ההבדל העיקרי בין הגדרת TIRF ו- dSTORM מסורתית בהשוואה לגישה שלנו הוא שאנו משתמשים בשבב פוטוני כדי להאיר את המדגם, במקום לשלוח אור דרך עדשה אובייקטיבית הדמיה. הגישה שלנו מפענחת את התאורה ואת חלק האור הקולקציה, פותחת אפשרויות הדמיה חדשות.מניחים את השבב בצלחת פטרי זכוכית באמצעות פינצטה וופל, ומכסים לחלוטין עם פתרון 1% Hellmanex. מניחים את צלחת פטרי על לוחית חמה ב 70 מעלות במשך 10 דקות. בעוד עדיין על המשטח החם, לשפשף את פני השטח עם ספוגית רקמת חדר נקי.מוציאים את השבב מצלחת פטרי. יש לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של מים מיונים. לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של isopropanol, דואג כי הממס אינו מתייבש על פני השטח כדי למנוע כתמי אידוי.יש לשטוף עם לפחות 100 מיליליטר של מים מיונים. לפוצץ את השבב יבש עם אקדח חנקן. הכינו PDMS מאוחר יותר של 150 מיקרומטר על ידי סיבובו בצלחת פטרי.השתמש אזמל לחתוך מסגרת כ 1.5 על 1.5 ס"מ משכבת PDMS. הרם את המסגרת מצלחת פטרי עם פינצטה. הפקידו אותו שטוח על שבב נקי ומלוטש.הדגימה מוכנה כעת לזרועי תאים. לאחר זריעת התא, הסר את השבב מהמדיה. השתמש בצינור כדי להסיר נוזל עודף מחוץ לתא PDMS.הסר את הנוזל הנוכחי מתוך תא PDMS עם צינור תוך הוספת כ 60 microliters לנקות PBS באותו זמן. החלף את PBS עם 60 microliters לנקות PBS, ולתת לו דגירה במשך דקה אחת. חזור על השלב הקודם, ומאפשר לו לדגר במשך חמש דקות הפעם.הסר את PBS, ולהחליף אותו עם 60 microliters של פתרון הצבע. השאירו את הדגימה כדי דגירה במשך כ 15 דקות, מגן אותו מפני אור. לשטוף את המדגם עם PBS באמצעות ההליך שתואר קודם לכן.הסר את ה- PBS והחלף אותו ב- 40 מיקרוליטרים של מאגר ההדמיה בו-זמנית. מניחים כיסוי על גבי, מניעת בועות אוויר להיווצר מתחת. לחץ בעדינות על הכיסוי כנגד תא ההדמיה כדי להסיר כל מדיה עודפת.השתמש בצינור כדי להסיר מדיה עודפת מחוץ לכיסוי. נקו את האזור שמחוץ לכיסוי בעזרת ספוגית לחה במים כדי להימנע מקריסטלים שנוצרו על ידי שאריות מדיה מיובשות. גירסה זו של ההתקנה מורכבת משלושה רכיבים עיקריים.המיקרוסקופ עם מחזיק המסנן, מקור האור הלבן, המצלמה ואקדח אובייקטיבי. שלב הצימוד, שהוא שלב פייזו תלת-צירי, עם לייזר מזוג סיבים ועדשת צימוד. שלב הדגימה, שהוא שלב ידני חד-צירי, עם קצה והטיה, עם מחזיק ואקום.הן שלב הצימוד והן שלב הדגימה מותקנים על במה ממונעת דו-צירית לתרגום לדוגמה. מניחים את השבב על משאית הוואקום, עם היבט הצימוד לכיוון מטרת הצימוד. ודא השבב הוא כ אורך מוקד אחד מן המטרה צימוד.תפעיל את משאבת הוואקום. הפעל את הלייזר למילי וואט אחד. התאימו בערך את גובה השבב כך שהקרן תפגע בקצהו.כבה את הלייזר. הפעל את מקור האור הלבן. בחר עדשת מטרה להגדלה נמוכה, לדוגמה, 10x.מקד את המיקרוסקופ על גל. תרגם את המיקרוסקופ לאורך הגל כדי לראות אם הוא מיושר היטב עם הנתיב האופטי. הזיזו את המיקרוסקופ לקצה הצימוד.הפעל את הלייזר במילי וואט אחד או פחות. תרגם את המיקרוסקופ לאורך קצה הצימוד כדי למצוא את אור הלייזר. תמקד את הקרן בקצה השבב.כוונן את שלב הצימוד לאורך הנתיב האופטי בכיוון המקטין את גודל נקודת קרן הלייזר עד שהוא נעלם. הקרן נמצאת כעת מעל או מתחת לפני השטח של השבב. כוונן את גובה שלב הצימוד עד שמקום הקרן יופיע שוב ויגדל.חזור על שני השלבים הקודמים עד שהלייזר יוצר נקודה ממוקדת. העבר את הנקודה הממוקדת לגל ההתעניינות. תרגם את המיקרוסקופ במרחק קצר מהקצה כך שמקום הקרן הממוקד לא יהיה גלוי עוד.כבה את האור הלבן. התאם את החדות. אם הגל מנחה, האור המפוזר לאורך הגל צריך להיות גלוי בבירור.התאימו את ציר שלב הצימוד כדי למקסם את עוצמת האור המפוזרת. כבה את הלייזר. תדליק את האור הלבן.התאם את החדות במידת הצורך. נווט אל אזור הדימות. פוקוס עם המטרה הרצויה לדמיין.כבה את האור הלבן. הכנס את מסנן הפלואורסצנטיות והפוך את כוח הלייזר למילי-וואט אחד. הגדר את זמן החשיפה למצלמה לכ- 100 אלפיות שניה.