Name: high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Европейский исследовательский совет (грант No 336716 B.S.A.). Авторы также хотели бы поблагодарить Ирати Лагфрагуа за ее неоценимую помощь в записи и редактировании видео.

1. Подготовка полидиметилсилоксана (PDMS) слоя
<ol><li>Подготовьте смесь 10:1 из мономеров Sylgard 184 и лечебного агента.</li>
	<li>Поместите смесь в вакуумную камеру, пока пузырьки воздуха не исчезнут.</li>
	<li>Налейте 1,7 г смеси PDMS в центре 3,5 дюйма (диаметр) чашку Петри.</li>
	<li>Поместите чашку Петри на вакуумный патрон спин-шуб.</li>
	<li>Спин пальто чашку Петри для 20 с при 900 об/мин, с ускорением 75 об/мин /с.</li>
	<li>Лечить блюдо на горячей панели при 50 градусах по Цельсию, по крайней мере 2 ч.</li>
</ol>2. Подготовка образцов
<ol><li>
Очистка волновода
	<ol>
<li>Приготовьте 100 мл 1% разбавления моющего средства концентрата(Таблица материалов)в деионизированной (DI) воде.</li>
		<li>Поместите чип в стеклянную тарелку Петри с помощью вафельное пинцет и полностью накройте моющим раствором.</li>
		<li>Поместите чашку Петри на горячую тарелку при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут.</li>
		<li>Пока еще на горячей пластине, руб поверхности с чистой ткани тампон.</li>
		<li>Удалите чип из чашки Петри. Промыть не менее 100 мл воды DI.</li>
		<li>Промыть не менее 100 мл изопропанола, заботясь о том, чтобы растворитель не высох лишней на поверхности, чтобы предотвратить испарение пятен.</li>
		<li>Промыть не менее 100 мл воды DI. Удар чип сухой с азотной пушкой.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Камерная подготовка
	<ol>
<li>Приготовьте слой 150 мкм полидиметилсилоксана (PDMS) в чашке Петри (раздел 1).</li>
		<li>Используйте скальпель, чтобы вырезать 1,5 см х 1,5 см кадр амра к слою PDMS.</li>
		<li>Поднимите рамку из чашки Петри с помощью пинцета. Депозит его плоский на чистый и полированный чип. Образец теперь готов для посева клеток.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Флуоресцентная маркировка
	<ol>
<li>Подготовьте следующие химические вещества: фосфат-буферированный соленом, раствор красителя (ы), dSTORM image.буфер.</li>
		<li>После посева клеток, удалить чип из средств массовой информации.</li>
		<li>Используйте пипетку, чтобы удалить излишки жидкости из-за пределов камеры PDMS.</li>
		<li>Удалите текущую жидкость из камеры PDMS с помощью пипетки, добавляя примерно 60 л чистого PBS в то же время. ПРИМЕЧАНИЕ: Сумма, добавленная в камеру, должна быть изменена в зависимости от размера камеры. Будьте осторожны, чтобы не удалить все носители с поверхности клетки.</li>
		<li>Замените PBS с 60 л чистого PBS и дайте ему инкубировать в течение 1 мин.</li>
		<li>Повторите предыдущий шаг, позволяя ему инкубировать в течение 5 минут на этот раз.</li>
		<li>Удалить PBS и заменить его с 60 зл и раствором красителя. Оставьте образец для инкубации в течение 15 минут, защищая его от света. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг, возможно, придется существенно изменить, в зависимости от флуоресцентного красителя используется. Мы используем CellMask Deep Red для обозначения клеточной мембраны для этого эксперимента</li>
		<li>Вымойте образец с PBS как в шагах 2.3.3-2.3.5.</li>
		<li>Удалите PBS и замените его 40 qL буфера изображения в то же время. ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько различных буферов визуализации для различных флуоресцентных красителей.</li>
		<li>Поместите coverslip на вершине, предотвращая пузырьки воздуха от формирования под. Аккуратно нажмите на крышку против камеры изображения, чтобы удалить любые избыточные носители.</li>
		<li>Используйте пипетку для удаления любых избыточных носителей за пределами coverslip. Очистите область за пределами coverslip с водой влажный тампон, чтобы избежать кристаллов, образованных сушеных остатков средств погружения.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Процедура визуализации
<ol><li>Установка компонентов ПРИМЕЧАНИЕ: Эта версия установки состоит из трех основных компонентов: микроскоп, этап соединения и этап образца. Смотрите таблицу материалов.<ol>
<li>Используйте микроскоп с держателем фильтра, белым источником света, камерой и объективным револьвером.</li>
		<li>Используйте 3-осевой пьезо, связав с оптоволоконным лазером и соединительным объективом.</li>
		<li>Используйте одноосный ручной этап образца с кончиком и наклоном и вакуумным держателем.</li>
		<li>Установите как соединение, так и этап образца на 2-осевой моторизованной стадии для перевода образцов.</li>
	</ol></li>
	<li>Связь с волнами
	<ol>
