Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

हम सहायता के लिए येल स्टेम सेल कोर (वाईसीसी), और येल कैंसर सेंटर (वाईसीसी) का शुक्रिया अदा करते हैं । हम डॉ जंग किम को उनकी न्यूरोपैथोलॉजी समीक्षा के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम को कनेक्टिकट पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान कोष, मार्च ऑफ डिम्स, और NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), येल कैंसर केंद्र और येल कैंसर जीव विज्ञान प्रशिक्षण कार्यक्रम NCI CA193200 (E.B.) और यूसुफ और यूसुफ से एक उदार अप्रतिबंधित उपहार द्वारा समर्थित किया गया था और ल्यूसिले माद्री।

1. स्टेम सेल रखरखाव
<ol><li>विकास कारक की एक परत पर H9 hESCs बनाए रखें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कम (सामग्री की मेजदेखें, अब से बस मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) निर्माता के निर्देशों के अनुसार ।<ol>
<li>एक 6-अच्छी ?...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

अन्य ऑर्गेनोइड मॉडल के समान, यह एक कृत्रिम प्रणाली है जो कई चेतावनी के साथ आती है। यद्यपि समग्र अभिव्यक्ति के स्तर के संदर्भ में बैच भिन्नता के लिए थोड़ा बैच था, व्यक्तिगत ऑर्गेनॉइड ने मतभेदों को प्रदर?...

