Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi takker Yale Stem Cell Core (YSCC), og Yale Cancer Center (YCC) for hjælp. Vi takker Dr. Jung Kim for hans neuropatologi anmeldelse. Dette arbejde blev støttet af Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, marts Dimes, og NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center og Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) og en generøs ubegrænset gave fra Joseph og Lucille Madri.

1. Vedligeholdelse af stamceller
<ol><li>Vedligehold H9 HCESCs på et lag af vækstfaktor reduceret kælder membran matrix (se Tabellen over materialer, fremover blot benævnt matrix) i henhold til producentens anvisninger.<ol>
<li>For at belægge en 6-brønds plade eller en 10 cm fad, kombinere 100 μL matrix med 5,9 ml iskold Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) /F12 medier. Wrap plader i paraffin film og opbevares natten over ved 4 °C. Brug dem næste dag til passaging celler efter den overs...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

Svarende til andre organoid modeller, dette er et kunstigt system, der kommer med flere forbehold. Selv om der var lidt batch til batch variation i form af generelle udtrykniveauer, individuelle organoider viste forskelle. F.eks. var placeringen af Sox-2-positive områder ikke identisk i alle organoider (figur 3). Mens qPCR er egnet til at lede efter generelle ændringer i partier af celler, yderligere teknikker såsom enkelt celle RNAseq vil blive udnyttet i fremtidige undersøgelser til at indsamle fle...

På grund af utallige praktiske og etiske begrænsninger har der været store problemer med at studere den menneskelige hjerne. Mens undersøgelser udnytte gnavere har været afgørende for vores forståelse af den menneskelige hjerne, musen hjernen har mange forskelle1,2. Interessant, mus har en neuronal tæthed, der er mindst 7 gange mindre end primat hjernen3,4. Selv om primater er tættere på mennesker end gnavere fra et evolutionært synspunkt, er det ikke praktisk for de fleste forskere at arbejde med dem. Formålet med denne protokol var at opsummere mange vigtige træk ved den menneskelige hjerne ved hjælp af en forenklet og billigere metode uden behov for en heterolog kælder membran matrix eller udefrakommende vækstfaktorer og samtidig opretholde hjernecelle mangfoldighed og cellulære organisation.
Formative arbejde fra Sasai lab brugt serum fri kultur embryoid organer (SFEBq) metode til at generere to- og tre-dimensionelle neuronal celletyper fra signalerede embryonale stamceller (EFC)5,6. Mange menneskelige hjerne organoid metoder har fulgt en forholdsvis lignende vej fra signalerede ECs7,8. I modsætning hertil starter denne protokol med klynger af fritliggende menneskelige EPC'er (HC'er), svarende til de første trin i skelsættende arbejde i Thomson og Zhang laboratorier forud for plating trin9,10 samt det første skridt i hjernen organoid protokol pasca laboratorium før tilsætning af udefrakommende vækstfaktorer11. Kælder membran matricer (f.eks matrigel) er blevet udnyttet i mange hjernen organoid protokoller, og det har vist sig at være en effektiv stillads8. Men, mest almindeligt anvendte kælder membran matricer ikke kommer uden komplikationer, da de co-rense med ukendte mængder af vækstfaktorer med parti til batch variation under produktionen12. Desuden kan disse matricer komplicere billeddannelse, og øge risikoen for forurening og omkostninger.
Mens menneskelige hjerne organoids kan bruges til at besvare mange spørgsmål, der er visse begrænsninger at huske på. For det første, startende fra embryonale stamceller, organoider mere ligner umodne hjerner end alderen hjerner og som sådan kan ikke være ideelle modeller for sygdomme, der opstår i alderdommen, ligesom Alzheimers sygdom. For det andet, mens vores protokol fundet markører for forhjernen, midthjernen og hindbrain udvikling, som er nyttige til at studere effekten af en behandling eller sygdom på celler fra flere hjerne regioner i koncert, andre protokoller kan følges for at koncentrere sig om specifikke hjerne regioner13,14. Endelig, en anden begrænsning af organoid modeller er, at størrelse, mens den gennemsnitlige længde af en menneskelig hjerne ca 167 mm, hjernen organoids lavet ved brug af agitation vokse op til 4 mm8 og organoider dannet af denne protokol vokse til 1-2 mm ved 10 uger. Ikke desto mindre, denne protokol giver et vigtigt værktøj til at studere menneskelige hjernevæv og samspillet mellem flere celletyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Menneskelige hjerne organoider differentieret fra embryonale stamceller giver en enestående mulighed for at studere komplicerede interaktioner af flere celletyper i et tredimensionelt system. Her præsenterer vi en relativt ligetil og billig metode, der giver hjernen organoids. I denne protokol nedbrydes humane pluripotente stamceller i små klynger i stedet for enkelte celler og dyrkes i grundlæggende medier uden en heterolog kældermembranmatrix eller udefrakommende vækstfaktorer, hvilket gør det muligt for de iboende udviklingssignaler at forme organoid vækst. Dette enkle system producerer en mangfoldighed af hjernecelletyper, herunder glia- og mikroglielle celler, stamceller og neuroner i forhjernen, midthjernen og baghjernen. Organoider genereret fra denne protokol viser også kendetegnende for passende tidsmæssige og rumlige organisation demonstreret af brightfield billeder, histologi, immunfluorescens og real-time kvantitative omvendt transskription polymerase kædereaktion ( qRT-PCR). Fordi disse organoids indeholder celletyper fra forskellige dele af hjernen, kan de udnyttes til at studere et væld af sygdomme. For eksempel, i et nyligt papir, vi viste brugen af organoider genereret fra denne protokol til at studere virkningerne af hypoxi på den menneskelige hjerne. Denne tilgang kan bruges til at undersøge en række ellers vanskelige at studere tilstande som neurodevelopmental handicap, genetiske sygdomme, og neurologiske sygdomme.