<li>Поместите чип на вакуумный патрон с связующей граней к цели соединения. Убедитесь, что чип находится примерно в одной фокусной длине от цели соединения.</li>
		<li>Включите вакуумный насос.</li>
		<li>Включите лазер до 1 мВт. Грубо отрегулируйте высоту чипа так, чтобы луч попал в его край. Выключилазер.</li>
		<li>Включите источник белого света. Выберите объектив с низким увеличением объективной (например, 10x). Сосредоточьте микроскоп на волноходе.</li>
		<li>Переведите микроскоп вдоль волновода, чтобы увидеть, если он хорошо выровнены с оптическим путем. Переместите микроскоп к краю соединения.</li>
		<li>Включите лазер на 1 мВт или меньше. Переведите микроскоп вдоль края соединения, чтобы найти лазерный свет. Сосредоточьте луч на краю чипа.</li>
		<li>Отрегулируйте этап соединения вдоль оптического пути в направлении, которое уменьшает размер пятна лазерного луча, пока он не исчезнет. Луч в настоящее время либо выше или ниже поверхности чипа.</li>
		<li>Отрегулируйте высоту стадии соединения до тех пор, пока пучок не появится и не будет максимизируется.</li>
		<li>Повторите два предыдущих шага до тех пор, пока лазер не образует сфокусированное место.</li>
		<li>Переместите сфокусированное место в волногид интереса.</li>
		<li>Переведите микроскоп на небольшое расстояние от края, чтобы сфокусированное пятно луча больше не было видно. Выключите белый свет.</li>
		<li>Отрегулируйте контраст. Если волновод направляется, рассеянный свет вдоль волновода должен быть хорошо виден.</li>
		<li>Отрегулируйте оси стадии соединения, чтобы максимизировать разрозненные интенсивности света. Выключилазер.</li>
		<li>Включите белый свет. При необходимости отрегулируйте контраст.</li>
		<li>Перейдите к области изображений.</li>
	</ol></li>
	<li>Дифракция ограниченная визуализация
	<ol>
<li>Сосредоточьтесь с желаемой целью визуализации. Выключите белый свет.</li>
		<li>Вставьте флуоресценционный фильтр и поверните лазерную мощность до 1 мВт.</li>
		<li>Установите время экспозиции камеры примерно до 100 мс. Отрегулируйте контраст по мере необходимости. Убедитесь, что соединение по-прежнему оптимизировано.</li>
		<li>Найдите область, интересуемую для визуализации. Включите пьезо этапе цикл овечно ежемерный из режимов. ПРИМЕЧАНИЕ: диапазон сканирования 20 мкм с размером шага 50 нм подходит для большинства волноводных структур.</li>
		<li>Захват не менее 300 изображений.</li>
		<li>Загрузите стек захваченного изображения на Фиджи с помощью виртуального стека. Из меню изображений на Фиджи выберите Stacks и z-project.</li>
		<li>Рассчитайте изображение TIRF, выбрав тип проекции средней интенсивности.</li>
	</ol></li>
	<li>г Storm изображений
	<ol>
<li>Включите лазер до 1 мВт и установите время экспозиции камеры до 30 мс.</li>
		<li>Отрегулируйте контраст и фокусировку.</li>
		<li>Увеличьте мощность лазера до тех пор, пока не будет наблюдаться мигание. ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время, в зависимости от интенсивности evanescent поля.</li>
		<li>Увеличьте масштаб небольшой области выборки.</li>
		<li>Отрегулируйте контраст.</li>
		<li>Захват несколько изображений, чтобы увидеть, если мигает хорошо разделены.</li>
		<li>Отрегулируйте время экспозиции камеры для оптимального мигания. ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация мигает является сложной задачей, но много подходящей литературы доступна12.</li>
		<li>Включите пьезо этапе цикла.</li>
		<li>Запись стек изображения, по крайней мере 30000 кадров, в зависимости от плотности мигания.</li>
	</ol></li>
	<li>г Реконструкция изображения STORM
	<ol>
<li>Откройте Фиджи и загрузите стек dSTORM в виде виртуальных изображений.</li>
		<li>При необходимости отрегулируйте контраст.</li>
		<li>Используйте инструмент прямоугольника, чтобы выбрать область для реконструкции.</li>
		<li>Открытый анализ запуска в плагине Thunderstorm13 на Фиджи.</li>
		<li>Установите основные настройки камеры в Грозе, соответствующие устройству. Остальные параметры по умолчанию, как правило, являются удовлетворительными.</li>
		<li>Начните реконструкцию. ПРИМЕЧАНИЕ: Для полного поля зрения, данные, возможно, потребуется разделить в подстогах, из-за большого размера файла.</li>