असंख्य व्यावहारिक और नैतिक सीमाओं के कारण मानव मस्तिष्क का अध्ययन करने में काफी कठिनाई हुई है । जबकि कृंतक का उपयोग अध्ययन मानव मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण रहा है, माउस मस्तिष्क में कई विसंगतियांहैं1,2। दिलचस्प बात यह है कि चूहों में एक न्यूरोनल घनत्व होता है जो रहनुमा मस्तिष्क3,4से कम 7 गुना कम होता है। हालांकि वानरों एक विकासवादी दृष्टिकोण से कृंतक की तुलना में मनुष्यों के करीब हैं, यह ज्यादातर शोधकर्ताओं के लिए व्यावहारिक नहीं है उनके साथ काम करते हैं । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य मस्तिष्क कोशिका विविधता और सेलुलर संगठन को बनाए रखते हुए विषमलोगोस बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स या एक्सोजेनस विकास कारकों की आवश्यकता के बिना एक सरलीकृत और कम महंगी विधि का उपयोग करके मानव मस्तिष्क की कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को फिर से तैयार करना था।
ससाई प्रयोगशाला से प्रारंभिक कार्य ने सिग्नलीकृत भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी)5,6से दो और त्रि-आयामी न्यूरोनल सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए भ्रूणीय निकायों (SFEBq) विधि की सीरम मुक्त संस्कृति का उपयोग किया। कई मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड तरीकों ने सिग्नल्ड ईएससी7,8से अपेक्षाकृत समान मार्ग का अनुसरण किया है । इसके विपरीत, यह प्रोटोकॉल अलग मानव ESCs (hESCs) के समूहों के साथ शुरू होता है, जो चढ़ाना चरण9,10 से पहले थॉमसन और झांग प्रयोगशालाओं के मौलिक काम के प्रारंभिक चरणों के समान हैऔरसाथ ही बहिर्जात विकास कारकों के अलावा11से पहले पास्का प्रयोगशाला के मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरण के समान है । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिस (उदाहरण के लिए, मैट्रिक्स) का उपयोग कई मस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल में किया गया है और इसे एक प्रभावी पाड़8दिखाया गया है। हालांकि, सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तहखाने झिल्ली मैट्रिस जटिलताओं के बिना नहीं आते हैं क्योंकि वे उत्पादन12के दौरान बैच परिवर्तनशीलता के लिए बैच के साथ विकास कारकों की अज्ञात मात्रा के साथ सह-शुद्ध होते हैं। इसके अलावा, ये मैट्रिस इमेजिंग को जटिल बना सकते हैं, और संदूषण और लागत के जोखिम को बढ़ा सकते हैं।
जबकि मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उपयोग कई सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है, ध्यान में रखने के लिए कुछ सीमाएं हैं। एक के लिए, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से शुरू, ऑर्गेनोइड अधिक बारीकी से वृद्ध दिमाग की तुलना में अपरिपक्व दिमाग के समान है और इस तरह अल्जाइमर रोग की तरह बुढ़ापे में होने वाली बीमारियों के लिए आदर्श मॉडल नहीं हो सकता है । दूसरा, जबकि हमारे प्रोटोकॉल में फोरब्रेन, मिडब्रेन और हिंदब्रेन विकास के मार्कर मिले जो संगीत कार्यक्रम में कई मस्तिष्क क्षेत्रों से कोशिकाओं पर उपचार या बीमारी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हैं, अन्य प्रोटोकॉल विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों13,14पर ध्यान केंद्रित करने के लिए पालन किया जा सकता है। अंत में, ऑर्गेनॉइड मॉडल की एक और सीमा आकार की है, जबकि मानव मस्तिष्क की औसत लंबाई लगभग 167 मिमी, आंदोलन के उपयोग के साथ बने मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड 4 मिमी8 तक बढ़ते हैं और इस प्रोटोकॉल द्वारा गठित ऑर्गेनॉइड 10 सप्ताह तक 1-2 मिमी तक बढ़ जाते हैं। फिर भी, यह प्रोटोकॉल मानव मस्तिष्क के ऊतकों और कई कोशिका प्रकारों की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से विभेदित मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड त्रि-आयामी प्रणाली में कई कोशिका प्रकारों की जटिल बातचीत का अध्ययन करने का अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। यहां हम एक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती विधि पेश करते हैं जो मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड की पैदावार करता है। इस प्रोटोकॉल में मानव pluripotent स्टेम सेल एकल कोशिकाओं के बजाय छोटे समूहों में टूट रहे है और एक विषमलोगोस तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या बहिर्जात विकास कारकों के बिना बुनियादी मीडिया में उगाया जाता है, आंतरिक विकास संकेतों को आकार देने की अनुमति ऑर्गेनोइड का विकास। यह सरल प्रणाली मस्तिष्क कोशिकाओं, स्टेम कोशिकाओं, और अग्रमस्तिष्क, मिडब्रेन और हिंदब्रेन के न्यूरॉन्स सहित मस्तिष्क कोशिका प्रकारों की विविधता पैदा करती है। इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनोइड ्स ब्राइटफील्ड छवियों, हिस्टोलॉजी, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन प्रतिक्रिया द्वारा प्रदर्शित उपयुक्त अस्थायी और स्थानिक संगठन की पहचान भी प्रदर्शित करता है ( क्यूआरटी-पीसीआर) । क्योंकि इन ऑर्गेनॉइड में मस्तिष्क के विभिन्न हिस्सों से कोशिका प्रकार होते हैं, इसलिए उनका उपयोग कई बीमारियों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल ही में एक पेपर में हमने मानव मस्तिष्क पर हाइपोक्सिया के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न ऑर्गेनॉइड के उपयोग का प्रदर्शन किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग न्यूरोडेवलपमेंटल बाधाओं, आनुवंशिक विकारों और न्यूरोलॉजिक रोगों जैसी स्थितियों का अध्ययन करने के लिए अन्यथा कठिन की एक सरणी की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 1 कई समय अंक के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों को प्रदर्शित करने के लिए क्या कोशिकाओं/ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के विभिंन चरणों में की तरह दिखते है दिखाता है । एचएसईसी को ऊतक संस्कृति प्लेट...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

यह प्रोटोकॉल अभी भी मस्तिष्क कोशिका प्रकार ों की विविधता और सेलुलर संगठन की कई विशेषताओं को बनाए रखते हुए एक्सोजेनस विकास कारकों या तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बिना एक सरलीकृत, कम लागत वाले तरीके से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करने के साधन के रूप में उत्पन्न किया गया था।