Figur 1 viser repræsentative brightfield billeder af flere tidspunkter for at demonstrere, hvordan cellerne / organoider ser ud i de forskellige faser af protokollen. Hcipc'erne blev fjernet fra vævskulturpladen, opdelt i små stykker og placeret i en T75 ultralav fastgørelseskolbe, hvor de dannede kugler. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ser lyse og lignende i størrelse, uden mørke, døende celler i midten af disse klynger. Cellerne blev gradvist vænnet fra bFGF. På dag 5 blev...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Denne protokol blev genereret som et middel til at producere hjernen organoids i en forenklet, lav pris måde uden udefrakommende vækstfaktorer eller kælder membran matrix og samtidig opretholde mangfoldigheden af hjernecelletyper og mange funktioner i cellulære organisation.

En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Menneskelige hjerne organoider er et vigtigt redskab til at studere sygdom i et system, der er let manipuleres og inkorporerer en menneskelig indstilling og passende interaktion af flere celletyper. Denne teknik kan anvendes til at studere mange sygdomme i hjernen, herunder neurodevelopmental lidelser, giftige fornærmelser, og vækst og behandling af kræft i hjernen. Den største fordel ved denne protokol er evnen til at generere meget reproducerbare hjerneorganoider med en bred vifte af neuronale celletyper.Dette gøres ved hjælp af en meget forenklet arbejdsgang, der kunne opnås ved de fleste laboratorier. Og disse er produceret på en midlertidig passende måde uden indflydelse fra specialiserede vækstfaktorer eller udefinerede matricer gør det til et meget simpelt og omkostningseffektivt system. Til at begynde, kombinere 100 mikroliter af matrix med 5,9 milliliter iskold Dulbecco's Modified Eagle Medium eller F12 medier i en 15 milliliter konisk rør.Coat hver brønd i en seks-brønd plade med en milliliter af membranen matrix. Wrap pladen i paraffin film og gemme natten over på fire grader Celsius. Den næste dag, aspirere overskydende medier fra hver brønd, skyl brøndene med F12, og tilsæt H9 HESCS i et samlet volumen på to milliliter mTeSR1 medier pr brønd.Kultur cellerne fra uge til uge. Tilførsel dagligt med to milliliter mTeSR1-medier og placer pladen i en 37 grader Celsius lav ilt inkubator med 5% ilt og 5% kuldioxid. Brug glasværktøj til at frasle adskiller celler fra kulturen mellem passager.Opdater mediet dagligt. Celler skal passages fire til seks dage før udnyttelse af H9 celler til organoid produktion. For at passage cellerne, start med at skylle dem med DMEM F12 medier og aspirere den overskydende væske.Efter skylning, tilsæt protease opløsning og inkubere cellerne i 40 minutter, for kolonier til at flyde i brønden. Dernæst vaskes cellerne tre gange ved hjælp af DMEM F12 og om nødvendigt titrere for at gøre stykkerne mindre. Derefter fordeles cellerne i et omtrentligt en-til-otte forhold over fire seks-brønds plader og læg pladerne i inkubatoren og fodres dagligt.Efter fire til seks dage når cellerne ca. 80% sammenløb. Overtrør dem til en almindelig kuvøse. Proteasebestandopløsningen fortyndes til en arbejdskoncentration ved at tilsætte en milliliter stamopløsning til fem milliliter DMEM eller F12-medium pr. hver seks-brønds plade af hESCS.Aspirere og fjern cellekulturmediet, og dæk derefter hESCS med proteaseopløsningen. Anbring pladerne i inkubatoren i 10 til 15 minutter, eller indtil koloniernes kanter rundes op og begynder at adskille sig fra matrixen, men før de rundes helt op. Vip pladen, aspirere proteaseopløsningen, og vask forsigtigt cellerne med to milliliter DMEM eller F12 for hver brønd tre gange.Sørg for, at kolonierne forbliver knyttet til matrixen. Så det er afgørende, at stykkerne af ES-celler er i den rette størrelse, så sørg for, at de er i dispase for den rette mængde tid. Hvis de er derinde for kort tid, kan det være meget svært at skylle dem ud og bryde dem fra hinanden.Og hvis de er derinde for længe, kan de faktisk bare komme ud under vasketrinnene. Tilsæt ca. 1 til 1,5 milliliter frisk mTeSR-medier til hver brønd, og skyl cellerne af pladen i et 50 milliliter konisk rør ved hjælp af skånsom pipettering. Indsugning og dispenser hESCS