Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

אנו מודים לליבת תאי הגזע של ייל (YSCC), ומרכז הסרטן של ייל (YCC) לסיוע. אנחנו מודים לד ר יונג קים. על סקירת הנוירופתולוגיה שלו עבודה זו נתמכה על ידי הרפואה הרגנרטיבית של קונטיקט הקרן, מארס של מטבעות המלך, ו nhlbi R01HL131793 (S.G.K.), מרכז הסרטן של ייל ואת אוניברסיטת ייל ביולוגיה אימון תוכנית nci CA193200 (אי) ומתנה נדיבה מוגבלת של יוסף ו . לוסיל מאסי

1. תחזוקת תאי גזע
<ol><li>לשמור על H9 hESCs על שכבה של גורם צמיחה מופחתת מטריקס קרום המרתף (לראות את הטבלה של חומרים, מעתה ואילך פשוט המכונה מטריצה) על פי הוראות היצרן.<ol>
<li>כדי לחלוק את אחד 6-באר צלחת או 1 10 ס"מ צלחת, לשלב 100 μL של מטריקס עם 5.9 mL של מדיום שונה של הקרח הקרה של Dulbecco (DMEM)/F12 מדיה. לוחו?...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

בדומה למודלים אורגנואיד אחרים, זוהי מערכת מלאכותית המגיעה עם מספר אזהרות. למרות שהיה אצווה קטנה וריאציה אצווה במונחים של רמות הביטוי הכולל, אורגנואידים בודדים הראו הבדלים. לדוגמה, המיקום של האזורים החיוביים של סוקס-2 לא היה זהה בכל אורגנואיד (איור 3). בעוד qPCR מתאים לחפש שינויים כול?...

בשל מגבלות מעשיות ואתיות רבות, יש קושי רב בלימוד המוח האנושי. בעוד מחקרים ניצול מכרסמים היו קריטיים להבנה שלנו של המוח האנושי, המוח העכבר יש הרבה וני1,2. מעניין, עכברים יש צפיפות עצבית כי הוא לפחות 7 פעמים פחות מאשר המוח הפרימטים3,4. למרות הפרימטים קרובים יותר לבני אדם מאשר מכרסמים מבחינה אבולוציונית, זה לא מעשי עבור רוב החוקרים לעבוד איתם. המטרה של פרוטוקול זה היתה לסכם תכונות חשובות רבות של המוח האנושי באמצעות שיטה פשוטה וזולה יותר ללא צורך במרתף הטרוולוגי מטריקס קרום או גורמי צמיחה אקסוגני תוך שמירה על מגוון תאי המוח וארגון הסלולר.
עבודת המעצבים מן המעבדה sasai בשימוש סרום חופשי התרבות של embryoid גופים (sfebq) שיטה לייצר שני ותלת מימדי התאים העצביים מתאי גזע עובריים (escs)5,6. הרבה שיטות של אורגנואיד של המוח האנושי הלכו בדרך דומה יחסית של escs7,8. לעומת זאת, פרוטוקול זה מתחיל עם אשכולות של escs האדם הפרטי (hESCs), בדומה לשלבים הראשוניים של עבודה הזרע של מעבדות תומסון ו ג'אנג לפני שלבי הציפוי9,10 , כמו גם את השלב ההתחלתי של פרוטוקול המוח אורגנואיד של המעבדה pasca לפני התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני11. מטריצות קרום מרתף (למשל, מטריצות) כבר נוצלו בפרוטוקולים מאורגאיד של המוח הרבים וזה הוכח להיות הגרדום האפקטיבי8. עם זאת, הנפוץ ביותר מטריצות קרום המרתף לא בא ללא סיבוכים כפי שהם שיתוף לטהר עם כמויות לא ידועות של גורמי גדילה עם אצווה לשונות אצווה במהלך הייצור12. בנוסף, מטריצות אלה יכולים לסבך את ההדמיה, ולהגדיל את הסיכון של זיהום ועלות.
בעוד מאורגנואידים המוח האנושי יכול לשמש כדי לענות על שאלות רבות, יש מגבלות מסוימות לזכור. עבור אחד, החל בתאי גזע עובריים, אורגנואידים דומה יותר למוח בוגר מאשר המוחות הישנים וככזה לא יכול להיות מודלים אידיאליים עבור מחלות המתרחשות בגיל הזקנה, כמו מחלת אלצהיימר. שנית, בעוד הפרוטוקול שלנו מצאו סמנים של המוח הקדמי, אמצע המוח התפתחות המוח אשר שימושיים כדי ללמוד את ההשפעה של טיפול או מחלה על תאים מאזורי מוח מרובים בהופעה, ניתן לעקוב אחר פרוטוקולים אחרים כדי להתרכז באזורי מוח ספציפיים13,14. לבסוף, הגבלה נוספת של מודלים אורגנואיד הוא זה של גודל, בעוד האורך הממוצע של המוח האנושי כ 167 מ"מ, אורגנואידים המוח עשה עם שימוש של עצבנות לגדול עד 4 מ"מ8 ואת האורגנואידים שנוצר על ידי פרוטוקול זה לגדול ל 1-2 מ"מ ידי 10 שבועות. למרות זאת, פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר רקמת המוח האנושי והאינטראקציה של סוגי תאים מרובים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

