Name: high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip
Uploaded: 2019-11-16T10:00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip at JoVE.com

Los autores desean reconocer el Consejo Europeo de Investigación (concesión No. 336716 a B.S.A.). Los autores también quieren agradecer a Irati Lagfragua por su inestimable ayuda en la grabación y edición del video.

1. Preparación de la capa de polidimetilsiloxano (PDMS)
<ol><li>Prepare una mezcla 10:1 de monómero y agente de curado Sylgard 184.</li>
	<li>Coloque la mezcla en una cámara de vacío hasta que las burbujas de aire hayan desaparecido.</li>
	<li>Vierta 1,7 g de mezcla PDMS en el centro de una placa Petri de 3,5 pulgadas (diámetro).</li>
	<li>Coloque el plato Petri en el mandril de vacío de una capa de espín.</li>
	<li>Recubre la placa Petri durante 20 s a 900 rpm, con una aceleración de 75 rpm/s.</li>
	<li>Curar el plato en una placa eléctrica a 50 oC durante al menos 2 h.</li>
</ol>2. Preparación de la muestra
<ol><li>
Limpieza de guía de onda
	<ol>
<li>Preparar 100 ml de una dilución del 1% del concentrado de detergente limpiador(Tabla de Materiales)en agua desionizada (DI).</li>
		<li>Coloque el chip en un plato Petri de vidrio con una pinza de oblea y cubra completamente con la solución de detergente.</li>
		<li>Colocar el plato Petri en un plato caliente a 70 oC durante 10 min.</li>
		<li>Mientras esté en la placa caliente, frote la superficie con un hisopo de tejido de la sala limpia.</li>
		<li>Retire el chip de la placa Petri. Enjuagar con al menos 100 ml de agua DI.</li>
		<li>Enjuagar con al menos 100 ml de isopropanol, teniendo cuidado de que el disolvente no se seque en la superficie para evitar manchas de evaporación.</li>
		<li>Enjuagar con al menos 100 ml de agua DI. Seca la viruta con una pistola de nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la cámara
	<ol>
<li>Preparar una capa de polidimetilsiloxano de 150 m (PDMS) en una placa de Petri (sección 1).</li>
		<li>Utilice un bisturí para cortar un marco de 1,5 cm x 1,5 cm de la capa PDMS.</li>
		<li>Levante el marco del plato Petri con una pinza. Deposite plano en un chip limpio y pulido. La muestra ya está lista para la sembración celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etiquetado fluorescente
	<ol>
<li>Prepare los siguientes productos químicos: solución salina tamponada con fosfato, solución(s) de tinte, tampónde imágenes d STORM.</li>
		<li>Después de la sembración de celdas, retire el chip del medio.</li>
		<li>Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de líquido del exterior de la cámara PDMS.</li>
		<li>Retire el fluido de corriente del interior de la cámara PDMS con una pipeta mientras agrega aproximadamente 60 ml de PBS limpio al mismo tiempo. NOTA: La cantidad añadida a la cámara tendrá que cambiarse de acuerdo con el tamaño de la cámara. Tenga cuidado de no eliminar todos los medios de la superficie celular.</li>
		<li>Sustituya el PBS por 60 s de PBS limpio y déjelo incubar durante 1 min.</li>
		<li>Repita el paso anterior, dejándolo incubar durante 5 min esta vez.</li>
		<li>Retire el PBS y reemplácelo por 60 ml de la solución de tinte. Deje que la muestra se incuba durante unos 15 minutos, protegiéndola de la luz. NOTA: Este paso podría tener que cambiar significativamente, dependiendo del tinte fluorescente utilizado. Usamos CellMask Deep Red para etiquetar la membrana celular para este experimento</li>
		<li>Lave la muestra con PBS como en los pasos 2.3.3-2.3.5.</li>
		<li>Retire el PBS y reemplácelo por 40 l del búfer de imágenes al mismo tiempo. NOTA: Hay varios tampones de imagen diferentes para diferentes colorantes fluorescentes.</li>
		<li>Coloque un cubreobjetos en la parte superior, evitando que se formen burbujas de aire debajo. Presione suavemente el cubreobjetos contra la cámara de imágenes para eliminar cualquier exceso de medios.</li>
		<li>Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de medios fuera del cubreobjetos. Limpie el área fuera de la cubierta con un hisopo húmedo de agua para evitar cristales formados por residuos de medios de inmersión secos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimiento de imagen
<ol><li>Configuración de componentes NOTA: Esta versión de la configuración consta de tres componentes principales: el microscopio, la etapa de acoplamiento y la etapa de muestra. Consulte la Tabla de materiales.<ol>
<li>Utilice un microscopio con soporte de filtro, fuente de luz blanca, cámara y revólver objetivo.</li>
		<li>Utilice una etapa de acoplamiento piezoeléctrico de 3 ejes con un láser acoplado a fibra y una lente de acoplamiento.</li>
		<li>Utilice una etapa de muestra manual de un eje con punta e inclinación y un soporte de vacío.</li>
		<li>Monte tanto el acoplamiento como la etapa de muestra en una etapa motorizada de 2 ejes para la traducción de muestras.</li>
	</ol></li>
	<li>Acoplamiento de guía de onda
	<ol>
<li>Coloque la viruta en el mandril de vacío con la faceta de acoplamiento hacia el objetivo de acoplamiento. Asegúrese de que el chip esté aproximadamente a una distancia focal lejos del objetivo de acoplamiento.</li>
