Name: high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

Gli autori desiderano riconoscere il Consiglio europeo della ricerca (concedere il numero 336716 a B.S.A.). Gli autori desiderano anche ringraziare Irati Lagfragua per la sua preziosa assistenza nella registrazione e nell'editing del video.

1. Preparazione dello strato polidimetiloxana (PDMS)
<ol><li>Preparare un mix 10:1 di Sylgard 184 monomero e agente di cura.</li>
	<li>Mettere il composto in una camera a vuoto fino a quando le bolle d'aria non sono sparite.</li>
	<li>Versare 1,7 g di miscela PDMS al centro di una parabola Petri da 3,5 pollici (diametro).</li>
	<li>Posizionare il piatto Petri sul mandrino a vuoto di un rivestimento di spin.</li>
	<li>Cappotto Petri per 20 s a 900 giri/min, con un'accelerazione di 75 giri/s.</li>
	<li>Curare il piatto su una piastra calda a 50 gradi centigradi per almeno 2 h.</li>
</ol>2. Preparazione del campione
<ol><li>
Pulizia Waveguide
	<ol>
<li>Preparare 100 mL di una diluizione dell'1% del concentrato detergente per la pulizia (Tabella dei materiali)in acqua deionizzata (DI).</li>
		<li>Mettere il chip in una piastra di vetro Petri utilizzando una pinzetta di wafer e coprire completamente con la soluzione detergente.</li>
		<li>Disporre il piatto Petri su un piatto caldo a 70 gradi centigradi per 10 min.</li>
		<li>Mentre ancora sulla piastra calda, strofinare la superficie con un tampone di tessuto di pulizia.</li>
		<li>Togliere il chip dalla parabola Petri. Risciacquare con almeno 100 mL di acqua DI.</li>
		<li>Risciacquare con almeno 100 mL di isopropanolo, facendo attenzione che il solvente non si asciughi sulla superficie per evitare macchie di evaporazione.</li>
		<li>Risciacquare con almeno 100 mL di acqua DI. Soffia il chip a secco con una pistola ad azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della camera
	<ol>
<li>Preparare uno strato di 150 m poliditilsiloxane (PDMS) in un piatto di Petri (sezione 1).</li>
		<li>Utilizzare un bisturi per tagliare un telaio di 1,5 cm x 1,5 cm dallo strato PDMS.</li>
		<li>Sollevare il telaio dal piatto Petri con una pinzetta. Depositarlo piatto su un chip pulito e lucido. Il campione è ora pronto per il seeding delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etichettatura fluorescente
	<ol>
<li>Preparare le seguenti sostanze chimiche: soluzione salina tampone fosfata, soluzione di tintura, dbuffer di imaging STORM.</li>
		<li>Dopo il seeding delle cellule, rimuovere il chip dal supporto.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali fluidi in eccesso dall'esterno della camera PDMS.</li>
		<li>Rimuovere il liquido corrente dall'interno della camera PDMS con una pipetta aggiungendo allo stesso tempo circa 60-L di PBS pulito. NOTA: l'importo aggiunto alla camera dovrà essere modificato in base alle dimensioni della camera. Fare attenzione a non rimuovere tutti i supporti dalla superficie cellulare.</li>
		<li>Sostituire il PBS con 60 gradi di PBS pulito e lasciarlo incubare per 1 min.</li>
		<li>Ripetere il passaggio precedente, lasciandolo incubare per 5 min questa volta.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e sostituirlo con 60 gradi della soluzione di tintura. Lasciare il campione inincubare per circa 15 minuti, proteggendolo dalla luce. NOTA: questo passaggio potrebbe dover cambiare in modo significativo, a seconda del tinrito fluorescente utilizzato. Usiamo CellMask Deep Red per etichettare la membrana cellulare per questo esperimento</li>
		<li>Lavare l'esempio con PBS come nei passaggi 2.3.3-2.3.5.</li>
		<li>Rimuovere il PBS e sostituirlo contemporaneamente con 40 gradi di l del buffer di imaging. NOTA: Esistono diversi buffer di imaging per diversi coloranti fluorescenti.</li>
		<li>Posizionare un coperchio sulla parte superiore, evitando la formazione di bolle d'aria sotto. Premere delicatamente il coperchio sulla camera di imaging per rimuovere eventuali supporti in eccesso.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali supporti in eccesso al di fuori del coperchio. Pulire l'area esterna al coperchio con un tampone umido d'acqua per evitare cristalli formati da residui di supporti a immersione essiccata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedura di imaging
<ol><li>Impostazione dei componenti NOTA: Questa versione dell'installazione è costituita da tre componenti principali: il microscopio, la fase di accoppiamento e lo stadio di campionamento. Vedere la Tabella dei materiali.<ol>
<li>Utilizzare un microscopio con un supporto di filtro, una fonte di luce bianca, una fotocamera e un revolver obiettivo.</li>
		<li>Utilizzare una fase di accoppiamento piezo a 3 assi con un laser accoppiato in fibra e una lente di accoppiamento.</li>
		<li>Utilizzare uno stage campione manuale a un asse con punta e inclinazione e un supporto sottovuoto.</li>
		<li>Montare sia l'accoppiamento che la fase campione su una fase motorizzata a 2 assi per la traslazione campione.</li>
	</ol></li>
	<li>Accoppiamento Waveguide
	<ol>