אורגנואידים המוח האנושי הבדיל מתאי גזע עובריים להציע את ההזדמנות הייחודית לחקור אינטראקציות מסובכות של סוגי תאים מרובים במערכת תלת ממדית. כאן אנו מציגים שיטה ברורה יחסית וזולה אשר מפיקה אורגנואידים במוח. בפרוטוקול זה האדם בתאי גזע רב עוצמה מנותקים לאשכולות קטנים במקום תאים בודדים גדל במדיה בסיסית ללא מטריצה הטרוולוגי מטריקס מטריצות או גורמי גדילה אקסוגניים, המאפשר רמזים התפתחותיים מהותי כדי לעצב את ה גידול של אורגאיד. מערכת פשוטה זו מייצרת מגוון של סוגי תאי המוח כולל התאים גליה ו microglial, בתאי גזע, ונוירונים של המוח הקדמי, אמצע המוח, ו הראש. אורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה גם להציג את הסימנים של הזמן המתאים וארגון מרחבית הפגינו על ידי תמונות ברייטפילד, היסטולוגיה, immunofluorescence ובזמן אמת הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( רביעיית-PCR). מכיוון שאורגנואידים אלה מכילים סוגי תאים מחלקים שונים של המוח, הם יכולים להיות מנוצלים ללימוד מספר רב של מחלות. לדוגמה, במאמר האחרון הדגמנו את השימוש באורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה לחקר ההשפעות של היפוקסיה על המוח האנושי. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור מערך של קשה אחרת ללמוד תנאים כגון מגבלות נוירולוגיים, הפרעות גנטיות, ומחלות נוירולוגיות.

איור 1 מציג נציג ברייטפילד תמונות של מספר נקודות זמן כדי להדגים מה התאים/האורגנואידים נראים כמו בכל השלבים השונים של הפרוטוקול. HESCs הוסרו מלוח התרבות רקמה, שבור לחתיכות קטנות, והניח בתוך T75 מצורף אולטרה נמוך בקבוקון שבו הם יצרו כדורים. חשוב לציין כי התאים נראים בהירים ודומים...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