		<li>Encienda la bomba de vacío.</li>
		<li>Encienda el láser a 1 mW. Ajuste aproximadamente la altura de la viruta para que la viga golpee el borde de la misma. Apague el láser.</li>
		<li>Encienda la fuente de luz blanca. Elija una lente objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 10x). Enfoque el microscopio en una guía de onda.</li>
		<li>Traduce el microscopio a lo largo de la guía de onda para ver si está bien alineado con la trayectoria óptica. Mueva el microscopio al borde del acoplamiento.</li>
		<li>Encienda el láser a 1 mW o menos. Traduzca el microscopio a lo largo del borde del acoplamiento para encontrar la luz láser. Enfoque la viga en el borde de la viruta.</li>
		<li>Ajuste la etapa de acoplamiento a lo largo de la trayectoria óptica en la dirección que reduce el tamaño del punto del rayo láser hasta que desaparezca. La viga está ahora por encima o por debajo de la superficie de la viruta.</li>
		<li>Ajuste la altura de la etapa de acoplamiento hasta que el punto de viga reaparezca y se maximice.</li>
		<li>Repita los dos pasos anteriores hasta que el láser forme un punto enfocado.</li>
		<li>Mueva el punto enfocado a la guía de onda de interés.</li>
		<li>Traduzca el microscopio a una corta distancia del borde para que el punto del haz enfocado ya no sea visible. Apaga la luz blanca.</li>
		<li>Ajuste el contraste. Si la guía de onda está guiando, la luz dispersa a lo largo de la guía de onda debe ser claramente visible.</li>
		<li>Ajuste los ejes de la etapa de acoplamiento para maximizar la intensidad de la luz dispersa. Apague el láser.</li>
		<li>Encienda la luz blanca. Ajuste el contraste si es necesario.</li>
		<li>Vaya a la región de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes limitadas por difracción
	<ol>
<li>Concéntrese con el objetivo de imagen deseado. Apague la luz blanca.</li>
		<li>Inserte el filtro de fluorescencia y gire la potencia del láser a 1 mW.</li>
		<li>Ajuste el tiempo de exposición de la cámara a aproximadamente 100 ms. Ajuste el contraste según sea necesario. Asegúrese de que el acoplamiento sigue optimizado.</li>
		<li>Localice una región de interés para la creación de imágenes. Active el bucle de etapa piezoeléctrica para promediar los modos. NOTA: El rango de escaneo de 20 m con un tamaño de paso de 50 nm es adecuado para la mayoría de las estructuras de guía de onda.</li>
		<li>Captura al menos 300 imágenes.</li>
		<li>Cargue la pila de imágenes capturadas en Fiji mediante una pila virtual. En el menú de imágenes de Fiji, elija Stacks y z-project.</li>
		<li>Calcule la imagen TIRF eligiendo la intensidad mediadel tipo de proyección.</li>
	</ol></li>
	<li>d Imágenes STORM
	<ol>
<li>Encienda el láser a 1 mW y ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 30 ms.</li>
		<li>Ajuste el contraste y el enfoque.</li>
		<li>Aumente la potencia del láser hasta que se observe el parpadeo. NOTA: Esto puede tardar un tiempo, dependiendo de la intensidad del campo evanescente.</li>
		<li>Amplíe una pequeña región de la muestra.</li>
		<li>Ajuste el contraste.</li>
		<li>Captura algunas imágenes para ver si los parpadeos están bien separados.</li>
		<li>Ajuste el tiempo de exposición de la cámara para un parpadeo óptimo. NOTA: Optimizar el parpadeo es una tarea compleja, pero hay una gran cantidad de literatura adecuada disponible12.</li>
		<li>Encienda el bucle de escenario piezoeléctrico.</li>
		<li>Registre una pila de imágenes de al menos 30.000 fotogramas, dependiendo de la densidad parpadeante.</li>
	</ol></li>
	<li>d Reconstrucción de imágenes STORM
	<ol>
<li>Abra Fiji y cargue la pila dSTORM como imágenes virtuales.</li>
		<li>Ajuste el contraste, si es necesario.</li>
		<li>Utilice la herramienta rectángulo para seleccionar el área que desea reconstruir.</li>
		<li>Abra el análisis de ejecución en el plugin Thunderstorm13 en Fiji.</li>
		<li>Establezca los ajustes básicos de la cámara en Tormenta correspondiente al dispositivo. Los parámetros predeterminados restantes suelen ser satisfactorios.</li>
		<li>Comiencen la reconstrucción. NOTA: Para el campo de visión completo, es posible que los datos deban dividirse en subpilas, debido al tamaño de archivo grande.</li>
		<li>Filtre la lista de localización proporcionada por el software de reconstrucción para eliminar localizaciones inespecíficas. Apple una corrección de deriva adicional si es necesario.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. 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(79), (2013).</li><li>Ovesn&#253;, M., K&#345;&#237;&#382;ek, P., Borkovec, J., &#352;vindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waveguide-PAINT+offers+an+open+platform+for+large+field-of-view+super-resolution+imaging.">Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).</li></ol>

B.S. Ahluwalia ha solicitado la patente GB1606268.9 para nanoscopía óptica basada en chip. Los demás autores no declaran intereses financieros en competencia.