i pladen, indtil de når ca. 1/30 af deres oprindelige størrelse.Nu koloni klynger ligner 250 til 350 mikrometer mellemstore stykker. Cellerne overføres til en enkelt ultralav fastgørelse T75-kolbe, der indeholder 30 milliliter mTeSR-medier uden bFGF. Den næste dag, vip kolben, således at de levende celler pool i hjørnet.Hvis der er et stort antal celler, der har tilklæbet bunden af kolben, skal der anvendes en 10 milliliterpipette til at overføre cellerne til en ny kolbe. Forvent at have en høj befolkning af døde celler for de første par dage. Når cellerne bosætte sig, aspirere medierne og døde celler forlader omkring 10 milliliter af medier, der indeholder de levende celler og tilføje 20 milliliter lav bFGF medier suppleret med 30 nanogram per milliliter bFGF.Efter to dage skal du kontrollere cellerne. De fleste af cellerne skal se sunde og lyse. Hvis mere end en tredjedel af cellerne forekommer mørke, vippes kolben og erstattes 20 milliliter medier med 20 milliliter lavt bFGF-medie suppleret med 20 nanogram pr. milliliter bFGF.På dag tre fjernes halvdelen af mediet og erstattes med 15 milliliter hESC-medier suppleret med 10 nanogram pr. milliliter bFGF. På dag fem, erstatte halvdelen af medierne med 15 milliliter neurale induktion medier. Efter at hver anden dag, erstatte halvdelen af mediet med neurale induktion medier.Efter tre uger i kultur, tilføje 100X Penicillin-Streptomycin til medierne ved en endelig koncentration på 1X, hvis det ønskes. Genopfrisk halvdelen af mediet hver anden dag. I denne protokol, de dannede hjerne organoider så lyse og lignende i størrelse uden mørke døende celler i centrene for disse klynger.Cellerne blev gradvist vænnet fra bFGF. På dag fem, blev de placeret i neurale induktion medier, og de forblev i dette medie i hele kulturperioden. Selv om organoider fik større og dermed mørkere over tid, den neurale roset-lignende strukturer udvidet som indikerer indledningen af neurale differentiering og indeholder funktioner i embryonale neurale rør.For at tage et mere dybdegående kig på genekspressionen i cellerne blev qPCR-analyse udført. Glutamattransporteren VLGUT1 blev udtrykt på to en halv uge, steg med fem uger og forblev konsekvent gennem fem måneders kultur. En forhjerne markør Foxg1 blev udtrykt på lave niveauer indtil fem uger i kultur.Det dybe lag markør Tbr1 toppede omkring fem uger og faldt efterfølgende. Mens udtrykket af det øverste lag markør Satb2, den ventrale markør Eng1, hindbrain rygmarvsmarkør Hoxb4, samt oligodendrocyte markør Olig2 alle steget over tid. I modsætning hertil faldt stamcellemarkøren Sox2 over tid.GFAP's gliamarkør toppede i fem uger og forblev relativt konstant efterfølgende. Husk at være yderst forsigtig, når du håndterer ES-celler i tidlige organoider for at undgå forurening, da de dyrkes uden antibiotika og også huske at fodre i henhold til tidsplanen. Efter denne procedure kan du evaluere organoiderne ved hjælp af teknikker som kvantitativ RT-PCR for genekspression og immunfluorescens for proteinudtryk og lokalisering.Ved hjælp af denne teknik, vi var i stand til at studere evne til et lille molekyle til at lindre aspekter af menneskelige neonatal hypoxisk skade som modelleret i en hypoxi kammer. Det er bemærkelsesværdigt, at disse menneskelige hjerneorganoider opførte sig på samme måde som in vivo museeksperimenter.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 Mediated monoallelisk Sletninger til Studieinformationen Enhancer funktion i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En hurtig og effektiv metode til rensning af endoderm celler Genereret fra menneskelige embryonale stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering Transplantation-egnet retinale Pigment epitelvæv stammer fra menneskelige embryonale stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation og kultur af lingualorganoider afledt af voksne musesmag stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En forenklet metode til generering af nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Etablering af organoider fra menneskelig tand som et kraftfuldt værktøj mod mekanistisk forskning og regenerativ terapi

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...