אורגנואידים במוח האנושי הם כלי משמעותי לחקר מחלות במערכת כי הוא מניפולציה בקלות ומשלב הגדרה אנושית ואת האינטראקציה המתאימה של סוגי תאים מרובים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור מחלות רבות של המוח, כולל הפרעות נוירו-התפתחותיות, עלבונות רעילים, ואת הצמיחה והטיפול בסרטן במוח. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת ליצור אורגנואידים במוח לשחזור מאוד עם מגוון רחב של סוגי תאים עצביים.פעולה זו נעשית באמצעות זרימת עבודה פשטנית מאוד שיכולה להתבצע על ידי רוב המעבדות. ואלה מיוצרים באופן זמני מתאים ללא השפעה מגורמי גדילה מיוחדים או מטריסות לא מוגדרות מה שהופך אותו למערכת פשוטה מאוד וחסכונית. כדי להתחיל, לשלב 100 microliters של מטריצה עם 5.9 מיליליטר של קר קרח של Dulbecco של נשר בינוני או F12 מדיה בצינור חרוט 15 מיליליטר.מצפים כל באר בצלחת של שש בארות עם מיליליטר אחד של מטריצת הממברנה. עוטפים את הצלחת בסרט פרפין ומאחסנים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו מדיה עודפת מכל באר, שטפו את הבארות עם F12, והוסיפו H9 hESCS בנפח כולל של שני מיליליטר של מדיית mTeSR1 ל הבאר.תרבו את התאים משבוע לשבוע. אספקה יומית עם שני מיליליטר של מדיה mTeSR1 ולהצבת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס חממת חמצן נמוכה עם 5%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני. השתמש בכלי זכוכית כדי להפוך את התאים המשלמים מן התרבות בין קטעים.רענן את המדיה מדי יום. תאים יש לעבור ארבעה עד שישה ימים לפני ניצול תאי H9 לייצור אורגנואידים. כדי לעבור את התאים, להתחיל על ידי שטיפה אותם עם מדיה DMEM F12 ושאיפת הנוזל העודף.לאחר שטיפה, מוסיפים פתרון פרוטאז ו דגירה את התאים במשך 40 דקות על מנת מושבות לצוף בתוך הבאר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות DMEM F12 ואם יש צורך titrate כדי להפוך את החלקים קטנים יותר. לאחר מכן להפיץ את התאים ביחס משוער של 1 עד 8 על פני ארבע צלחות שש בארות ולמקם את הצלחות באינקובטור ולהאכיל מדי יום.לאחר ארבעה עד שישה ימים, התאים מגיעים לכ-80%. להעביר אותם לאנקובטור רגיל. לדלל את פתרון מלאי פרוטאז לריכוז עובד על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון המלאי לחמישה מיליליטר של DMEM או F12 בינוני לכל צלחת שש באר של hESCS.שאף והסר את המדיה של תרבות התאים, ולאחר מכן לכסות את hESCS עם פתרון פרוטאז. מניחים את הצלחות באינקובטור במשך 10 עד 15 דקות או עד שקצוות המושבות מתעגלים ומתחילים להיפרד מהמטריצה אך לפני שהם מתעגלים לחלוטין. להטות את הצלחת, שאפו את פתרון הפרוטאז, ושטפו בעדינות את התאים עם שני מיליליטר של DMEM או F12 עבור כל באר שלוש פעמים.תוודא שהמושבות נשארות מחוברות למטריצה. אז זה קריטי כי חתיכות של תאי ES נמצאים בגודל המתאים כדי לוודא שהם dispase עבור כמות הזמן המתאימה. אם הם שם לזמן קצר מדי, זה יכול להיות מאוד קשה לשטוף אותם ולשבור אותם לגזרים.ואם הם שם יותר מדי זמן, הם יכולים פשוט לרדת במהלך מדרגות הכביסה. הוסף בחזרה על אחד עד 1.5 מיליליטר של מדיה mTeSR טרי לכל באר לשטוף את התאים מהצלחת לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר באמצעות צינורות עדינים. שאפו ופונו hESCS בתוך הצלחת עד שהם מגיעים כ 1/30th של גודלם המקורי.