Las imágenes basadas en chips son similares a las imágenes dSTORM convencionales. Por lo tanto, la calidad de imagen se puede medir utilizando los mismos enfoques que para las imágenes dSTORM tradicionales. La principal diferencia para el usuario es que la corredera de vidrio transparente se intercambia con una opaca Si-wafer opaca. Aunque parecen muy diferentes, el manejo de la muestra es prácticamente análogo a una diapositiva de vidrio. Las virutas son bastante resistentes y se pueden manejar fácilmente usando pinzas de obleas. El procedimiento de diagnóstico por imágenes y la reconstrucción de la imagen es el mismo que en un experimento regular de dSTORM. La configuración de un microscopio funcional basado en chips no requiere componentes especiales, excepto los chips fotónicos. Más detalles de la configuración se pueden encontrar en los trabajos anteriores6,7. Los chips utilizados en este trabajo han sido fabricados utilizando fotolitografía estándar8.
La preparación de la muestra abarca la preparación de la cámara de muestra. Al conectar el marco PDMS al chip, es crucial evitar pequeños pliegues o rasgaduras en los que pueda entrar aire. Si el PDMS se pliega al conectarlo, simplemente retírelo cuidadosamente con una pinza y vuelva a conectarla. Cuando la muestra está lista dentro de la cámara PDMS, el vidrio de la cubierta debe ser presionado contra ella, sellando la región. Es importante evitar las burbujas de aire que puedan formarse al fijar el vidrio de la cubierta. Si se forma una burbuja de aire, retire suavemente el vidrio de la cubierta y agregue PBS a la cámara de muestra para asegurarse de que la muestra está cubierta. La preparación y fijación del resbalón de la cubierta se puede rehacer simplemente.
La luz de acoplamiento en la guía de onda se simplifica utilizando el protocolo propuesto en este documento. Sin embargo, hay algunos desafíos comunes que pueden limitar el acoplamiento. En primer lugar, si el chip no se limpió correctamente y cualquier PBS sobrante eliminado por completo, podría haber suciedad o PBS cristalizado en la guía de onda. Esto puede introducir pérdidas importantes, lo que resulta en muy poca potencia en la región de imágenes. El uso de un hisopo húmedo para limpiar la región fuera del vidrio de la cubierta puede mejorar significativamente la potencia. En segundo lugar, si la faceta de acoplamiento de la guía de onda está dañada (por ejemplo, por un manejo inadecuado), la pérdida de acoplamiento puede aumentar drásticamente. La inspección óptica del borde generalmente revelará cualquier daño fácilmente. Toda la faceta de acoplamiento del chip se puede pulir cuidadosamente, al igual que una fibra óptica, y dará una faceta de acoplamiento suave, que luego aumenta la potencia acoplada.
Una vez acoplada la luz, el procedimiento de imagen es el mismo que en cualquier configuración convencional de dSTORM. Si la imagen tiene excitación inhomogénea, como se muestra en la Figura 2A, entonces lo más probable es que el promedio de modo no funcionara bien. Las dos razones más comunes para esto son: 1) muy pocas imágenes capturadas con el fin de crear una pila promedio y 2) demasiado corto de una distancia de oscilación / demasiado grande de un tamaño de paso. La recopilación de muy pocas imágenes puede dejar fuera algunos patrones de excitación y, por lo tanto, el promedio será inhomogéneo. Esto se puede resolver fácilmente aumentando el número de imágenes en la pila promedio. Demasiado corto de una distancia de oscilación también puede resultar en una imagen inhomogénea, ya que no se excitan suficientes patrones de modo. Esto también se puede resolver fácilmente aumentando la distancia de oscilación y / o disminuyendo el tamaño del paso. En este trabajo hemos utilizado una etapa piezoeléctrica para escanear el rayo láser de entrada a más de 20 m y adquirir al menos 300 imágenes. Otro enfoque podría ser utilizar espejos galvo-espejos de alta velocidad para escanear la luz a través de la faceta de guía de onda de entrada dentro de un solo tiempo de adquisición, como 10-30 ms. Esta opción es adecuada para imágenes TIRF de células vivas, donde los orgánulos subcelulares están en constante movimiento.
Chip-based dSTORM ofrece una excitación TIRF de gran área sin precedentes, lo que lo hace ideal para imágenes de alto rendimiento. El carácter compacto permite la adaptación a los sistemas comerciales, donde el chip se puede colocar boca abajo para configuraciones invertidas o se pueden desarrollar sustratos transparentes. Las virutas son fabricadas en masa y se pueden modificar para adaptarse a muchas necesidades. Actualmente, la principal restricción es que se limita a 2D. El campo evanescente sólo está disponible aproximadamente a 200 nm de la superficie de la guía de onda, por lo que sólo los fluoróforos dentro de esta región se excitarán. En conjunto, el campo de la óptica integrada ofrece muchas oportunidades para la microscopía basada en chip en un futuro próximo, abordando nuevas preguntas de imagen, así como proporcionando nuevas posibilidades a las existentes.