התאם את החדות לפי הצורך. ודא שההתדוג עדיין ממוטב. אתר אזור מעניין להדמיה.הפעל את לולאת שלב הפיזו כדי לממוצע צמתים. לכוד לפחות 300 תמונות. טען את מחסנית התמונות שנלכדה לפיג'י באמצעות מחסנית וירטואלית.מתפריט התמונה בפיג'י, בחר ערימות ו- Z Project. חשב את תמונת TIRF על-ידי בחירה בסוג הקרנה, בעוצמה ממוצעת. הפעל את הלייזר למילי-וואט אחד והגדר את זמן החשיפה למצלמה ל- 30 אלפיות שניה.התאם את החדות והמיקוד. הגדל את כוח הלייזר עד מהבהב הוא ציין. הגדל אזור קטן של הדוגמה.התאם את החדות. לכוד כמה תמונות כדי לראות אם ההבהובים מופרדים היטב. כוונן את זמן החשיפה למצלמה להבהוב אופטימלי.הפעל את לולאת הבמה של הפיזו. הקלט ערימת תמונות של 30,000 מסגרות לפחות, בהתאם לצפיפות המהבהבה. פתח את פיג'י וטען את מחסנית dSTORM כתמונות וירטואליות.התאם את החדות במידת הצורך. השתמש בכלי המלבן כדי לבחור את האזור שברצונך לבנות מחדש. פתח את ניתוח Run בתוסף ThunderSTORM בפיג'י.קבעו את הגדרות המצלמה הבסיסיות ב-ThunderSTORM, המתאימות למכשיר שלכם. פרמטרי ברירת המחדל הנותרים הם בדרך כלל משביעי רצון. תתחיל את השחזור.רשימת ההתאמה לוקליזציה המסופקת על-ידי תוכנת השחזור מסוננת כדי להסיר לוקליזציה לא ספציפית. תיקון דריפט נוסף מוחל במידת הצורך. ההבדל העיקרי בין הדמיה מבוססת שבב לבין הדמיה מסורתית הוא המכשור ורכישת הנתונים.לפיכך, ניתן להעריך את איכות התמונות המשוחזרות באותו אופן כמו תמונה ממיקרוסקופ מסחרי ברזולוציית-על. מאז נעשה שימוש ברוגידים מרובי מצבים, התמונה המתקבלת עשויה, עם זאת, להפגין בעירור לא אנושי אם נאספות מעט מדי תמונות. אפשרות זו מוצגת בלוח א'.הגדלת כמות דפוסי העירור אמורה לגרום לזרזר inhomogeneous, כפי שמוצג בלוח b. כאן יש לנו תא אנדותל סינוזואידי כבד, עם קרום פלזמה שכותרתו פלואורסצנטי. חלוניות a ו- b הן תמונות מוגבלות בעיוון.חלונית c מציגה תמונה מוגבלת דיפוזיה של ההצבה בחלונית b. חלונית d מציגה תמונת dSTORM של אותו אזור. תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד יש fenestrations בגודל ננו בקרום הפלזמה שלהם, אשר נראים בבירור בתמונה סופר רזולוציה בפאנל d.אחד היתרונות העיקריים של הדמיה מבוססת שבב ברזולוציית-על הוא שדה הצפייה הגדול שניתן להשגה. פאנל a מראה 500 מיקרון על ידי 500 מיקרון גדול dSTORM תמונה של תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד עם microtubulin שכותרתו פלואורסצנטי. חלונית b מציגה את ערכת ה- magenta מהחלונית a, עם תמונות עם רזולוציית דיפוזיה מוגבלת ותמונות ברזולוציית-על להשוואה.לוח c מציג את ההסטה הירוקה מהחלונית a. הרזולוציה של התמונה שנתפסה היא 77 ננומטר. בסרטון זה, ביצענו שדה גדול של תצוגה TIRF ו dSTORM הדמיה של תאי אנדותל סינוזואידיים בכבד באמצעות שבב פוטוני להארה.השיטה שלנו פחות מורכבת, קומפקטית וגמישה יותר מהדרך המקובלת לביצוע TIRF באמצעות מטרת מיקרוסקופ של צמצם מספרי קבוע מראש ושדה תצוגה נמוך. מיקרוסקופ לוקליזציה, כגון dSTORM, היא אחת מכמה טכניקות הדמיה ברזולוציית-על שחקרנו באמצעות שבב פוטוני. לדוגמה, אור יכול להיות מוגבל הרבה יותר בחוזקה בתוך חומר גל אופטי אינדקס שבירה גבוהה מאשר זה אפשרי באמצעות עדשה אובייקטיבית הדמיה.מאפיין זה של תאורת שבבים מצא יישום בהגברת הרזולוציה של שיטת מיקרוסקופיה אופטית מבוססת תנודות אינטנסיביות ומיקרוסקופיה מובנית של תאורה. בנוסף, שבבים פוטוני גם נהנה מזעור, עלות תועלת, התקנה אופטית פשוטה. להיות טכנולוגיה משולבת עושה את זה תואם עם פונקציות אופטיות אחרות על השבב.בסך הכל, זה מאפשר retrofitting לתוך מיקרוסקופים מוגבלים diffraction קונבנציונאלי, המאפשר רזולוציה סופר על חשבון נמוך.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

השתקפות הפרעה סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת להדמיה מיקרוטובולים דינמיים וחלבונים נלווים

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...