עכשיו צבירי המושבה דומים ל-250 עד 350 חתיכות בגודל מיקרומטר. העבר את התאים לבקבוק T75 יחיד עם קובץ מצורף נמוך במיוחד המכיל 30 מיליליטר של מדיית mTeSR ללא bFGF. למחרת, להטות את הבקבוק כך תאים חיים בריכה בפינה.אם יש מספר גדול של תאים שדבקו בתחתית הבקבוק, השתמש בפיפיטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את התאים לבקבוקון חדש. צפו לאוכלוסייה גבוהה של תאים מתים בימים הראשונים. לאחר התאים להתיישב, שאפו את התקשורת ותאים מתים עוזב על 10 מיליליטר של מדיה המכילה את התאים החיים ולהוסיף 20 מיליליטר של מדיה bFGF נמוך בתוספת 30 ננוגרם למיליליטר של bFGF.אחרי יומיים, תבדקו את התאים. רוב התאים צריכים להיראות בריאים ובהירים. עם זאת, אם יותר משליש מהתאים נראים כהים, להטות את הבקבוק ולהחליף 20 מיליליטר של מדיה עם 20 מיליליטר של מדיה bFGF נמוך בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של bFGF.ביום השלישי, להסיר מחצית המדיה ולהחליף עם 15 מיליליטר של מדיה hESC בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של bFGF. ביום החמישי, החלף מחצית מהתקשורת ב-15 מיליליטר של תקשורת אינדוקציה עצבית. לאחר מכן, כל יומיים, החלף חצי מהמדיום במדיה אינדוקציה עצבית.לאחר שלושה שבועות בתרבות, להוסיף 100X פניצילין-סטרפטומיצין לתקשורת בריכוז סופי של 1X אם תרצה. רענן חצי מהמדיה כל יומיים. בפרוטוקול זה, האורגנואידים במוח שנוצרו נראו בהירים ודומים בגודלם ללא תאים גוססים כהים במרכזי אשכולות אלה.התאים נאנקו בהדרגה מ- bFGF. ביום החמישי, הם הוכנסו לתקשורת אינדוקציה עצבית והם נשארו בתקשורת זו לאורך כל תקופת התרבות. למרות האורגנואידים גדל ובכך כהה יותר לאורך זמן, מבנים דמויי רוזט עצבי התרחב אשר מציין את החניכה של הבחנה עצבית ומכיל תכונות של הצינור העצבי העוברי.כדי להעיף מבט מעמיק יותר על ביטוי הגן בתוך התאים, בוצע ניתוח qPCR. טרנספורטר גלוטמט VLGUT1 בא לידי ביטוי בשבועיים וחצי, גדל בחמישה שבועות, ונשאר עקבי לאורך חמישה חודשים של תרבות. סמן forebrain Foxg1 בא לידי ביטוי ברמות נמוכות עד חמישה שבועות בתרבות.סמן השכבה העמוקה Tbr1 הגיע לשיאו בסביבות חמישה שבועות והצטמצם לאחר מכן. בעוד הביטוי של סמן השכבה העליונה Satb2, סמן הגחון Eng1, סמן חוט השדרה האחורי Hoxb4, כמו גם סמן אוליגודנדרוציטים Olig2 כל גדל עם הזמן. לעומת זאת, סמן תאי הגזע Sox2 ירד עם הזמן.סמן הגלישה GFAP הגיע לשיאו בחמישה שבועות ונשאר קבוע יחסית לאחר מכן. זכור לקחת את הטיפול המרבי בעת טיפול בתאי ES באורגנואידים בשלב מוקדם כדי למנוע זיהום כפי שהם גדלים ללא אנטיביוטיקה וגם לזכור להאכיל על פי לוח הזמנים. בעקבות הליך זה, אתה יכול להעריך את האורגנואידים באמצעות טכניקות כגון RT-PCR כמותי עבור ביטוי גנים immunofluorescence עבור ביטוי חלבון לוקליזציה.באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לחקור את היכולת של מולקולה קטנה כדי להקל על היבטים של פגיעה היפוקסית יילודים אנושי כמו מודל בתא היפוקסיה. זה משמעותי כי אלה אורגנואידים המוח האנושי התנהג באופן דומה בניסויים עכבר vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

שיטה פשוטה ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

ביסוס אורגנואידים מהשן האנושית ככלי רב עוצמה לקראת מחקר מכניסטי וטיפול רגנרטיבי

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...