Desde la demostración inicial de la microscopía de localización de una sola molécula, se han desarrollado muchas variaciones para resolver diferentes desafíos1,2,3. Un desafío que ha quedado, sin embargo, es la gran imagen de campo de visión dSTORM. Muchas configuraciones de STORMutilizan la misma lente objetivo tanto para excitar la muestra como para crear una imagen de ella. Para aumentar el campo de visión, se necesita una lente de bajo aumento. Las lentes objetivos de baja ampliación y baja apertura numérica (NA) suelen tener una gran profundidad de campo, lo que resulta en una mayor señal fuera del plano que reducirá la precisión de la localización. Los objetivos TIRF se utilizan comúnmente para aumentar el contraste de la imagen al reducir la fluorescencia fuera del plano. A través de TIRF, la excitación se limita a un espesor óptico de aproximadamente 150 nm de la superficie por medio de un campo evanescente4. Las lentes objetivo TIRF requieren un nA grande que resulta en un pequeño campo de visión (FOV) (por ejemplo, 50 x 50 ám2), lo que limita significativamente el rendimiento. Sin embargo, hay formas alternativas de generar un campo evanescente.
Una guía de onda óptica es una estructura que limitará y guiará la luz si se acopla a la estructura. Más comúnmente, las guías de onda se utilizan en las telecomunicaciones basadas en fibra. Se ha hecho un gran esfuerzo para desarrollar guías de onda integradas 2D como componente principal de los circuitos integrados fotónicos. La tecnología ha avanzado hasta un punto en el que la fabricación de guías de onda ópticas nanoestructuradas de baja pérdida se puede hacer rutinariamente5. Hoy en día, varias fundiciones de todo el mundo se pueden utilizar para desarrollar circuitos integrados fotónicos. Las guías de onda guían la luz a través de la reflectancia interna total también presentando un campo evanescente en la superficie. Mediante un diseño cuidadoso de la estructura de la guía de onda, se puede lograr una alta intensidad en el campo evanescente. Por lo tanto, una muestra colocada directamente en la parte superior de la superficie de la guía de onda también puede ser iluminada por el campo evanescente para aplicaciones de imágenes. El campo evanescente se generará a lo largo de toda la longitud y anchura de la guía de onda, y por lo tanto se puede hacer arbitrariamente grande6.
Presentamos un enfoque novedoso de TIRF dSTORM que ofrece un campo de visión arbitrariamente grande. En lugar de utilizar una lente TIRF tanto para excitación como para colección, nos excitamos utilizando el campo evanescente de las guías de onda ópticas. Esto desacopla la vía de luz de excitación y recolección, permitiendo una total libertad a lo largo de la trayectoria de la luz de la colección sin comprometer la sección óptica para una longitud de onda dada proporcionada por la iluminación del chip de guía de onda. Por lo tanto, las lentes de bajo aumento se pueden utilizar para crear imágenes de regiones muy grandes en modo TIRF, aunque un NA más pequeño reducirá la resolución lateral. Además, las imágenes multicolores también se simplifican en gran medida utilizando guías de onda7,ya que se pueden guiar y detectar varias longitudes de onda sin reajustar el sistema. Esto es ventajoso para dSTORM, ya que las longitudes de onda bajas se pueden utilizar para mejorar el parpadeo del fluoróforo y para la creación de imágenes multicolor. Vale la pena señalar que la profundidad de penetración del campo evanescente cambiará en función de la longitud de onda, aunque no afecta a cómo se realiza el procedimiento de imagen. El chip es compatible con la imagen de células vivas8 y es ideal para aplicaciones como la integración de microfluídicos. Cada chip puede contener decenas de guías de onda, lo que puede permitir al usuario crear imágenes en diferentes condiciones o aplicar la captura óptica9 y la espectroscopia de Raman10.
El sistema basado en chip funciona igual de bien tanto para imágenes limitadas por difracción como para imágenes de superresolución. Un enfoque similar se introdujo en 2005 utilizando un prisma para generar excitación de campo evanescente4. El chip fotónico también excita a través del campo evanescente, pero con las técnicas modernas de fabricación de guía de onda, se pueden generar patrones de luz exóticos con guías de onda. La actual implementación de nanoscopia basada en chip se limita únicamente a la toma de imágenes 2D, ya que el campo de excitación está bloqueado dentro de la superficie de la guía de onda. El desarrollo futuro se punteará en aplicaciones 3D. Además, se están desarrollando otras técnicas de superresolución, como la microscopía de iluminación estructurada, utilizando el mismo microscopio basado en chip11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-axis sample stage</td>
			<td>Standa</td>
			<td>7T173-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-axis sample translation stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td></td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-axis NanoMax stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MAX311D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BXFM microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-037018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Deep Red, Life technologies</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanroom grade swabs</td>
			<td>MRC Technology</td>
			<td>MFS-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-coupled laser</td>
			<td>Cobolt</td>
			<td>Flamenco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Holder</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III, Hellma Gmbh</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z805939</td>
			<td>Cleaning detergent concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>563935-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KL 1600 LED</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLY-LSM-E0433314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Coupling lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LMPLFLN 50x/0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orca Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td>Mix according to descriptions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1673921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APR001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HWV001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Tweezers Type 2W</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGT5051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput total internal reflection fluorescence and direct stochastic optical reconstruction microscopy using a photonic chip

La fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) se utiliza comúnmente en la microscopía de superresolución basada en localización de una sola molécula, ya que proporciona un mayor contraste debido a la sección óptica. El enfoque convencional consiste en utilizar objetivos TIRF del microscopio de alta apertura numérica tanto para la excitación como para la recolección, limitando severamente el campo de visión y el rendimiento. Presentamos un enfoque novedoso para generar excitación TIRF para imágenes con guías de onda ópticas, llamada nanoscopia basada en chip. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo se realizan las imágenes basadas en chips en una configuración ya construida. La principal ventaja de la nanoscopia a base de chip es que las vías de excitación y recolección están desacopladas. Las imágenes se pueden hacer con una lente de bajo aumento, lo que resulta en un gran campo de visión de imágenes TIRF, al precio de una pequeña reducción en la resolución. Las células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) se tomaron imágenes utilizando la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM), mostrando una resolución comparable a los microscopios tradicionales de superresolución. Además, demostramos las capacidades de alto rendimiento mediante la creación de imágenes de una región de 500 á m x 500 m con una lente de bajo aumento, proporcionando una resolución de 76 nm. A través de su carácter compacto, las imágenes basadas en chip se pueden adaptar a los microscopios más comunes y se pueden combinar con otras técnicas ópticas en chip, como la sensora en chip, la espectroscopia, el reventado óptico, etc. Por lo tanto, la técnica es ideal para imágenes de superresolución 2D de alto rendimiento, pero también ofrece grandes oportunidades para el análisis multimodal.