		<li>Фильтр список локализации, предоставленный программным обеспечением реконструкции, для удаления неспецифических локализаций. Apple дополнительную дрейф-коррекцию, если это необходимо.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-colour+direct+STORM+with+red+emitting+carbocyanines.">Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines.</a> Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).</li><li>Wazawa, T., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+single+molecule+nanobioscience.">Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).</li><li>Jalali, B., Fathpour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+photonics.">Silicon photonics.</a> Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).</li><li>Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., &#216;ie, C. I., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+on-a-chip:+super-resolution+imaging+on+the+millimeter+scale.">Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale.</a> Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).</li><li>Diekmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+wide+field-of-view+nanoscopy.">Chip-based wide field-of-view nanoscopy.</a> Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).</li><li>Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+nitride+waveguide+platform+for+fluorescence+microscopy+of+living+cells.">Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells.</a> Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).</li><li>Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Helles&#248;, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+propulsion+of+red+blood+cells+on+waveguide+surfaces.">Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces.</a> Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).</li><li>Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-Based+Resonance+Raman+Spectroscopy+Using+Tantalum+Pentoxide+Waveguides.">Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides.</a> IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).</li><li>Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: <a target="_blank" href="https://arxiv.org/abs/1903.05512v1">https://arxiv.org/abs/1903.05512v1</a> (2019)</li><li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+Samples+for+Optimizing+STORM+Super-Resolution+Microscopy.">Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waveguide-PAINT+offers+an+open+platform+for+large+field-of-view+super-resolution+imaging.">Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).</li></ol>

B.S. Ahluwalia подала заявку на патент GB1606268.9 на оптическую наноскопию на основе чипов. Другие авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих финансовых интересах.

Чип-изображение похоже на обычные изображения dSTORM. Таким образом, качество изображения можно оценить с помощью тех же подходов, что и для традиционной изображения dSTORM. Основное отличие пользователя заключается в том, что прозрачная стеклянная горка обменивается непрозрачным Si-wafer. Хотя они выглядят очень разные, обработка образца практически аналогична стеклянной горке. Чипы довольно прочные и могут быть легко обработаны с помощью вафельное пинцет. Процедура визуализации и реконструкция изображения такая же, как и в обычном эксперименте dSTORM. Настройка функционального микроскопа на основе чипов не требует специальных компонентов, кроме фотонных чипов. Более подробную информацию о настройке можно найти в предыдущей работе6,7. Чипы, используемые в этой работе, были изготовлены с помощью стандартной фотолитографии8.
Подготовка образцов включает в себя подготовку выборочной камеры. При подключении кадра PDMS к чипу, очень важно, чтобы избежать каких-либо небольших складок или рипы, где воздух может войти. Если PDMS складывается при его крепления, просто удалить его тщательно с пинцетом и прикрепить его. Когда образец готов внутри камеры PDMS, крышка должна быть прижата к нему, герметичная область. Важно избегать пузырьков воздуха, которые могут образовываться при крепении крышки. Если пузырь воздуха образуется, аккуратно снимите стекло и добавьте PBS в камеру образца, чтобы убедиться, что образец покрыт. Подготовка и вложение крышки скольжения может быть просто переделать.
Соединение света в волногид упрощается с помощью протокола, предложенного в настоящем документе. Есть, однако, несколько общих проблем, которые могут ограничить связь. Во-первых, если чип не был очищен должным образом и любые остатки PBS удалены полностью, может быть грязь или кристаллизованные PBS на волноуг. Это может привести к значительным потерям, что приводит к очень малоэнергии в области визуализации. Использование влажного тампона для очистки области за пределами крышки стекла может значительно улучшить мощность. Во-вторых, если парагвальная грань волновода повреждена (например, при неправильной обработке), потеря соединения может резко возрасти. Оптический осмотр края, как правило, выявить любые повреждения легко. Вся грани соединения чипа может быть отполирована тщательно, так же, как оптическое волокно, и даст гладкую грани соединения, которая затем увеличивает цепь.