<li>Posizionare il chip sul mandrino a vuoto con la sfaccettatura di accoppiamento verso l'obiettivo di accoppiamento. Assicurarsi che il chip si trova approssimativamente di una lunghezza focale rispetto all'obiettivo di accoppiamento.</li>
		<li>Accendere la pompa a vuoto.</li>
		<li>Accendere il laser a 1 mW. Regolare approssimativamente l'altezza del chip in modo che il fascio colpisca il bordo di esso. Spegni il laser.</li>
		<li>Accendere la sorgente di luce bianca. Scegliere una lente obiettivo a basso ingrandimento (ad es. 10x). Concentrare il microscopio su una guida d'onda.</li>
		<li>Traduci il microscopio lungo la guida d'onda per vedere se è ben allineato con il percorso ottico. Spostare il microscopio sul bordo di accoppiamento.</li>
		<li>Accendere il laser a 1 mW o meno. Traduci il microscopio lungo il bordo di accoppiamento per trovare la luce laser. Mettere a fuoco il fascio sul bordo del chip.</li>
		<li>Regolare la fase di accoppiamento lungo il percorso ottico nella direzione che riduce la dimensione del punto del raggio laser fino a scomparire. Il fascio è ora sopra o sotto la superficie del chip.</li>
		<li>Regolare l'altezza della fase di accoppiamento fino a quando il punto del fascio riappare e non viene ingrandito.</li>
		<li>Ripetere i due passaggi precedenti fino a formare un punto focale.</li>
		<li>Spostare il punto focale sulla guida d'onda di interesse.</li>
		<li>Trasla il microscopio a breve distanza dal bordo in modo che il punto del fascio a fuoco non sia più visibile. Spegnere la luce bianca.</li>
		<li>Regolare il contrasto. Se la guida d'onda sta guidando, la luce diffusa lungo la guida d'onda dovrebbe essere chiaramente visibile.</li>
		<li>Regolare gli assi della fase di accoppiamento per massimizzare l'intensità della luce diffusa. Spegni il laser.</li>
		<li>Accendere la luce bianca. Regolare il contrasto se necessario.</li>
		<li>Passare alla regione di imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging limitato alla diffrazione
	<ol>
<li>Concentrarsi sull'obiettivo di imaging desiderato. Spegnere la luce bianca.</li>
		<li>Inserire il filtro a fluorescenza e ruotare la potenza laser a 1 mW.</li>
		<li>Impostare il tempo di esposizione della fotocamera a circa 100 ms. Regolare il contrasto in base alle esigenze. Assicurarsi che l'accoppiamento sia ancora ottimizzato.</li>
		<li>Individuare una regione di interesse per l'imaging. Attivare lo stage piezo looping per modalità di media. NOTA: la gamma di scansione di 20 m con una dimensione di passo di 50 nm è adatta per la maggior parte delle strutture di guida d'onda.</li>
		<li>Cattura almeno 300 immagini.</li>
		<li>Caricare la pila di immagini acquisita in Fiji utilizzando una pila virtuale. Dal menu immagine in Figi, scegliete Stack e progetto z.</li>
		<li>Calcolare l'immagine TIRF scegliendo il tipo di proiezione intensità media.</li>
	</ol></li>
	<li>d Imaging Tempestoso
	<ol>
<li>Accendere il laser a 1 mW e impostare il tempo di esposizione della fotocamera a 30 ms.</li>
		<li>Regolare il contrasto e la messa a fuoco.</li>
		<li>Aumentare la potenza del laser fino a quando non si osserva un lampeggiamento. NOTA: l'operazione potrebbe richiedere un po' di tempo, a seconda dell'intensità del campo evanescente.</li>
		<li>Ingrandire una piccola area del campione.</li>
		<li>Regolare il contrasto.</li>
		<li>Cattura alcune immagini per vedere se i lampeggi sono ben separati.</li>
		<li>Regolare il tempo di esposizione della fotocamera per lampeggiare ottimalmente. NOTA: L'ottimizzazione delle palpebre è un compito complesso, ma è disponibile un sacco di letteratura adatta12.</li>
		<li>Attivare il ciclo dello stadio piezo.</li>
		<li>Registrate una pila di immagini di almeno 30.000 fotogrammi, a seconda della densità lampeggiante.</li>
	</ol></li>
	<li>d Ricostruzione dell'immagine STORM
	<ol>
<li>Aprire Fiji e caricare lo stack dSTORM come immagini virtuali.</li>
		<li>Regolare il contrasto, se necessario.</li>
		<li>Utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare l'area da ricostruire.</li>
		<li>Apri l'analisi di Run nel plugin Thunderstorm13 in Fiji.</li>
		<li>Impostare le impostazioni di base della fotocamera in Thunderstorm corrispondente al dispositivo. I restanti parametri predefiniti sono in genere soddisfacenti.</li>
		<li>Inizia la ricostruzione. NOTA: per l'intero campo visivo, potrebbe essere necessario dividere i dati in sottostack, a causa delle dimensioni del file di grandi dimensioni.</li>