मानव भ्रूण स्टेम सेल से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक स्थिर स्व-निर्देशित विधि

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड एक ऐसी प्रणाली में रोग का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं जो आसानी से हेरफेर किया जाता है और इसमें मानव सेटिंग और कई सेल प्रकारों की उचित बातचीत शामिल होती है। इस तकनीक को मस्तिष्क के कई रोगों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें न्यूरोडेवलपमेंटल विकार, विषाक्त अपमान, और मस्तिष्क में कैंसर के विकास और उपचार शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ न्यूरोनल सेल प्रकारों की एक विस्तृत विविधता के साथ अत्यधिक प्रजनन योग्य मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने की क्षमता है।यह एक बहुत ही सरलीकृत कार्यप्रवाह है कि ज्यादातर प्रयोगशालाओं द्वारा पूरा किया जा सकता है का उपयोग किया जाता है । और ये विशेष विकास कारकों या अपरिभाषित मैट्रिस से प्रभाव के बिना अस्थायी उपयुक्त तरीके से उत्पादित होते हैं जिससे यह एक बहुत ही सरल और लागत प्रभावी प्रणाली बन जाती है। शुरू करने के लिए, मैट्रिक्स के 100 माइक्रोलीटर को 5.9 मिलीलीटर बर्फ ठंडे डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम या F12 मीडिया के साथ 15 मिलीलीटर शंकुदाता ट्यूब में मिलाएं।झिल्ली मैट्रिक्स के एक मिलीलीटर के साथ एक छह अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से कोट करें। प्लेट को पैराफिन फिल्म में लपेटें और रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अगले दिन, प्रत्येक कुएं से अतिरिक्त मीडिया को एस्पिरेट करें, एफ 12 के साथ कुओं को कुल्ला करें, और एच 9 एचईएससीएस को कुल मात्रा में जोड़ें जो कि mTeSR1 मीडिया के दो मिलीलीटर की कुल मात्रा में अच्छी तरह से।सप्ताह से सप्ताह के लिए कोशिकाओं संस्कृति। mTeSR1 मीडिया के दो मिलीलीटर के साथ दैनिक आपूर्ति और 5% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस कम ऑक्सीजन इनक्यूबेटर में थाली जगह है । मार्ग के बीच संस्कृति से अलग कोशिकाओं को निराई करने के लिए ग्लास उपकरणों का उपयोग करें।रोजाना मीडिया को रिफ्रेश करें। कोशिकाओं को ऑर्गेनॉइड उत्पादन के लिए H9 कोशिकाओं का उपयोग करने से चार से छह दिन पहले पारित किया जाना चाहिए । कोशिकाओं को पारित करने के लिए, उन्हें DMEM F12 मीडिया के साथ कुल्ला करके शुरू करें और अतिरिक्त तरल को एस्पिरेशन करें।रिंसिंग के बाद, प्रोटीज समाधान जोड़ें और कालोनियों को कुएं के भीतर तैरने के लिए 40 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, डीएमईएम एफ 12 का उपयोग करके कोशिकाओं को तीन बार धोएं और यदि आवश्यक हो तो टुकड़ों को छोटा बनाने के लिए टिट्रेट। फिर कोशिकाओं को चार छह-अच्छी प्लेटों पर लगभग एक से आठ अनुपात में वितरित करें और प्लेटों को इनक्यूबेटर में रखें और दैनिक फ़ीड करें।चार से छह दिनों के बाद, कोशिकाओं को लगभग ८०% की उदारता तक पहुंचने । उन्हें एक नियमित इनक्यूबेटर में संक्रमण। एचएससीएस की प्रत्येक छह-अच्छी प्लेट के अनुसार डीएमईएम या F12 माध्यम के पांच मिलीलीटर के लिए स्टॉक समाधान के एक मिलीलीटर को जोड़कर एक कामकाजी एकाग्रता के लिए प्रोटीज स्टॉक समाधान को पतला करें।