После того, как свет был соединен, процедура визуализации такая же, как и в любой обычной установке dSTORM. Если изображение имеет неоднородное возбуждение, как показано на рисунке 2А,то, скорее всего, усреднение режима не работает хорошо. Двумя наиболее распространенными причинами этого являются: 1) слишком мало изображений, захваченных для того, чтобы создать средний стек и 2) слишком короткий расстояние колебаний / слишком большой размер шага. Сбор слишком мало изображений может оставить некоторые образцы возбуждения и в среднем, таким образом, будет неоднородным. Это можно легко решить, увеличив количество изображений в среднем стеке. Слишком короткое расстояние колебаний может также привести к неоднородному изображению, так как недостаточное количество шаблонов режимов возбуждается. Это также может быть легко решена путем увеличения расстояния колебаний и / или уменьшения размера шага. В этой работе мы использовали сцену пьезо для сканирования вхотливого лазерного луча более 20 мкм и приобретения не менее 300 изображений. Другой подход может заключаться в использовании высокоскоростных галво-зеркал для сканирования света через входной волнообразной фаши в течение одного времени приобретения, например, 10-30 мс. Этот вариант подходит для визуализации тизины живых клеток TIRF, где субклеточные органеллы находятся в постоянном движении.
Чип-основанный dSTORM предлагает беспрецедентную большую площадь TIRF возбуждение, что делает его идеально подходит для высокой пропускной работы изображений. Компактный символ позволяет переоборудовать сядок в коммерческие системы, где чип можно разместить с ног на голову для перевернутых установок или прозрачных субстратов. Чипы являются массовыми изготовлены и могут быть изменены в соответствии со многими потребностями. В настоящее время основным ограничением является то, что оно ограничено 2D. Evanescent поле доступно только около 200 нм от поверхности волнорез, так что только фторфоры в этой области будут рады. В целом, область интегрированной оптики предлагает много возможностей для микроскопии на основе чипов в ближайшем будущем, решая новые вопросы визуализации, а также предоставляя новые возможности для существующих.

С момента первоначальной демонстрации одной молекулы локализации микроскопии, многие варианты были разработаны для решения различных проблем1,2,3. Одна из проблем, которая остается, однако, большое поле зрения dSTORM изображений. Многие установки dSTORM используют один и тот же объективный объектив как для возбуждения образца, так и для его изображения. Для увеличения поля зрения необходим объектив с низким увеличением. Низкое увеличение и низкие численные диафрагмы (NA) объективные линзы, как правило, имеют большую глубину ранты, что приводит к увеличению вне плоскости сигнала, что позволит снизить точность локализации. Цели TIRF обычно используются для увеличения контраста изображения за счет уменьшения флуоресценции вне плана. Через TIRF, возбуждение ограничивается оптической толщиной около 150 нм от поверхности с помощью evanescent поле4. Объективные линзы TIRF требуют большого NA, что приводит к небольшому поле зрения (FOV) (например, 50 х 50 мкм2),что значительно ограничивает пропускную стоимость. Однако существуют альтернативные способы создания evanescent поля.
Оптический волнодуд представляет собой структуру, которая будет ограничивать и направлять свет, если он связан с структурой. Чаще всего волноводы используются в волоконно-телекоммуникационной связи. Были приложены большие усилия для того, чтобы разработать 2D интегрированные волноводы в качестве основного компонента фотонных интегральных схем. Технология продвинулась до точки, где изготовление низкой потери нано-структурированных оптических волнообразов можно регулярно сделать5. Сегодня несколько литейных заводов по всему миру могут быть использованы для разработки фотонных интегральных схем. Waveguides направлять свет через полное внутреннее отражение также экспонирование evanescent поле на поверхности. Тщательное проектирование волноугной структуры, высокая интенсивность может быть достигнута в области эвакуации. Образец, помещенный непосредственно на поверхность волновода, может быть также освещен evanescent полем для применения изображений. Evanescent поле будет генерироваться по всей длине и ширине волновода, и, таким образом, это может быть сделано произвольно большой6.
Мы представляем новый подход к TIRF dSTORM, который предлагает произвольно большое поле зрения. Вместо того, чтобы использовать объектив TIRF как для возбуждения, так и для сбора, мы возбуждаем с помощью evanescent поля от оптических волнообразов. Это отделяет возбуждение и сбор световой путь, что позволяет полную свободу вдоль пути сбора света без ущерба для оптического сечения для данной длины волны, предоставляемой волнорезом чипа освещения. Таким образом, линзы с низким увеличением могут использоваться для изображения очень больших регионов в режиме TIRF, хотя меньший NA уменьшит боковое разрешение. Кроме того, многоцветная визуализация также значительно упрощается с помощью волногидов7,так как несколько длин волн можно направлять и обнаруживать без стративания системы. Это выгодно для dSTORM, так как низкие длины волн могут быть использованы для повышения флюорофора мигает и для многоцветной визуализации. Стоит отметить, что глубина проникновения evanescent поля будет меняться как функция длины волны, хотя это не влияет на то, как процедура визуализации выполняется. Чип совместим с живой визуализацией клеток8 и идеально подходит для таких приложений, как интеграция микрофлюиди. Каждый чип может содержать десятки волногов, которые могут позволить пользователю изображения в различных условиях или применять оптические захвата9 и Роман спектроскопии10.