		<li>Filtrare l'elenco di localizzazione fornito dal software di ricostruzione per rimuovere le localizzazioni non specifiche. Apple un'ulteriore deriva-correzione, se necessario.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Wazawa, T., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+single+molecule+nanobioscience.">Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).</li><li>Jalali, B., Fathpour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+photonics.">Silicon photonics.</a> Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).</li><li>Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., &#216;ie, C. I., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+on-a-chip:+super-resolution+imaging+on+the+millimeter+scale.">Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale.</a> Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).</li><li>Diekmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+wide+field-of-view+nanoscopy.">Chip-based wide field-of-view nanoscopy.</a> Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).</li><li>Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. 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(79), (2013).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waveguide-PAINT+offers+an+open+platform+for+large+field-of-view+super-resolution+imaging.">Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).</li></ol>

B.S. Ahluwalia ha richiesto il brevetto GB1606268.9 per la nanoscopia ottica basata su chip. Gli altri autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

L'imaging basato su chip è simile all'imaging dSTORM convenzionale. La qualità dell'immagine può quindi essere misurata utilizzando gli stessi approcci dell'imaging dSTORM tradizionale. La differenza principale per l'utente è che la diapositiva di vetro trasparente viene scambiato con un Si-wafer opaco. Anche se appaiono molto diversi, la manipolazione del campione è praticamente analoga a uno scivolo di vetro. I chip sono abbastanza robusti e possono essere facilmente maneggiati utilizzando una pinzetta di wafer. La procedura di imaging e la ricostruzione dell'immagine sono le stesse di un normale esperimento dSTORM. La configurazione di un microscopio funzionale basato su chip non richiede componenti speciali, ad eccezione dei chip fotonici. Ulteriori dettagli del set-up possono essere trovati nel lavoro precedente6,7. I chip utilizzati in questo lavoro sono stati fabbricati utilizzando la fotolitografia standard8.
La preparazione del campione comprende la preparazione della camera campione. Quando si collega il telaio PDMS al chip, è fondamentale evitare piccole pieghe o strappi in cui potrebbe entrare l'aria. Se il PDMS si piega quando lo si attacca, è sufficiente rimuoverlo con attenzione con una pinzetta e riattaccarlo. Quando il campione è pronto all'interno della camera PDMS, la copertura deve essere premuta contro di esso, sigillando la regione. È importante evitare eventuali bolle d'aria che potrebbero formarsi quando si attacca la copertura. Se si forma una bolla d'aria, rimuovere delicatamente la copertura e aggiungere PBS alla camera campione per assicurarsi che il campione sia coperto. La preparazione e l'attaccamento dello slittamento di copertura possono quindi essere semplicemente rifatti.
L'accoppiamento della luce nella guida d'onda viene semplificato utilizzando il protocollo proposto in questo documento. Ci sono, tuttavia, alcune sfide comuni che possono limitare l'accoppiamento. In primo luogo, se il chip non è stato pulito correttamente e qualsiasi PBX residuo rimosso completamente, ci potrebbe essere sporcizia o PBS cristallizzato sulla guida d'onda. Questo può introdurre perdite importanti, con conseguente scarsa potenza nella regione di imaging. L'utilizzo di un tampone umido per pulire la regione al di fuori del vetro di copertura può migliorare significativamente la potenza. In secondo luogo, se l'aspetto di accoppiamento della guida d'onda è danneggiato (ad esempio, da una manipolazione impropria), la perdita di accoppiamento può aumentare drasticamente. L'ispezione ottica del bordo di solito rivela facilmente eventuali danni. L'intera sfaccettatura di accoppiamento del chip può essere lucidata con attenzione, proprio come una fibra ottica, e darà una sfaccettatura di accoppiamento liscia, che poi aumenta la potenza accoppiata.
Dopo che la luce è stata accoppiata, la procedura di imaging è la stessa di qualsiasi configurazione dSTORM convenzionale. Se l'immagine ha un'eccitazione omogenea, come illustrato nella Figura 2A, molto probabilmente la modalità media non ha funzionato bene. Le due ragioni più comuni per questo sono: 1) troppo poche immagini catturate per creare una pila media e 2) troppo breve di una distanza oscillazione / troppo grande di una dimensione di passo. Raccogliere troppo poche immagini può tralasciare alcuni modelli di eccitazione e la media sarà quindi inomogenea. Questo può essere facilmente risolto aumentando il numero di immagini nella pila media. Una distanza di oscillazione troppo breve può anche causare un'immagine inomogenea, in quanto non abbastanza modelli di modalità sono eccitati. Questo può anche essere facilmente risolto aumentando la distanza di oscillazione e / o diminuendo la dimensione del passo. In questo lavoro abbiamo usato uno stadio piezo per scansionare il raggio laser di ingresso oltre 20 m e acquisire almeno 300 immagini. Un altro approccio potrebbe essere quello di utilizzare galvo-mirror ad alta velocità per eseguire la scansione della luce attraverso la sfaccettatura della guida d'onda di ingresso entro un singolo tempo di acquisizione, ad esempio 10-30 ms. Questa opzione è adatta per l'imaging TIRF a cellule vive, dove gli organelli subcellulari sono in costante movimento.