एस्पिरेट करें और सेल कल्चर मीडिया को हटा दें, फिर एचईएससीएस को प्रोटीज समाधान के साथ कवर करें। प्लेटों को 10 से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें या जब तक कि उपनिवेशों के किनारों को गोल न करें और मैट्रिक्स से अलग होना शुरू न करें लेकिन इससे पहले कि वे पूरी तरह से गोल करें। प्लेट को झुकाएं, प्रोटीज़ समाधान को जाता है, और प्रत्येक तीन बार डीएमईएम या एफ 12 के दो मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोते हैं।सुनिश्चित करें कि उपनिवेश मैट्रिक्स से जुड़े रहते हैं। इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि ईएस कोशिकाओं के टुकड़े उचित आकार में हैं, इसलिए सुनिश्चित करें कि वे उचित समय के लिए अपमानित कर रहे हैं। यदि वे वहां एक समय की बहुत कम के लिए कर रहे हैं, यह बहुत मुश्किल हो सकता है उंहें फ्लश बंद और उंहें अलग तोड़ ।और अगर वे वहां बहुत लंबे समय के लिए कर रहे हैं, वे वास्तव में सिर्फ धोने के कदम के दौरान बंद आ सकते हैं । प्रत्येक अच्छी तरह से ताजा mTeSR मीडिया के एक से १.५ मिलीलीटर के बारे में वापस जोड़ें और कोमल पिपटिंग का उपयोग करके 50 मिलीलीटर शंकु नली में प्लेट से कोशिकाओं को फ्लश करें। एस्पिरेट और प्लेट के भीतर एचएससीएस बांटना जब तक वे अपने मूल आकार के लगभग 1/30 तक पहुंचने ।अब कॉलोनी क्लस्टर 250 से 350 माइक्रोमीटर आकार के टुकड़ों के समान हैं। कोशिकाओं को एक अल्ट्रा कम अटैचमेंट T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 30 मिलीलीटर mTeSR मीडिया बिना बीडब्ल्यूजीएफ के बिना है। अगले दिन, फ्लास्क को इस तरह झुकाएं कि जीवित कोशिकाएं कोने में पूल करें।यदि बड़ी संख्या में कोशिकाएं हैं जिन्होंने फ्लास्क के नीचे का पालन किया है, तो कोशिकाओं को एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें। पहले कुछ दिनों के लिए मृत कोशिकाओं की एक उच्च आबादी की उम्मीद है। एक बार कोशिकाओं को व्यवस्थित, मीडिया और मृत लाइव कोशिकाओं युक्त मीडिया के बारे में 10 मिलीलीटर छोड़ने और कम bFGF मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए bFGF के मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर प्रति 30 नैनोग्राम के साथ पूरक मीडिया से आकांक्षी ।दो दिनों के बाद, कोशिकाओं की जांच करें। अधिकांश कोशिकाओं को स्वस्थ और उज्ज्वल दिखना चाहिए। हालांकि, यदि एक तिहाई से अधिक कोशिकाएं अंधेरी दिखाई देती हैं, तो फ्लास्क को झुकाएं और मीडिया के 20 मिलीलीटर को कम टीएफजीएफ मीडिया के साथ बदल दें, जो 20 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर bFGF के साथ पूरक है।तीन दिन, मीडिया के आधे को हटा दें और 15 मिलीलीटर एचईएससी मीडिया के साथ प्रति मिलीलीटर टीएफजीएफ के 10 नैनोग्राम के साथ पूरक करें। पांच दिन, मीडिया के आधे की जगह तंत्रिका प्रेरण मीडिया के 15 मिलीलीटर के साथ । उसके बाद, हर दूसरे दिन, तंत्रिका प्रेरण मीडिया के साथ माध्यम के आधे की जगह।संस्कृति में तीन सप्ताह के बाद, 1X की अंतिम एकाग्रता पर मीडिया के लिए 100X पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें यदि वांछित हो। हर दूसरे दिन आधे मीडिया को रिफ्रेश करें। इस प्रोटोकॉल में, गठित मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड इन समूहों के केंद्रों में गहरे मरने वाली कोशिकाओं के बिना आकार में उज्ज्वल और समान दिखते थे।