Система на основе чипов одинаково хорошо работает как для дифракционной, так и для сверхразрешения изображений. Аналогичный подход был введен в 2005 году с использованием призмы для создания evanescent возбуждение поля4. Фотонический чип также возбуждает через evanescent поле, но с современными методами изготовления волновода, можно генерировать экзотические световые узоры с волноводами. Нынешняя реализация наноскопии на основе чипов ограничивается только 2D-изображением, так как волнообразное поле запирается внутри поверхности волноугина. Будущая разработка будет направлена на 3D-приложения. Кроме того, другие методы супер-разрешения, такие как структурированная микроскопия освещения, разрабатываются с использованием того же микроскопа на основе чипа11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-axis sample stage</td>
			<td>Standa</td>
			<td>7T173-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-axis sample translation stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis NanoMax stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MAX311D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXFM microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red, Life technologies</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom grade swabs</td>
			<td>MRC Technology</td>
			<td>MFS-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-coupled laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>Flamenco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Holder</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Cleaning detergent concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-E0433314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Coupling lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LMPLFLN 50x/0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>Mix according to descriptions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HWV001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Tweezers Type 2W</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGT5051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip

Полная внутренняя флуоресценция отражения (TIRF) обычно используется в одной молекуле локализации на основе супер-разрешения микроскопии, как это дает повышенный контраст из-за оптического сечения. Обычный подход заключается в использовании высокочисленных диафрагмы микроскопа TIRF целей как для возбуждения и сбора, серьезно ограничивая поле зрения и пропускной их. Мы представляем новый подход к генерации TIRF возбуждение для визуализации с оптическими волноводами, называется чип основе наноскопии. Цель юга в этом протоколе состоит в том, чтобы продемонстрировать, как изображение на основе чипов выполняется в уже построенной установке. Основным преимуществом наноскопии на основе чипов является то, что пути возбуждения и сбора разъединяются. Изображение может быть сделано с низким увеличением объектива, в результате чего большое поле зрения TIRF изображения, по цене небольшого сокращения разрешения. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) были изображены с помощью прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии(dSTORM), показывая разрешение, сравнимое с традиционными микроскопами супер-разрешения. Кроме того, мы демонстрируем высокопроизводительные возможности, изображая область 500 мкм х 500 мкм с объективом с низким увеличением, обеспечивая разрешение 76 нм. Благодаря своему компактспособному характеру, чип-изображение может быть переоборудовано в наиболее распространенные микроскопы и может быть объединено с другими оптическими методами на чипе, такими как зондирование на чипе, спектроскопия, оптическое улавливание и т.д. Таким образом, техника идеально подходит для высокой пропускной способности 2D супер-разрешение изображения, но и предлагает большие возможности для мульти-модального анализа.

TIRF микроскопии является популярным методом, как он удаляет вне плана флуоресценции, увеличивает контрастность и, таким образом, улучшает качество изображения, и менее фототоксичные по сравнению с другими методами флуоресценции на основе микроскопии. По сравнению с традиционным объективным подходом, микроскопия на основе чипов предлагает возбудить TIRF без ограниченной пропускной всей вхадебности, которая обычно сопровождается объективом TIRF. Обзор представленной установки можно найти на рисунке 1A. Мы представляем дифракции ограничены, а также dSTORM изображения печени синусоидальных эндотелиальных клеток (LSEC), извлеченных из мышей. Также представлено большое поле зрения, изображение LSECs с маркированным микротубулином, демонстрирующее возможности высокой пропускной способности изображения. Обычная установка dSTORM с использованием объектива TIRF погружения масла (или 60x или 100x увеличение) обычно изображения области 50 мкм х 50 мкм, что в 100 раз меньше, чем чип на основе изображения на рисунке 2, изображение с 25x, 0,8 NA цели.