DSTORM, basato su chip, offre un'eccitazione TIRF ad ampia area senza precedenti, che la rende ideale per l'imaging ad alta velocità effettiva. Il carattere compatto consente l'ammodernamento ai sistemi commerciali, in cui il chip può essere posizionato a testa in giù per configurazioni invertite o substrati trasparenti. I trucioli sono fabbricati in massa e possono essere modificati per soddisfare molte esigenze. Attualmente, la restrizione principale è che è limitato a 2D. Il campo evanescente è disponibile solo a circa 200 nm dalla superficie della guida d'onda, quindi solo i fluorofori all'interno di questa regione saranno entusiasti. Complessivamente, il campo dell'ottica integrata offre molte opportunità per la microscopia basata su chip nel prossimo futuro, affrontando nuove domande di imaging e fornendo nuove possibilità a quelle esistenti.

Dalla dimostrazione iniziale della microscopia di localizzazione a singola molecola, molte variazioni sono state sviluppate per risolvere diverse sfide1,2,3. Una sfida che è rimasta, tuttavia, è l'imaging dSTORM di ampio campo visivo. Molte configurazioni dSTORM utilizzano la stessa lente obiettivo sia per eccitare il campione che per immaginarlo. Per aumentare il campo visivo, è necessaria una lente di ingrandimento bassa. Le lenti obiettive a bassa ingrandimento e bassa apertura numerica (NA) hanno in genere una grande profondità di campo, con un conseguente aumento del segnale fuori dal piano che ridurrà la precisione di localizzazione. Gli obiettivi TIRF sono comunemente utilizzati per aumentare il contrasto dell'immagine riducendo la fluorescenza fuori dal piano. Attraverso TIRF, l'eccitazione è limitata a uno spessore ottico di circa 150 nm dalla superficie per mezzo di un campo evanescente4. Le lenti obiettivo TIRF richiedono una grande NA che si traduca in un piccolo campo visivo (FOV) (ad esempio, 50 x 50 m2), che limita significativamente la velocità effettiva. Esistono, tuttavia, modi alternativi per generare un campo evanescente.
Una guida d'onda ottica è una struttura che confina e guida la luce se viene accoppiata nella struttura. Più comunemente, guide d'onda sono utilizzati in telecomunicazioni a base di fibra. Grande sforzo è stato fatto al fine di sviluppare guide d'onda integrate 2D come componente principale dei circuiti integrati fotonici. La tecnologia è avanzata a un punto in cui la fabbricazione di guide d'onda ottiche nanostrutturate a bassa perdita può essere regolarmente eseguita5. Oggi, diverse fonderie in tutto il mondo possono essere utilizzate per sviluppare circuiti integrati fotonici. Le guide antionde guidano la luce attraverso la riflettanza interna totale che mostra anche un campo evanescente in superficie. Con un'attenta progettazione della struttura della guida d'onda, si può ottenere un'alta intensità nel campo evanescente. Un campione posizionato direttamente sopra la superficie della guida d'onda può quindi essere illuminato anche dal campo evanescente per applicazioni di imaging. Il campo evanescente sarà generato lungo l'intera lunghezza e larghezza della guida d'onda, e quindi può essere reso arbitrariamente grande6.
Vi presentiamo un nuovo approccio a TIRF dSTORM che offre un campo visivo arbitrariamente ampio. Invece di usare una lente TIRF sia per l'eccitazione che per la raccolta, entusiasmiamo usando il campo evanescente delle guide d'onda ottiche. Questo disaccoppia il percorso di luce di eccitazione e raccolta, consentendo la totale libertà lungo il percorso di luce di raccolta senza compromettere la sezionamento ottico per una determinata lunghezza d'onda fornita dall'illuminazione del chip guida d'onda. Le lenti a basso ingrandimento possono quindi essere utilizzate per l'immagine di regioni molto grandi in modalità TIRF, anche se una NA più piccola ridurrà la risoluzione laterale. Inoltre, l'imaging multicolore è anche notevolmente semplificato utilizzando guide d'onda7, in quanto diverse lunghezze d'onda possono essere guidate e rilevate senza riadattare il sistema. Questo è vantaggioso per dSTORM, in quanto le basse lunghezze d'onda possono essere utilizzate per migliorare il fluoroforo lampeggiante e per l'imaging multicolore. Vale la pena notare che la profondità di penetrazione del campo evanescente cambierà in funzione della lunghezza d'onda, anche se non influisce sulle modalità di esecuzione della procedura di imaging. Il chip è compatibile con l'imaging a celle vive8 ed è ideale per applicazioni come l'integrazione della microfluidica. Ogni chip può contenere decine di guide d'onda, che possono consentire all'utente di immagine in condizioni diverse o applicare trapping ottico9 e spettroscopia Raman10.