कोशिकाओं को धीरे-धीरे टीएफजीएफ से छुड़ाना गया था। पांच दिन उन्हें न्यूरल इंडक्शन मीडिया में रखा गया और वे पूरे संस्कृति काल में इस मीडिया में बने रहे । यद्यपि ऑर्गेनॉइड बड़े हो गए और इस प्रकार समय के साथ गहरा हो गया, तंत्रिका रोसेट जैसी संरचनाओं का विस्तार हुआ जो तंत्रिका भेदभाव की शुरुआत को इंगित करता है और इसमें भ्रूणीय तंत्रिका ट्यूब की विशेषताएं शामिल हैं।कोशिकाओं के भीतर जीन अभिव्यक्ति पर अधिक गहराई से विचार करने के लिए, क्यूपीसीआर विश्लेषण किया गया था। ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर VLGUT1 को ढाई सप्ताह में व्यक्त किया गया था, पांच सप्ताह में वृद्धि हुई थी, और संस्कृति के पांच महीने के माध्यम से लगातार बने रहे । संस्कृति में पांच सप्ताह तक एक पूर्वाभास मार्कर Foxg1 निम्न स्तर पर व्यक्त किया गया था ।गहरी परत मार्कर Tbr1 पांच सप्ताह के आसपास नुकीला और बाद में कमी आई । जबकि ऊपरी परत मार्कर Satb2 की अभिव्यक्ति, वेंट्रल मार्कर Eng1, हिंडब्रेइन रीढ़ की हड्डी मार्कर Hoxb4, साथ ही ओलिगोडेन्ड्रोसाइट मार्कर ओलिग 2 सभी समय के साथ वृद्धि हुई । इसके विपरीत, स्टेम सेल मार्कर Sox2 समय के साथ कमी आई ।ग्लियल मार्कर GFAP पांच सप्ताह में नुकीला और अपेक्षाकृत बाद में स्थिर रहे । संदूषण से बचने के लिए प्रारंभिक चरण के ऑर्गेनॉइड में ईएस कोशिकाओं को संभालते समय अत्यंत सावधानी बरतना याद रखें क्योंकि वे एंटीबायोटिक दवाओं के बिना उगाए जाते हैं और शेड्यूल के अनुसार खिलाना भी याद रखते हैं। इस प्रक्रिया के बाद, आप जीन अभिव्यक्ति के लिए मात्रात्मक आरटी-पीसीआर और प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसी तकनीकों का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड का मूल्यांकन कर सकते हैं।इस तकनीक का उपयोग करके, हम एक हाइपोक्सिया कक्ष में मॉडलिंग के रूप में मानव नवजात हाइपोक्सिक चोट के पहलुओं को कम करने के लिए एक छोटे अणु की क्षमता का अध्ययन करने में सक्षम थे। यह महत्वपूर्ण है कि इन मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड ने वीवो माउस प्रयोगों में इसी तरह का व्यवहार किया।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

सृजन CRISPR / Cas9 मध्यस्थता Monoallelic विलोपन माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में बढ़ाने समारोह का अध्ययन करने

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न एण्डोडर्म कोशिकाओं की शुद्धि के लिए एक त्वरित और कारगर तरीका

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानकीकृत और प्रतिलिपि Forebrain-प्रकार सेरेब्रल Organoids की पीढ़ी

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

इंजीनियरिंग प्रत्यारोपण-उपयुक्त रेटिना वर्णक उपकला ऊतक मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

प्रारंभिक माउस भ्रूण से अनुक्रमण के लिए छोटे आरएनए पुस्तकालयों की तैयारी

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

वयस्क माउस स्वाद स्टेम सेल से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी और संस्कृति

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक सरलीकृत विधि

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

यांत्रिक अनुसंधान और पुनर्योजी थेरेपी की ओर एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में मानव दांत से ऑर्गेनोइड की स्थापना

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...