La microscopía TIRF es una técnica popular, ya que elimina la fluorescencia fuera del plano, aumenta el contraste y, por lo tanto, mejora la calidad de imagen, y es menos fototóxica en comparación con otras técnicas de microscopía basadas en fluorescencia. En comparación con el enfoque tradicional basado en objetivos, la microscopía basada en chips ofrece excitación TIRF sin el rendimiento limitado que generalmente se acompaña con una lente TIRF. Puede encontrar una descripción general de la configuración presentada en la Figura 1A. Presentamos imágenes de células endoteliales sinusoidales hepáticas (LSEC) derivadas de ratones con limitación de difracción y dSTORM. También se presenta una gran imagen de campo de visión de LSECs con microtubulina etiquetada, lo que demuestra las capacidades de la creación de imágenes de alto rendimiento. Una configuración convencional de dSTORM utilizando una lente TIRF de inmersión en aceite (aumento de 60x o 100x) normalmente imágenes de un área de 50 á m x 50 m, que es 100 veces más pequeña que la imagen basada en chip en la Figura 2,imagenda con un objetivo de 25x, 0,8 NA.
En este método, utilizamos guías de onda Si3N4 multimodo para la excitación. Las virutas utilizadas consisten en una capa guía grabada en tiras de 150 nm Si3N4 depositada sobre una capa oxidada de 2 m de un chip de silicio. Un esquema del chip se puede encontrar en la Figura 1B. Los anchos de la guía de onda pueden variar entre 200 y 1000 m. Los detalles de fabricación se pueden encontrar en otroslugares 8. A través de la interferencia entre los modos de propagación, la luz de excitación no tendrá una distribución de intensidad homogénea, sino más bien un patrón espacialmente variable. La Figura 2A presenta una imagen con patrones de modo claramente visibles. Este patrón de interferencia cambiará con la posición del rayo láser en el borde de la guía de onda. Para lograr una excitación homogénea en las imágenes finales, utilizamos una etapa piezoeléctrica para oscilar a lo largo de la faceta acoplada. En el transcurso del procedimiento de creación de imágenes, existe suficiente variación de los patrones de interferencia para que se puedan promediar, eliminando las fluctuaciones de intensidad en la imagen. La pila de imágenes constará de varias imágenes como en la Figura 2A,aunque con diferentes patrones, pero cuando se promedia, la pila producirá una imagen con excitación homogénea como la Figura 2B. Un enfoque alternativo es utilizar el tapering adiabático para lograr guías de onda anchas y monomodo8,14, lo que elimina la necesidad de promediar el modo. Sin embargo, se utilizan varios milímetros de longitud de cónico para mantener la condición de modo único para lograr un ancho de guía de onda de 100 m. Las guías de onda multimodo eluden esta necesidad de reducción y no dejan limitaciones en el ancho de la estructura. Más allá del patrón de iluminación, el índice de refracción altamente eficaz de los modos permite posibilidades sin precedentes hacia la microscopía de iluminación estructurada11 y los métodos de microscopía de fluctuación7.
El primer paso en la toma de imágenes es recopilar una imagen limitada por difracción. El experimento da como resultado una pila de alrededor de 300 imágenes y la imagen final se realiza tomando el promedio de la pila. En la Figura 2,presentamos imágenes STORM limitadas y dde difracción de LSECs etiquetadas con CellMask Deep Red utilizando un objetivo de inmersión en agua de 60x, 1.2 NA. La Figura 2A muestra una iluminación inhomogénea causada por un promedio de modo insuficiente. El modo promediado exitoso se muestra en la Figura 2B. El cuadro 2C es una imagen dSTORM de la misma región, con la región marcada mostrada en el cuadro 2D. Las células endoteliales sinusoidales hepáticas tienen poros de tamaño nanométrico en la membrana plasmática15,que se pueden ver aquí. Un análisis de correlación de anillos de Fourier proporcionó una resolución de 46 nm.
La Figura 3 presenta una imagen dSTORM de una región de 500 m x 500 m, lo que demuestra las capacidades de alto rendimiento de la técnica. Una imagen ampliada de la Figura 3A,correspondiente a un campo de visión típico de dSTORM, se presenta junto con la imagen limitada de difracción en la Figura 3B. Se realizó una correlación de anillo de Fourier para estimar la resolución, con un valor de 76 nm.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig1.jpg"> Figura 1: Sistema de imágenes y guía de ondas. (A) Fotografía del sistema de imágenes. La muestra se coloca en un mandril de vacío en la etapa de la muestra, con la faceta de acoplamiento de la guía de onda hacia el objetivo de acoplamiento. Un láser acoplado en fibra y un objetivo de acoplamiento se colocan en la parte superior de una etapa piezoeléctrica 3D. Una torreta de lente con lentes de imagen captura la imagen desde arriba y la transmite a una cámara. (B) Esquema de la guía de onda con lentes de acoplamiento e imágenes. La lente de acoplamiento acopla la luz en la guía de onda. Las muestras (cuentas naranjas) se mantienen dentro de una cámara PDMS sellada. El campo evanescente a lo largo de la guía de onda excitará la muestra y el objetivo de imagen capturará la fluorescencia emitida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig2.jpg"> Figura 2: Imágenes de dafracción limitadas y dSTORM. (A) Imagen de células endoteliales sinusoidales hepáticas con un promedio de modo insuficiente, lo que resulta en un patrón de excitación claramente visible. (B) La misma región que en (A), pero con un promedio de modo suficiente, lo que resulta en excitación homogénea. (C) Imagen limitada por difracción de la inserción en (B); (D) dStorm imagen de la misma región. (E) Inserción de (D), que muestra claramente las fenestraciones en la membrana plasmática de la célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60378/60378fig3.jpg"> Figura 3: dImagen STORM de LSECs de rata. (A) Gran campo de visión dSTORM imagen de Alexa 647 teñida de tubulina en LSECs de rata. Barra de escala a 50 m. (B) Región marcada más grande desde (A) comparando la imagen limitada por difracción (abajo a la izquierda) y la imagen dSTORM (arriba a la derecha). (C) Región marcada más pequeña desde (A). Barra de escala a 1 m. La imagen tiene una resolución de 76 nm. Adaptado con permiso de Helle et al. 20196. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60378/60378fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

La microscopía óptica de superresolución basada en chips es un enfoque novedoso para la microscopía de fluorescencia y ofrece ventajas en la rentabilidad y el rendimiento. Aquí, los protocolos para la preparación de chips y la toma de imágenes se muestran para la microscopía TIRF y la microscopía de superresolución basada en localización.