Il sistema basato su chip funziona altrettanto bene sia per l'imaging con limitazione diffrazione che per l'imaging a super-risoluzione. Un approccio simile è stato introdotto nel 2005 utilizzando un prisma per generare eccitazione sul campo evanescente4 . Il chip fotonico eccita anche attraverso il campo evanescente, ma con le moderne tecniche di fabbricazione della guida d'onda, si possono generare modelli di luce esotici con guide d'onda. L'attuale implementazione della nanoscopia basata su chip è limitata solo all'imaging 2D, poiché il campo di eccitazione è bloccato all'interno della superficie della guida d'onda. Lo sviluppo futuro sarà destinato alle applicazioni 3D. Inoltre, altre tecniche di super-risoluzione come la microscopia ad illuminazione strutturata sono in fase di sviluppo utilizzando lo stesso microscopio basato su chip11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-axis sample stage</td>
			<td>Standa</td>
			<td>7T173-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-axis sample translation stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis NanoMax stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MAX311D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXFM microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red, Life technologies</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom grade swabs</td>
			<td>MRC Technology</td>
			<td>MFS-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-coupled laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>Flamenco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Holder</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Cleaning detergent concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-E0433314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Coupling lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LMPLFLN 50x/0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>Mix according to descriptions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HWV001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Tweezers Type 2W</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGT5051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip

La fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF) è comunemente utilizzata nella microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione a singola molecola in quanto fornisce un contrasto maggiore a causa del sezionamento ottico. L'approccio convenzionale consiste nell'utilizzare obiettivi TIRF al microscopio ad alta apertura numerica sia per l'eccitazione che per la raccolta, limitando gravemente il campo visivo e la velocità effettiva. Vi presentiamo un nuovo approccio per generare eccitazione TIRF per l'imaging con guide d'onda ottiche, chiamato nanoscopia basata su chip. Lo scopo di questo protocollo è dimostrare come l'imaging basato su chip viene eseguita in una configurazione già costruita. Il vantaggio principale della nanoscopia basata su chip è che i percorsi di eccitazione e raccolta sono disaccoppiati. L'imaging può quindi essere fatto con un obiettivo a basso ingrandimento, con conseguente ampio campo visivo immagini TIRF, al prezzo di una piccola riduzione della risoluzione. Le cellule endoteliali sinusoidali del fegato (LSEC) sono state immagini utilizzando una microscopia ottica diretta stocastica (dSTORM), mostrando una risoluzione paragonabile ai tradizionali microscopi a super-risoluzione. Inoltre, dimostriamo le capacità ad alto velocità effettiva esaminando una regione di 500 m x 500 m con un obiettivo a basso ingrandimento, fornendo una risoluzione di 76 nm. Attraverso il suo carattere compatto, l'imaging basato su chip può essere adattato ai microscopi più comuni e può essere combinato con altre tecniche ottiche su chip, come il rilevamento su chip, la spettroscopia, l'intrappolamento ottico, ecc. La tecnica è quindi ideale per l'imaging ad alta velocità di continuità con super-risoluzione 2D, ma offre anche grandi opportunità per l'analisi multimodale.

La microscopia TIRF è una tecnica popolare in quanto rimuove la fluorescenza fuori dal piano, aumenta il contrasto e quindi migliora la qualità dell'immagine, ed è meno fotototossico rispetto ad altre tecniche di microscopia basata sulla fluorescenza. Rispetto al tradizionale approccio basato sugli obiettivi, la microscopia basata su chip offre l'eccitazione TIRF senza la velocità effettiva limitata che di solito è accompagnata da una lente TIRF. Una panoramica della configurazione presentata è disponibile nella Figura 1A. Vi presentiamo immagini diffrazione limitata e STORMdi cellule endoteliali sinusoidali (LSEC) estratte dai topi. Viene inoltre presentato un ampio campo visivo dei LSEC con microtubulina etichettata, dimostrando le capacità dell'imaging ad alta produttività. Una configurazione convenzionale dSTORM utilizzando una lente TIRF ad immersione dell'olio (ingrandimento 60x o 100x) in genere immagini un'area di 50 x 50 m, che è 100 volte più piccola dell'immagine basata su chip nella Figura 2, immagine con un obiettivo 25x, 0.8 NA.
In questo metodo, usiamo multi-moded Si3N4 guide d'onda per l'eccitazione. I chip utilizzati consistono in uno strato guida inciso da 150 nm Si3N4 depositato su uno strato ossidato di 2 m di un chip di silicio. Uno schema del chip può essere trovato in Figura 1B. La larghezza della guida d'onda può variare tra 200 e 1000 m. I dettagli di fabricazione possono essere trovati altrove8. Attraverso l'interferenza tra le modalità di propagazione la luce di eccitazione non avrà una distribuzione omogenea dell'intensità, ma piuttosto un modello spazialmente variabile. Figura 2A presenta un'immagine con modelli di modalità chiaramente visibili. Questo modello di interferenza cambierà con la posizione del raggio laser sul bordo della guida d'onda. Per ottenere un'eccitazione omogenea nelle immagini finali, usiamo uno stadio piezo per oscillare lungo la sfaccettatura accoppiata. Nel corso della procedura di imaging, esiste una variazione sufficiente dei modelli di interferenza in modo che possano essere mediati, rimuovendo le fluttuazioni di intensità nell'immagine. Lo stack di immagini sarà costituito da diverse immagini, ad esempio in Figura 2A, anche se con modelli diversi, ma quando media, la pila produrrà un'immagine con eccitazione omogenea come Figura 2B. Un approccio alternativo consiste nell'utilizzare il tapering adiabatico per ottenere guide d'onda ampie e a moderini8,14, che elimina la necessità di modalità media. Tuttavia, sono necessari diversi millimetri di lunghezza di mantenimento per mantenere la condizione monomodale per ottenere una larghezza di 100 m. Le guide d'onda multi-moded aggirano questa necessità di tapering e non lasciano limiti alla larghezza della struttura. Al di là del modello di illuminazione, l'indice di rifrazione altamente efficace delle modalità consente possibilità senza precedenti verso la microscopia strutturatadell'illuminazione 11 e i metodi di microscopia a fluttuazione7.