В этом методе мы используем многомоеленные si3N4 волноводы для возбуждения. Использованные микросхемы состоят из гравийного руководящего слоя 150 нм Si3N4, отложенного на 2 мкм окисленного слоя кремниевого чипа. Схема чипа может быть найдена на рисунке 1B. Ширина waveguide может варьироваться от 200 до 1000 мкм. Детали изготовления можно найти в другом месте8. Через помехи между режимами распространения свет возбуждения не будет иметь однородное распределение интенсивности, а скорее пространственно меняющуюся модель. Рисунок 2А представляет изображение с четко видимыми шаблонами режима. Эта интерференционная модель будет меняться с положением лазерного луча на краю волновода. Для достижения однородного возбуждения в окончательных изображениях, мы используем сцену пьезо, чтобы колебаться вдоль спаренной грани. В ходе процедуры визуализации существует достаточное количество изменений интерференций, чтобы их можно было усреднять, устраняя колебания интенсивности изображения. Стек изображения будет состоять из нескольких изображений, таких как на рисунке 2A, хотя и с различными шаблонами, но когда усреднено, стек даст изображение с однородным возбуждением, таких как Рисунок 2B. Альтернативный подход заключается в использовании адиабатического сужается для достижения широкого, одного модистого waveguides8,14, который устраняет необходимость усреднения режима. Тем не менее, несколько миллиметров сужающейся длины необходимы для поддержания однорежимного состояния для достижения 100 мкм ширины волны. Многорежимные волноводы обходят эту сужающейся необходимостью и не оставляют ограничений на ширину конструкции. Помимо модели освещения, высокоэффективный рефракционный индекс режимов позволяет беспрецедентные возможности для структурированной микроскопии освещения11 и методов микроскопии колебаний7.
Первым шагом в визуализации является сбор ограниченного изображения дифракции. Результатом эксперимента является стек из около 300 изображений, и окончательное изображение делается путем принятия среднего стека. На рисунке 2, мы представляем дифракции ограничено и dSTORM изображения LSECs помечены CellMask Deep Red с использованием 60x, 1.2 NA воды погружения цели. Рисунок 2А показывает неоднородное освещение, вызванное недостаточным усреднением режима. Успешное усреднение режима отображается на рисунке 2B. Рисунок 2C представляет собой изображение dSTORM того же региона, с отмеченным регионом, показанным на рисунке 2D. Печень синусоидальных эндотелиальных клеток имеют нано-размерных пор в плазменной мембране15, которые можно увидеть здесь. Анализ корреляции четырех звена обеспечил разрешение 46 нм.
Рисунок 3 представляет изображение dSTORM области 500 мкм х 500 мкм, демонстрируя высокую пропускную способность техники. Увеличенное изображение рисунка 3A,соответствующее типичному dSTORM полем зрения, представлено вместе с ограниченным изображением на рисунке 3B. Корреляция кольца Фурье для оценки разрешения была выполнена, принося значение 76 нм.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> Рисунок 1: Система визуализации и волногид. (A) Фотография системы визуализации. Образец помещается на вакуумный патрон на стадии образца, с связывая грань волнообразного волновода к цели соединения. Оптоволоконный лазер и цель соединения размещаются поверх 3D пьезо. Башня объектива с линзами захватывает изображение сверху и передает его на камеру. (B) Схема волновода с соединением и линзами изображения. Соединение объектива пары света в волног. Образцы (оранжевые бусы) хранятся внутри запечатанной камеры PDMS. Evanescent поле вдоль waveguide возбудит образец и цель изображения будет захватить испускаемых флуоресценции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> Рисунок 2: Дифракция-ограниченные и dSTORM изображения. (A) Изображение синусоидальных эндотелиальных клеток печени с недостаточным режимом усреднения, в результате чего четко видны возбуждения картины. (B) Тот же регион, как в (A), но с достаточным режимом усреднения, что приводит к однородной возбуждения. (C) Дифракция ограниченное изображение всета в (B); (D) dSTORM изображение того же региона. (E) Всет(D), четко показывая fenestrations в плазменной мембране клетки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> Рисунок 3: dSTORM изображение крыс LSECs. (A) Большое поле зрения dSTORM изображение Alexa 647 окрашенных тубулин в крысы LSECs. Шкала бар 50 мкм. (B) Больше отмеченных области от (A) сравнение дифракции ограничено (внизу слева) и dSTORM изображение (вверху справа). (C) Меньший отмеченный регион от (A). Шкала бар No 1 мкм. Разрешение изображения составляет 76 нм. Адаптировано с разрешения Helle et al. 20196. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Оптическая микроскопия на основе микросхем на основе суперразрешения является новым подходом к флуоресценции и предлагает преимущества в экономической эффективности и пропускной способности. Здесь показаны протоколы подготовки и визуализации чипов для микроскопии TIRF и микроскопии на основе локализации суперразрешения.

Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Основной целью этой рукописи является представление процедуры визуализации недавно разработанной фотонной микроскопии TIRF на основе чипов и микроскопии локализации одной молекулы, такой как dSTORM. Основным компонентом здесь является фотонический чип, которые сделаны из серии оптических волновых гидов. Свет внутри оптического волнового гида направлен на основе полного внутреннего отражения.Часть света присутствует на поверхности в виде эвакуационых волн. Эти evanescent волны, они распадаются экспоненциально от поверхности, с глубиной проникновения в пару сотен нанометров. Это делает их пригодными для освещения TIRF.Освещение TIRF с помощью оптического волнового гида доступно на очень большой площади, которая определяется геометрией волнового гида и, таким образом, идеально подходит для изображений с высокой пропускной способностью. Ключевое различие между традиционной установкой TIRF и dSTORM по сравнению с нашим подходом заключается в том, что мы используем фотонический чип для освещения образца, вместо того, чтобы посылать свет через объектив с целью визуализации. Наш подход отъединяет освещение и световую часть коллекции, открывая новые возможности визуализации.Поместите чип в стеклянную чашку Петри с помощью вафельного пинцета и полностью накройте раствором 1%Hellmanex. Поместите чашку Петри на горячую плиту при 70 градусах в течение 10 минут. Пока все еще на hotplate, протрите поверхность с тампоном ткани cleanroom.Удалите чип из чашки Петри. Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Промыть по крайней мере 100 миллилитров изопропанола, заботясь о том, чтобы растворитель не высыхает на поверхности, чтобы предотвратить испарение пятен.Промыть не менее 100 миллилитров деионеров воды. Удар чип сухой с азотной пушкой. Приготовьте более поздние 150 микрометров PDMS, вращая его в чашке Петри.Используйте скальпель, чтобы вырезать примерно 1,5 на 1,5 сантиметра кадра из слоя PDMS. Поднимите раму из чашки Петри пинцетом. Депозит его плашмя на чистый и полированный чип.Образец теперь готов для посева клеток. После посева клеток удалите чип из мультимедиа. Используйте пипетку, чтобы удалить излишки жидкости из-за пределов камеры PDMS.Удалите текущую жидкость из камеры PDMS с помощью пипетки, добавляя при этом около 60 микролитров чистого PBS одновременно. Заменить PBS с 60 микролитров чистой PBS, и пусть инкубировать в течение одной минуты. Повторите предыдущий шаг, позволяя ему инкубировать в течение пяти минут на этот раз.Удалите PBS и замените его 60 микролитров раствора красителя. Оставьте образец инкубировать в течение 15 минут, защищая его от света. Вымойте образец с помощью PBS с помощью ранее описанной процедуры.Удалите PBS и замените его 40 микролитров буфера изображения одновременно. Поместите крышку сверху, предотвращая образование пузырьков воздуха под ним. Аккуратно нажмите крышку на камеру визуализации, чтобы удалить излишки мультимедиа.Используйте пипетки, чтобы удалить излишки мультимедиа за пределами крышки. Очистите область за пределами крышки с водой влажный тампон, чтобы избежать кристаллов, образованных сушеных остатков средств погружения. Эта версия установки состоит из трех основных компонентов.Микроскоп с держатель фильтра, белый источник света, камера, и объективный револьвер. Этап соединения, который является трехосной стадией пьезо, с лазером, со волокном, и сотый объектив. Образец этап, который является одной оси ручной этап, с кончиком и наклоном, с вакуумным держателем.Как соединение, так и этап выборки устанавливаются на двухосной моторизованной сцене для выборочных переводов. Поместите чип на вакуумный грузовик, с аспектом соединения к цели соединения. Убедитесь, что чип находится примерно на одном фокусном от цели соединения.Включите вакуумный насос. Включите лазер до одного милливатта. Грубо отрегулируйте высоту чипа так, чтобы луч попал в его край.Выключите лазер. Включите белый источник света. Выберите объектив с низким увеличением объектива, например, 10x.Сосредоточьте микроскоп на волновой гиде. Переведить микроскоп вдоль волнового гида, чтобы увидеть, хорошо ли он выровнен с оптическим путем. Перемести микроскоп к краю соединения.Включите лазер на один милливатт или меньше. Перевейте микроскоп вдоль края соединения, чтобы найти лазерный свет. Сосредоточьте луч на краю чипа.Отрегулируйте этап соединения вдоль оптического пути в направлении, которое уменьшает размер пятна лазерного луча до тех пор, пока оно не исчезнет. Луч теперь находится выше или ниже поверхности чипа. Отрегулируйте высоту стадии соединения до тех пор, пока пятно луча не появится и не будет максимально.Повторите два предыдущих шага, пока лазер не образует сфокусированное пятно. Перемести сфокусированное место в волновой гид, представляющий интерес. Перевестив микроскоп на небольшое расстояние от края так, чтобы сфокусированное пятно луча больше не было видно.Выключите белый свет. Отрегулируйте контраст. Если волновой гид направляет, рассеянный свет вдоль волнового гида должен быть хорошо виден.Отрегулируйте ось стадии соединения, чтобы максимизировать рассеянную интенсивность света. Выключите лазер. Включите белый свет.При необходимости отрегулируйте контраст. Перейдите в область визуализации. Сосредоточьтесь на желаемой цели.