Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
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我们感谢耶鲁干细胞核心（YSCC）和耶鲁癌症中心（YCC）的帮助。我们感谢金正英博士的神经病理学评论。这项工作得到了康涅狄格州再生医学研究基金、Dimes 的三月和 NHLBI R01HL131793（S.G.K.）、耶鲁癌症中心和耶鲁癌症生物学培训计划 NCI CA193200 （E.B.） 的支持，以及约瑟夫和露西尔·马德里

1. 干细胞维持
<ol><li>根据制造商的说明，在生长因子减少的层上保持H9 hESC（参见材料表，以后简称矩阵）。<ol>
<li>要涂覆一个 6 孔板或一个 10 厘米的盘子，请将 100 μL 的基质与 5.9 mL 的冰冷 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM）/F12 介质相结合。将板包裹在石蜡薄膜中，并在 4°C 下存放过夜。在过量的基质/培养基被吸进后，第二天使用它们进行传交细胞。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以大约每 7 天 1：...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

与其他有机体模型类似，这是一个带有几个警告的人工系统。虽然在整体表达水平上几乎没有批次变化，但单个器官确实表现出差异。例如，Sox-2 阳性区域的位置在每一个有机体中并不相同（图 3）。虽然qPCR适合寻找细胞批次的整体变化，但附加技术，如单细胞RNAaq，将在今后的研究中使用，以逐细胞收集更多信息。这个系统的另一个限制是，它没有像最近的一些研究17、18、19那样，...

由于无数的实际和伦理限制，在研究人脑方面遇到了很大的困难。虽然利用啮齿动物的研究对于我们了解人脑至关重要，但老鼠脑却有许多不同。有趣的是，老鼠的神经元密度至少是灵长类脑3、4的7倍。虽然从进化的角度来看，灵长类动物比啮齿动物更接近人类，但大多数研究人员与它们合作是不现实的。该协议的目的是使用简化且成本较低的方法重新概括人脑的许多重要特征，而无需异质基底膜基质或外源性生长因子，同时保持脑细胞多样性和细胞组织。
Sasai实验室的造形工作使用胚胎体无血清培养法（SFEBq）方法，从信号胚胎干细胞（ESCs）5、6生成二维和三维神经元细胞类型。许多人脑器官方法都遵循了一个相对相似的路径，从信号ESCs7，8。相反，该协议从分离的人类ESCs（hESCs）开始，类似于在电镀步骤9、10之前汤姆森和张实验室的开创性工作的初始步骤，以及Pasca实验室在添加外源性生长因子11之前的大脑有机体协议的初始步骤。基底膜基质（例如，母体凝胶）已用于许多脑器官协议，并已被证明是一个有效的支架8。然而，最常用的基底膜基质基质并非没有并发症，因为它们与未知数量的生长因子共同纯化，在生产过程中分批到批次变异。此外，这些矩阵会使成像复杂化，并增加污染风险和成本。
虽然人脑器官可以用来回答许多问题，但有一定的局限性要记住。首先，从胚胎干细胞开始，器官比老年大脑更类似于不成熟的大脑，因此可能不是老年疾病（如阿尔茨海默氏症）的理想模型。其次，虽然我们的协议发现了前脑、中脑和后脑发育的标记物，这些标记有助于研究治疗或疾病对来自多个大脑区域的细胞的影响，但可以遵循其他协议，以专注于特定的大脑区域13、14。最后，有机体模型的另一个限制是大小，而人脑的平均长度约为167毫米，使用搅拌使大脑器官增长到4毫米8和由该协议形成的器官增长到1-2毫米10周。尽管如此，该协议为研究人类脑组织和多种细胞类型的相互作用提供了重要工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

与胚胎干细胞不同的人脑器官为研究三维系统中多种细胞类型的复杂相互作用提供了独特的机会。在这里，我们提出了一个相对简单和廉价的方法，产生大脑器官。在本协议中，人类多能干细胞被分解成小簇，而不是单个细胞，在基本培养基培养基中生长，没有异质基底膜基质或外源性生长因子，允许内在发育线索形成有机物的生长。这个简单的系统产生多种脑细胞类型，包括胶质和微胶质细胞、干细胞和前脑、中脑和后脑的神经元。该协议生成的有机体还显示了适当的时空组织特征，这些特征通过明场图像、组织学、免疫荧光和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。由于这些有机物含有来自大脑各个部位的细胞类型，它们可用于研究多种疾病。例如，在最近的一篇论文中，我们演示了利用从这个协议生成的有机体来研究缺氧对人脑的影响。这种方法可用于研究一系列其他难以研究的条件，如神经发育障碍、遗传性疾病和神经疾病。

图 1显示了多个时间点的代表性亮场图像，以演示细胞/有机体在协议的不同阶段的外观。hESCs被从组织培养板中取出，分解成小块，并放置在T75超低附着瓶中，在那里形成球体。需要注意的是，这些细胞看起来明亮，大小相似，这些簇的中心没有黑暗的垂死细胞。细胞逐渐断掉bFGF。第5天，他们被安置在神经诱导介质中，在整个文化时期，他们一直留在这种媒介中。虽然随着...