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

El objetivo principal de este manuscrito es presentar un procedimiento de diagnóstico por imágenes de la microscopía TIRF basada en chips fotónicos recientemente desarrollada y la microscopía de localización de una sola molécula, como dSTORM. El componente principal aquí es el chip fotónico que están hechos de series de guía de onda óptica. La luz dentro de la guía de onda óptica se guía sobre la base de la reflexión interna total.Parte de la luz está presente en la superficie en forma de las ondas evanescentes. Esas ondas evanescentes. Esto los hace adecuados para la iluminación TIRF.La iluminación TIRF a través de la guía de ondas óptica está disponible en un área extremadamente grande, definida por la geometría de la guía de ondas, y por lo tanto es ideal para imágenes de alto rendimiento. La diferencia clave entre una configuración tradicional de TIRF y dSTORM en comparación con nuestro enfoque es que utilizamos un chip fotónico para iluminar la muestra, en lugar de enviar luz a través de una lente objetivo de imagen. Nuestro enfoque desacopla la iluminación y la parte de luz de la colección, abriendo nuevas posibilidades de imagen.Coloque el chip en el plato Petri de vidrio con una pinza de oblea y cúbralo completamente con una solución de 1%Hellmanex. Coloque el plato Petri en una placa caliente a 70 grados durante 10 minutos. Mientras esté en la placa caliente, frote la superficie con un hisopo de tejido de sala limpia.Retire el chip de la placa Petri. Enjuagar con al menos 100 mililitros de agua desionada. Enjuagar con al menos 100 mililitros de isopropanol, teniendo cuidado de que el disolvente no se seque en la superficie para evitar manchas de evaporación.Enjuagar con al menos 100 mililitros de agua desionada. Seque el chip con una pistola de nitrógeno. Preparar un posterior de 150 micrómetros PDMS girando en un plato Petri.Utilice un bisturí para cortar un marco de aproximadamente 1,5 por 1,5 centímetros de la capa PDMS. Levante el marco del plato Petri con una pinza. Depositarlo plano en un chip limpio y pulido.La muestra ya está lista para la siembra de células. Después de la siembra de la célula, retire el chip del medio. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de líquido de fuera de la cámara PDMS.Retire el fluido actual del interior de la cámara PDMS con una tubería mientras agrega aproximadamente 60 microlitros limpios de PBS al mismo tiempo. Sustituya el PBS por 60 microlitros limpios de PBS y déjelo incubar durante un minuto. Repita el paso anterior, dejándolo incubar durante cinco minutos esta vez.Retire el PBS y sustitúyalo por 60 microlitros de la solución de tinte. Deje que la muestra se incuba durante unos 15 minutos, protegiendola de la luz. Lave la muestra con PBS utilizando el procedimiento descrito anteriormente.Retire el PBS y sustitúyalo por 40 microlitros del búfer de imágenes al mismo tiempo. Coloque un cubreobjetos en la parte superior, evitando que se formen burbujas de aire debajo. Presione suavemente el cubreobjetos contra la cámara de imágenes para eliminar cualquier exceso de medios.Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de medios fuera del cubreobjetos. Limpie el área fuera del cubreobjetos con un hisopo húmedo en agua para evitar cristales formados por residuos de medios de inmersión secos. Esta versión de la configuración consta de tres componentes principales.El microscopio con el soporte del filtro, la fuente de luz blanca, la cámara y el revólver objetivo. La etapa de acoplamiento, que es una etapa piezoeléctrica de tres ejes, con un láser acoplado de fibra, y una lente de acoplamiento. La etapa de muestra, que es una etapa manual de un eje, con punta e inclinación, con un soporte de vacío.Tanto el acoplamiento como la etapa de la muestra se montan en una etapa motorizada de dos ejes para la traslación de la muestra. Coloque el chip en el camión de vacío, con la faceta de acoplamiento hacia el objetivo de acoplamiento. Asegúrese de que el chip esté aproximadamente a una distancia focal del objetivo de acoplamiento.Encienda la bomba de vacío. Encienda el láser a un milivatio. Ajuste aproximadamente la altura de la viruta para que la viga golpee el borde de la misma.Apaga el láser. Encienda la fuente de luz blanca. Elija una lente objetivo de baja ampliación, por ejemplo, un 10x.Enfoque el microscopio en una guía de ondas. Traduzca el microscopio a lo largo de la guía de ondas para ver si está bien alineada con la trayectoria óptica. Mueva el microscopio al borde del acoplamiento.Encienda el láser a un milivatio o menos. Traduzca el microscopio a lo largo del borde de acoplamiento para encontrar la luz láser. Enfoque la viga en el borde de la viruta.Ajuste la etapa de acoplamiento a lo largo de la trayectoria óptica en la dirección que reduce el tamaño del punto del rayo láser hasta que desaparezca. La viga está ahora por encima o por debajo de la superficie de la viruta. Ajuste la altura de la etapa de acoplamiento hasta que el punto de viga vuelva a aparecer y se maximice.Repita los dos pasos anteriores hasta que el láser forme un punto enfocado. Mueva el punto enfocado a la guía de onda de interés. Traduzca el microscopio a una distancia corta del borde para que el punto de haz enfocado ya no sea visible.Apaga la luz blanca. Ajuste el contraste. Si la guía de onda está guiando, la luz dispersa a lo largo de la guía de onda debe ser claramente visible.Ajuste el eje de la etapa de acoplamiento para maximizar la intensidad de la luz dispersa. Apaga el láser. Encienda la luz blanca.Ajuste el contraste si es necesario. Vaya a la