Выключите белый свет. Вставьте фильтр флуоресценции и поверните мощность лазера до одного милливатта. Установите время экспозиции камеры примерно до 100 миллисекунд.Отрегулируйте контраст по мере необходимости. Убедитесь, что соединение по-прежнему оптимизировано. Найдите область, интересную для визуализации.Включите этап пьезо, зацикленный на средних узлах. Захват по крайней мере 300 изображений. Загрузите захваченный стек изображений на Фиджи с помощью виртуального стека.Из меню изображений на Фиджи выберите Stacks и Проект. Рассчитайте изображение TIRF, выбрав тип проекции, среднюю интенсивность. Включите лазер до одного милливатта и установите время экспозиции камеры до 30 миллисекунд.Отрегулируйте контрастность и фокусировку. Увеличьте мощность лазера до тех пор, пока не будет наблюдаться мигание. Увеличьте масштаб небольшой области выборки.Отрегулируйте контраст. Захват несколько изображений, чтобы увидеть, если мигает хорошо разделены. Отрегулируйте время экспозиции камеры для оптимального мигания.Включите петель сцены пьезо. Запись стека изображения, по крайней мере 30000 кадров, в зависимости от плотности мигания. Откройте Фиджи и загрузите стек dSTORM в качестве виртуальных изображений.При необходимости отрегулируйте контраст. Используйте прямоугольный инструмент, чтобы выбрать область, которую вы хотите реконструировать. Анализ Open Run в плагине ThunderSTORM на Фиджи.Установите основные настройки камеры в ThunderSTORM, соответствующие вашему устройству. Остальные параметры по умолчанию, как правило, являются удовлетворительными. Начните реконструкцию.Список локализации, предоставляемый программным обеспечением реконструкции, фильтруется для удаления неспецифических локализаций. При необходимости применяется дополнительная коррекция дрейфа. Основное различие между чип-изображения и традиционной визуализации в приборов и сбора данных.Таким образом, качество реконструированных изображений можно оценить так же, как изображение из коммерческого микроскопа супер-разрешения. Поскольку используются многомодальные волновые моды, полученное изображение может, однако, проявлять неоднородное возбуждение, если собрано слишком мало изображений. Это показано на панели А.Увеличение количества возбудимых моделей должно привести к неоднородной возбуждению, как показано на панели b. Здесь мы изображение печени синусоидальной эндотелиальной клетки, с флуоресцентно помечены плазменной мембраны. Панели a и b являются изображениями с ограниченной дифракцией.Панель c показывает ограниченное дифракцией изображение вставки в панели b. Панель d показывает dSTORM изображение того же региона. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени имеют фенестрацию размером с нано в плазменной мембране, которые хорошо видны на изображении супер-разрешения в панели d.Одним из главных преимуществ изображения на основе чипов на основе супер-разрешения является достижимое большое поле зрения. Панель показывает 500 микрон на 500 микрон-большой dSTORM изображение печени синусоидальных эндотелиальных клеток с флуоресцентно помечены микротубулин. Панель b показывает пурпурную вставку из панели A, с изображениями с ограниченным дифракцией и супер-разрешением для сравнения.Панель c показывает зеленую вставку с панели a. Разрешение захваченного изображения составляет 77 нанометров. В этом видео, мы выполнили большое поле зрения TIRF и dSTORM изображения синусоидальных эндотелиальных клеток печени с помощью фотонной чип для освещения.Наш метод менее сложен, компактнее и гибче обычного способа выполнения TIRF с помощью микроскопа с целью предопределенной численной диафрагмы и низкого поля зрения. Микроскопия локализации, такая как dSTORM, является одним из нескольких методов визуализации супер-разрешения, которые мы исследовали с помощью фотонной чипа. Например, свет может быть гораздо более плотно ограничен внутри высокорефракционного индекса оптического волнового материала, чем это возможно с помощью объектива, объективного изображения.Это свойство чипового освещения нашло применение в увеличении разрешения метода оптической микроскопии на основе интенсивности и структурированной микроскопии освещения. Кроме того, фотонический чип также выигрывает от миниатюризации, эффективности затрат и простой оптической установки. Будучи интегрированной технологией делает его совместимым с другими оптическими функциями на чипе.В целом, это позволяет переоборудовать в обычные микроскопы с ограниченной дифракцией, что позволяет супер-разрешение при низких затратах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Экономичная и универсальная высокопроизводительная система очистки белка с использованием многоколоночного пластинчатого адаптера

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Одновременное интерференционное отражение и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения для визуализации динамических микротрубочек и связанных с ними белков

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Использование микрофлюидики и флуоресцентной микроскопии для изучения динамики сборки одноактиновых нитей и пучков

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Высокопроизводительная кристаллизация белка с помощью микродиализа

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...