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A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

该协议是作为一种以简化、低成本的方式生产脑器官的方法，没有外源性生长因子或基底膜基质，同时仍然保持脑细胞类型的多样性和细胞组织的许多特征。

一种从人类胚胎干细胞中生成脑器官的静态自导方法

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

人脑器官是研究疾病的重要工具，在一个容易纵的系统中，并结合了人类环境以及多种细胞类型的适当相互作用。该技术可用于研究大脑的许多疾病，包括神经发育障碍、有毒侮辱以及大脑中癌症的生长和治疗。该协议的主要优点是能够产生具有多种神经元细胞类型的高度可重复性脑器官。这是使用一个非常简单的工作流程完成的，大多数实验室可以完成。这些以临时的适当方式生产，不受专门增长因素或未定义的矩阵的影响，因此成为一个非常简单且具有成本效益的系统。首先，将100微升的基质与5.9毫升的冰冷Dulbeco的修改鹰介质或F12介质组合在15毫升锥形管中。用一毫升的膜基质将每孔的孔涂在六孔板中。将盘子包裹在石蜡薄膜中，在摄氏四度下过夜。第二天，从每口井中吸出多余的介质，用 F12 冲洗油井，并在每口井两毫升的 mTeSR1 介质总体积中加入 H9 hESCS。培养细胞从一周到一周。每天供应两毫升 mTeSR1 介质，将板放在 37 摄氏度的低氧培养箱中，并含 5% 氧气和 5% 的二氧化碳。使用玻璃工具从通道之间的培养中去掉区分细胞。每天刷新媒体。细胞应在利用H9细胞进行器官生产前四到六天通过。要通过细胞，首先用DMEM F12介质冲洗细胞，并吸进多余的液体。冲洗后，加入蛋白酶溶液，孵育细胞40分钟，使菌落在井内漂浮。接下来，使用DMEM F12清洗细胞三次，必要时滴定，使碎片变小。然后以大约一比八的比例将细胞分布在四个六孔板上，并将细胞放在培养箱中，每天喂食。四到六天后，细胞达到约80%的汇合。将它们过渡到常规孵化器。将蛋白酶库存溶液稀释至工作浓度，每六井板的 HESCS 中，将一毫升的库存溶液添加到 5 毫升 DMEM 或 F12 介质中。吸气并去除细胞培养培养，然后用蛋白酶溶液覆盖HESCS。将板放在培养箱中 10 到 15 分钟，或直到菌落的边缘四舍五入，并开始从矩阵中分离，但在它们完全四舍五入之前。倾斜板，吸进蛋白酶溶液，用两毫升的DMEM或F12轻轻清洗细胞，每井三次。确保菌落与矩阵保持附着。因此，ES 细胞的片段必须具有适当的大小，因此请确保它们在适当时间内不帕斯。如果他们在那里的时间太短，可能很难冲洗他们，并打破他们分开。如果他们在那里太久， 他们实际上可以只是在洗涤步骤脱落。将大约一至 1.5 毫升的新鲜 mTeSR 介质重新添加到每个孔中，并使用温和的移液将板中的细胞冲洗成 50 毫升的锥形管中。在板内吸气和分配 hESCS，直到达到其原始尺寸的大约 1/30。现在，殖民地群类似于250至350微米大小的碎片。将细胞转移到一个超低附件T75烧瓶中，其中含有30毫升的mTeSR介质，不含bFGF。第二天，倾斜烧瓶，使活细胞池在角落里。如果有大量的细胞粘附在烧瓶底部，请使用 10 毫升移液器将细胞转移到新的烧瓶中。预计头几天死细胞数量会很高。一旦细胞稳定下来，吸气介质和死细胞留下约10毫升的介质包含活细胞，并添加20毫升的低bFGF介质，辅以30毫微克每毫升bFGF。两天后，检查细胞。大多数细胞应该看起来健康和明亮。然而，如果超过三分之一的细胞出现黑暗，倾斜烧瓶，用20毫升的低bFGF介质替换20毫升的介质，并辅以每毫升20毫微克的bFGF。第三天，取出一半的介质，用15毫升的HESC介质代替每毫升bFGF10毫微克。第五天，用15毫升的神经感应介质替换一半的介质。之后，每隔一天，用神经感应介质替换一半的介质。培养三周后，如果需要，在最终浓度为 1 倍时，将 100 倍青霉素-链霉素添加到介质中。每隔一天刷新一半的媒体。在这个协议中，形成的大脑器官看起来明亮和大小相似，没有黑暗垂死的细胞在这些集群的中心。细胞逐渐从bFGF中分离开。在第五天，他们被放入神经诱导介质，他们在整个文化时期都留在这种介质中。虽然器官随着时间的推移变得更大，因此更暗，神经玫瑰花环状结构扩大，这表明神经分化的开始，并包含胚胎神经管的特征。为了更深入地研究细胞内的基因表达，进行了qPCR分析。谷氨酸运输器VLGUT1在两个半星期内表达，在五周时增加，并在五个月的培养中保持一致。前脑标记Foxg1在低水平表达，直到五个星期的文化。深层标记 Tbr1 的峰值大约五周，随后下降。而上层标记Satb2、腹角标记Eng1、后脑脊髓标记Hoxb4以及寡头细胞标记Olilig2的表达则随着时间的推移而增加。相比之下，干细胞标记Sox2会随着时间的流逝而减少。胶质标记GFAP在五周达到顶峰，随后保持相对稳定。在早期器官处理 ES 细胞时，请记得小心谨慎，以避免在没有抗生素的情况下生长时受到污染，并记得按计划进食。按照这个程序，您可以使用定量RT-PCR基因表达和免疫荧光等技术来评估器官，用于蛋白质表达和定位。利用这项技术，我们能够研究小分子缓解人类新生儿缺氧损伤方面的能力，如缺氧室的模型。重要的一点，这些人脑器官的行为类似于体内小鼠实验。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

生成CRISPR / Cas9介导的单等位基因缺失来研究小鼠胚胎干细胞功能增强

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

科研

发育生物学

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

为内胚层细胞从人类胚胎干细胞系生成的分离纯化一种快速有效的方法

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人胚胎或诱导多能干细胞对视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

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Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

人诱导多能干细胞的前脑型脑 Organoids 标准化和可再生性的生成

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