Il primo passo nell'imaging è quello di raccogliere un'immagine limitata di diffrazione. L'esperimento si traduce in una pila di circa 300 immagini e l'immagine finale viene realizzata prendendo la media della pila. Nella Figura 2, presentiamo diffrazione limitata e dSTORM imaging di LSEC etichettati con CellMask Deep Red utilizzando un 60x, 1.2 NA obiettivo di immersione dell'acqua. Figura 2A mostra illuminazione omogenea causata da modalità media insufficiente. La media della modalità di esito positivo viene visualizzata nella Figura 2B. Figura 2C è un'immagine dSTORM della stessa regione, con l'area contrassegnata illustrata nella Figura 2D. Le cellule endoteliali endotalidali del fegato hanno pori nano-dimensionali nella membranaplasmatica 15, che possono essere visti qui. Un'analisi di correlazione dell'anello di Fourier ha fornito una risoluzione di 46 nm.
La figura 3 presenta un'immagine dSTORM di una regione di 500 m x 500 m, dimostrando le elevate capacità di throughput della tecnica. Un'immagine ingrandita della figura 3A, corrispondente a un tipico campo di visualizzazione dSTORM, viene presentata insieme all'immagine limitata di diffrazione nella figura 3B. È stata eseguita una correlazione dell'anello di Fourier per stimare la risoluzione, producendo un valore di 76 nm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> Figura 1: Sistema di imaging e guida d'onda. (A) Fotografia del sistema di imaging. Il campione viene posto su un mandrino a vuoto sul palco del campione, con la sfaccettatura dell'accoppiamento della guida d'onda verso l'obiettivo di accoppiamento. Un laser accoppiato in fibra e un obiettivo di accoppiamento è posto sopra uno stadio piezo 3D. Una torretta per lenti con lenti di imaging cattura l'immagine dall'alto e la trasmette a una fotocamera. (B) Schematico della guida d'onda con lenti di accoppiamento e imaging. La lente di accoppiamento accoppia la luce nella guida d'onda. I campioni (perline arancioni) sono conservati all'interno di una camera PDMS sigillata. Il campo evanescente lungo la guida d'onda entiterà il campione e l'obiettivo di imaging catturerà la fluorescenza emessa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> Figura 2: Immagini STORM limitate con diffrazione e dSTORM. (A) Immagine di cellule endoteliali epatiche con media in modalità insufficiente, con conseguente modello di eccitazione chiaramente visibile. (B) La stessa regione di (A), ma con una media di modalità sufficiente, con conseguente eccitazione omogenea. (C) Diffrazione immagine limitata dell'inset to (B); (D) dSTORM della stessa regione. (E) Inset di (D), mostrando chiaramente le fenestrazioni nella membrana plasmatica della cellula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> Figura 3: dimmagine STORM di LSEC ratto. (A) Grande campo visivo della tubulina macchiata di Alexa 647 nei LSEC di ratto. Barra di scala - 50 m. (B) Più grande regione marcata da (A) confrontando la diffrazione limitata (in basso a sinistra) e l'immagine dSTORM (in alto a destra). (C) Area contrassegnata più piccola da (A). Barra della scala: 1 m. L'immagine ha una risoluzione di 76 nm. Adattato con il permesso di Helle et al. 20196. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

La microscopia ottica a super-risoluzione basata su chip è un nuovo approccio alla microscopia a fluorescenza e offre vantaggi in termini di efficacia in termini di costi e produttività. Qui vengono mostrati i protocolli per la preparazione e l'imaging dei chip per la microscopia TIRF e la microscopia a super-risoluzione basata sulla localizzazione.