región de imágenes. Concéntrese con el objetivo de imagine deseado.Apague la luz blanca. Inserte el filtro de fluorescencia y gire la potencia del láser a un milivatio. Establezca el tiempo de exposición de la cámara en aproximadamente 100 milisegundos.Ajuste el contraste según sea necesario. Asegúrese de que el acoplamiento sigue optimizado. Localice una región de interés para la creación de imágenes.Active el bucle de etapa piezoeléctrica para promediar los nodos. Captura al menos 300 imágenes. Cargue la pila de imágenes capturada en Fiji mediante una pila virtual.En el menú de imágenes de Fiji, elija Stacks y Z Project. Calcule la imagen TIRF eligiendo Tipo de proyección, Intensidad media. Encienda el láser en un milivatio y ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 30 milisegundos.Ajuste el contraste y el enfoque. Aumente la potencia del láser hasta que se observe el parpadeo. Amplíe una pequeña región de la muestra.Ajuste el contraste. Captura algunas imágenes para ver si los parpadeos están bien separados. Ajuste el tiempo de exposición de la cámara para un parpadeo óptimo.Encienda el bucle del escenario piezoeléctrico. Grabe una pila de imágenes de al menos 30.000 fotogramas, dependiendo de la densidad parpadeante. Abra Fiji y cargue la pila dSTORM como imágenes virtuales.Ajuste el contraste si es necesario. Utilice la herramienta rectángulo para seleccionar el área que desea reconstruir. Abra el análisis de Run en el complemento ThunderSTORM en Fiji.Establezca los ajustes básicos de la cámara en ThunderSTORM, correspondientes a su dispositivo. Los parámetros predeterminados restantes suelen ser satisfactorios. Comience la reconstrucción.La lista de localización proporcionada por el software de reconstrucción se filtra para eliminar las localizaciones no específicas. Si es necesario, se aplica una corrección de deriva adicional. La principal diferencia entre las imágenes basadas en chip y las imágenes tradicionales está en la instrumentación y la adquisición de datos.Por lo tanto, la calidad de las imágenes reconstruidas se puede evaluar de la misma manera que una imagen a partir de un microscopio comercial de superconorción. Dado que se utilizan guías de onda multimodo, la imagen resultante podría, sin embargo, exhibir excitación inhomogénea si se recogen muy pocas imágenes. Esto se muestra en el panel a.El aumento de la cantidad de patrones de excitación debe dar lugar a una excitación inhomogénea, como se muestra en el panel b. Aquí hemos imágenes de células endoteliales sinusoidales hepáticas, con membrana plasmática con etiqueta fluorescente. Los paneles a y b son imágenes limitadas por difracción.El panel c muestra una imagen limitada por difracción del inserto en el panel b. El panel d muestra una imagen dSTORM de la misma región. Las células endoteliales sinusoidales hepáticas tienen fenestraciones de tamaño nanométrico en su membrana plasmática, que son claramente visibles en la imagen de superresoría en el panel d.Una de las principales ventajas de la imagen de superresorción basada en chip es el gran campo de visión que es alcanzable. El panel a muestra una imagen dSTORM de 500 micras por 500 micras de gran tamaño de células endoteliales sinusoidales hepáticas con microtubulina etiquetada fluorescentemente. El panel b muestra el inserto magenta del panel a, con imágenes de difracción limitadas y superconorción para la comparación.El panel c muestra el inserto verde del panel a. La resolución de la imagen capturada es de 77 nanómetros. En este video, hemos realizado un gran campo de visión TIRF y dSTORM imágenes de células endoteliales sinusoidales hepáticas utilizando un chip fotónico para la iluminación.Nuestro método es menos complejo, más compacto y más flexible que la forma convencional de realizar TIRF utilizando un objetivo de microscopio de una apertura numérica predeterminada y un campo de visión bajo. La microscopía de localización, como dSTORM, es una de varias técnicas de imágenes de super resolución que hemos explorado utilizando chips fotónicos. Por ejemplo, la luz puede estar mucho más estrechamente confinada dentro de un material de guía de onda óptica de alto índice de refracción de lo que es posible utilizando una lente objetivo de imagen.Esta propiedad de la iluminación de virutas ha encontrado aplicación en el aumento de la resolución del método de microscopía óptica basada en fluctuaciones de intensidad y la microscopía de iluminación estructurada. Además, los chips fotónicos también se benefician de la miniaturización, la rentabilidad y una configuración óptica sencilla. Al ser una tecnología integrada hace que sea compatible con otras funciones ópticas en chip.En conjunto, esto hace posible el retroadaptación en microscopios convencionales limitados por difracción, lo que permite una super-resolución a un bajo costo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Investigación

Bioquímica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Una proteína Preparación método para la identificación de alto rendimiento de proteínas que interactúan con un cofactor nuclear utilizando LC-MS / MS análisis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

Un sistema de purificación de proteínas de alto rendimiento económico y versátil que utiliza un adaptador de placa multicolumna

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

High-Throughput Protein Crystallization via Microdialysis

Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

Understanding the structure-function relationships of macromolecules, such as proteins, at the molecular level is vital for biomedicine and modern drug ...