Fluorescenza della riflessione interna totale ad alto consumo e microscopia della ricostruzione ottica stocastica diretta utilizzando un chip fotonico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

L'obiettivo principale di questo manoscritto è quello di presentare una procedura di imaging della microscopia TIRF fotonica a base di chip di nuova sviluppo e della microscopia a localizzazione a singola molecola, come dSTORM. Il componente principale qui è il chip fotonico che sono fatti di serie di guida d'onda ottica. La luce all'interno della guida d'onda ottica è guidata in base alla riflessione interna totale.Parte della luce è presente sulla superficie sotto forma di onde evanescenti. Queste onde evanescenti, decadono esponenzialmente lontano dalla superficie, con una profondità di penetrazione di un paio di centinaia di nanometri. Questo li rende adatti per l'illuminazione TIRF.L'illuminazione TIRF tramite la guida d'onda ottica è disponibile su un'area estremamente ampia, definita dalla geometria della guida d'onda, ed è quindi ideale per l'imaging ad alta produttività. La differenza fondamentale tra una configurazione TIRF e dSTORM tradizionale rispetto al nostro approccio è che utilizziamo un chip fotonico per illuminare il campione, invece di inviare luce attraverso un obiettivo di imaging. Il nostro approccio separa l'illuminazione e la parte luminosa di raccolta, aprendo nuove possibilità di imaging.Posizionare il chip nella piastra di Petri di vetro utilizzando una pinzetta per wafer e coprire completamente con una soluzione 1%Hellmanex. Posizionare la piastra di Petri su una piastra calda a 70 gradi per 10 minuti. Mentre sei ancora sulla piastra calda, strofina la superficie con un tampone di tessuto della camera bianca.Rimuovere il truciolo dalla piastra di Petri. Risciacquare con almeno 100 millilitri di acqua deionata. Risciacquare con almeno 100 millilitri di isopropanolo, facendo attenzione che il solvente non si asciughi sulla superficie per evitare macchie di evaporazione.Risciacquare con almeno 100 millilitri di acqua deionata. Asciugare il truciolo con una pistola azotati. Preparare un pdms successivo di 150 micrometri ruotandola in una piastra di Petri.Utilizzare un bisturi per tagliare un telaio di circa 1,5 per 1,5 centimetri dallo strato PDMS. Sollevare il telaio dalla piastra di Petri con una pinzetta. Depositarlo piatto su un chip pulito e lucido.Il campione è ora pronto per la semina cellulare. Dopo il seeding cellulare, rimuovere il chip dal supporto. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido in eccesso dall'esterno della camera PDMS.Rimuovere il fluido corrente dall'interno della camera PDMS con un pipetto aggiungendo circa 60 microlitri pulire pbs contemporaneamente. Sostituire il PBS con 60 microlitri pulire PBS e lasciarlo incubare per un minuto. Ripetere il passaggio precedente, lasciandolo incubare per cinque minuti questa volta.Rimuovere il PBS e sostituirlo con 60 microlitri della soluzione colorante. Lasciare incubare il campione per circa 15 minuti, proteggendolo dalla luce. Lavare il campione con PBS utilizzando la procedura descritta in precedenza.Rimuovere il PBS e sostituirlo con 40 microlitri del buffer di imaging contemporaneamente. Posizionare un coverslip sopra, evitando che le bolle d'aria si formino sotto. Premere delicatamente il coperchio contro la camera di imaging per rimuovere eventuali supporti in eccesso.Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali supporti in eccesso all'esterno del coverslip. Pulire l'area all'esterno del coperchio con un tampone umido ad acqua per evitare cristalli formati da residui di mezzi ad immersione essiccati. Questa versione della configurazione è composta da tre componenti principali.Il microscopio con il supporto del filtro, la sorgente di luce bianca, la fotocamera e il revolver obiettivo. Lo stadio di accoppiamento, che è uno stadio piezo a tre assi, con un laser accoppiato a fibre e una lente di accoppiamento. Lo stadio del campione, che è uno stadio manuale a un asse, con punta e inclinazione, con un portavuoto.Sia lo stadio di accoppiamento che quello del campione sono montati su uno stadio motorizzato a due assi per la traduzione del campione. Posizionare il truciolo sul camion sottovuoto, con la sfaccettatura di accoppiamento verso l'obiettivo di accoppiamento. Assicurarsi che il chip sia a circa una lunghezza focale di distanza dall'obiettivo di accoppiamento.Accendere la pompa per vuoto. Accendere il laser a un milliwatt. Regolare approssimativamente l'altezza del truciolo in modo che il fascio colpisca il bordo di esso.Spegni il laser. Accendere la sorgente di luce bianca. Scegli un obiettivo a basso ingrandimento, ad esempio un 10x.Focalizza il microscopio su una guida d'onda. Traduci il microscopio lungo la guida d'onda per vedere se è ben allineato con il percorso ottico. Spostare il microscopio sul bordo dell'accoppiamento.Accendere il laser a un milliwatt o meno. Traduci il microscopio lungo il bordo di accoppiamento per trovare la luce laser. Mettere a fuoco il fascio sul bordo del truciolo.Regolare lo stadio di accoppiamento lungo il percorso ottico nella direzione che riduce le dimensioni del punto del raggio laser fino a quando non scompare. Il fascio è ora sopra o sotto la superficie del truciolo. Regolare l'altezza del palco di accoppiamento fino a quando il punto del fascio riappare ed è massimizzato.Ripetere i due passaggi precedenti fino a quando il laser non forma un punto focalizzato. Spostare il punto concentrato sulla guida d'onda di interesse. Traduci il microscopio a breve distanza dal bordo in modo che il punto del fascio focalizzato non sia più visibile.Spegni la luce bianca. Regolare il contrasto. Se la guida d'onda sta guidando, la luce diffusa lungo la guida d'onda dovrebbe essere chiaramente visibile.Regolare l'asse dello stadio di accoppiamento per massimizzare l'intensità della luce diffusa. Spegni il laser. Accendi la luce bianca.Regolare il contrasto, se necessario. Passare all'area di imaging. Concentrati con l'obiettivo immaginato desiderato.Spegni la luce bianca. Inserire il filtro a fluorescenza e ruotare la potenza del laser a un milliwatt. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera su circa 100 millisecondi.Regolare il contrasto in base alle esigenze. Assicurarsi che l'accoppiamento sia ancora ottimizzato. Individuare un'area di interesse per l'imaging.Attivare il ciclo dello stage piezo per eseguire il ciclo medio verso l'esterno dei nodi. Cattura almeno 300 immagini. Carica lo stack di immagini acquisito nelle Fiji usando uno stack virtuale.Scegliere Pile e Progetto Z dal menu immagine nelle Figi. Calcola l'immagine TIRF scegliendo Tipo di proiezione, Intensità media. Accendere il laser su un milliwatt e impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 30 millisecondi.Regolare il contrasto e la messa a fuoco. Aumentare la potenza del laser fino a quando non si osserva lampeggiare. Ingrandire una piccola area dell'esempio.Regolare il contrasto. Acquisisci alcune immagini per vedere se i battito di ciglia sono ben separati. Regolare il tempo di esposizione della fotocamera per un lampeggiamento ottimale.Accendere il ciclo del palco piezo. Registrare una pila di immagini di almeno 30.000 fotogrammi, a seconda della densità lampeggiante. Aprire Fiji e caricare lo stack dSTORM come immagini virtuali.Regolare il contrasto, se necessario. Utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare l'area da ricostruire. Analisi Open Run nel plug-in ThunderSTORM nelle Fiji.Imposta le impostazioni di base della fotocamera in ThunderSTORM, corrispondenti al tuo dispositivo. I parametri di default rimanenti sono in genere soddisfacenti. Inizia la ricostruzione.L'elenco di localizzazione fornito dal software di ricostruzione viene filtrato per rimuovere le localizzazioni non specifiche. Se necessario, viene applicata un'ulteriore correzione della deriva. La principale differenza tra l'imaging basato su chip e l'imaging tradizionale è nella strumentazione e nell'acquisizione dei dati.La qualità delle immagini ricostruite può quindi essere valutata allo stesso modo di un'immagine da un microscopio commerciale a super-risoluzione. Poiché vengono utilizzate guide d'onda multimodale, l'immagine risultante potrebbe tuttavia mostrare eccitazione disomogenea se vengono raccolte troppo poche immagini. Questo è mostrato nel pannello a.L'aumento della quantità di modelli di eccitazione dovrebbe provocare eccitazione disomogenea, come mostrato nel pannello b. Qui abbiamo immagini di cellule endoteliali sinusoidali epatiche, con membrana plasmatica con etichetta fluorescente. I pannelli a e b sono immagini limitate dalla diffrazione.Il pannello c mostra un'immagine limitata dalla diffrazione dell'inserto nel pannello b. Il pannello d mostra un'immagine dSTORM della stessa regione. Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche hanno fenestration di dimensioni nanometriche nella loro membrana plasmatica, che sono chiaramente visibili nell'immagine a super risoluzione nel pannello d.Uno dei principali vantaggi dell'imaging a super-risoluzione basato su chip è l'ampio campo visivo che è raggiungibile. Il pannello a mostra un'immagine dSTORM da 500 micron per 500 micron di cellule endoteliali sinusoidali epatiche con microtubulina con etichetta fluorescente. Il pannello b mostra l'inserto magenta dal pannello a, con immagini a diffrazione limitata e super-risoluzione per il confronto.Il pannello c mostra l'inserto verde dal pannello a. La risoluzione dell'immagine catturata è di 77 nanometri. In questo video, abbiamo eseguito un ampio campo visivo TIRF e dSTORM imaging di cellule endoteliali sinusoidali epatiche utilizzando un chip fotonico per l'illuminazione.Il nostro metodo è meno complesso, più compatto e più flessibile rispetto al modo convenzionale di eseguire TIRF utilizzando un obiettivo al microscopio di un'apertura numerica predeterminata e di un campo visivo basso. La microscopia a localizzazione, come dSTORM, è una delle diverse tecniche di imaging a super-risoluzione che abbiamo esplorato utilizzando chip fotonico. Ad esempio, la luce può essere confinata molto più strettamente all'interno di un materiale guida d'onda ottica ad alto indice di rifrazione rispetto a quanto sia possibile utilizzando una lente obiettiva di imaging.Questa proprietà dell'illuminazione del chip ha trovato applicazione nell'aumentare la risoluzione del metodo di microscopia ottica basato sulle fluttuazioni di intensità e della microscopia ad illuminazione strutturata. Inoltre, i chip fotonici offrono anche miniaturizzazione, economicità e una semplice configurazione ottica. Essere una tecnologia integrata lo rende compatibile con altre funzioni ottiche su chip.Nel complesso, ciò consente di retrofitting in microscopi convenzionali limitati alla diffrazione, consentendo una super-risoluzione a basso costo.

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Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

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