Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
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Ringraziamo lo Yale Stem Cell Core (YSCC) e lo Yale Cancer Center (YCC) per l'assistenza. Ringraziamo il dottor Jung Kim per la sua recensione neurologica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, e NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), lo Yale Cancer Center e il Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) e un generoso dono senza restrizioni da parte di Joseph e Lucille Madri.

1. Manutenzione delle cellule staminali
<ol><li>Mantenere H9 hESC su uno strato di fattore di crescita ridotto matrice della membrana seminterrato (vedere la Tabella dei materiali, d'ora in poi semplicemente indicato come matrice) secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Per rivestire una piastra di 6 pozzetti o un piatto da 10 cm, unire 100 l-L di matrice con 5,9 mL di supporto Eagle modificato a freddo ghiaccio (DMEM)/F12. Avvolgere le piastre in pellicola di paraffina e conservarle durante la n...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

Simile ad altri modelli organoidi, questo è un sistema artificiale che viene fornito con diversi avvertimenti. Anche se c'era poco batch di variazione batch in termini di livelli di espressione complessiva, organidi singoli ha mostrato differenze. Ad esempio, la posizione delle aree positive Sox-2 non era identica in ogni organoide (Figura 3). Mentre qPCR è adatto a cercare cambiamenti complessivi in lotti di cellule, tecniche aggiuntive come gli RNA a cella singola saranno utilizzati in studi futuri p...

A causa di una miriade di limitazioni pratiche ed etiche, c'è stata una grande difficoltà nello studio del cervello umano. Mentre gli studi che utilizzano roditori sono stati fondamentali per la nostra comprensione del cervello umano, il cervello del topo ha molte differenze1,2. È interessante notare che i topi hanno una densità neuronale che è almeno 7 volte inferiore al cervello dei primati3,4. Anche se i primati sono più vicini agli esseri umani rispetto ai roditori da un punto di vista evolutivo, non è pratico per la maggior parte dei ricercatori lavorare con loro. Lo scopo di questo protocollo era quello di riassumere molte caratteristiche importanti del cervello umano utilizzando un metodo semplificato e meno costoso senza la necessità di una matrice di membrana seminterrato eterologa o fattori di crescita esogeni pur mantenendo la diversità delle cellule cerebrali e l'organizzazione cellulare.
Il lavoro formativo del laboratorio Sasai ha utilizzato la coltura senza siero dei corpi embrionali (SFEBq) per generare tipi di cellule neuronali bidimensionali e tridimensionali da cellule staminali embrionali (ESC) segnalate5,6. Molti metodi organoidi del cervello umano hanno seguito un percorso relativamente simile rispetto alle ESC segnalate7,8. Al contrario, questo protocollo inizia con cluster di ESC umani distaccati (hESC), simili ai primi passi del lavoro seminale dei laboratori Thomson e zhang prima delle fasi di placcatura9,10, così come la fase iniziale del protocollo organoide cerebrale del laboratorio Pasca prima dell'aggiunta di fattori di crescita esogeni11. Le matrici a membrana del seminterrato (ad esempio, matrigel) sono state utilizzate in molti protocolli organoidi cerebrali ed è stato dimostrato di essere un efficace scaffold8. Tuttavia, le matrici di membrana seminterrato più comunemente utilizzate non vengono senza complicazioni in quanto co-purificano con quantità sconosciute di fattori di crescita con variabilità batch a batch durante la produzione12. Inoltre, queste matrici possono complicare l'imaging e aumentare il rischio di contaminazione e costi.
Mentre gli organoidi del cervello umano possono essere utilizzati per rispondere a molte domande, ci sono alcune limitazioni da tenere a mente. Per uno, a partire dalle cellule staminali embrionali, gli organoidi assomigliano più da vicino acerrimi cerebrali immaturi rispetto ai cervelli invecchiati e come tali potrebbero non essere modelli ideali per malattie che si verificano nella vecchiaia, come il morbo di Alzheimer. In secondo luogo, mentre il nostro protocollo ha trovato marcatori di prosencefalo, sviluppo del cervello e del cervello posteriore che sono utili per studiare l'effetto di un trattamento o di una malattia sulle cellule di più regioni cerebrali in concerto, altri protocolli possono essere seguiti per concentrarsi su specifiche regioni del cervello13,14. Infine, un'altra limitazione dei modelli organoidi è quella delle dimensioni, mentre la lunghezza media di un cervello umano di circa 167 mm, gli organoidi cerebrali fatti con l'uso di agitazione crescono fino a 4 mm8 e gli organoidi formati da questo protocollo crescono a 1-2 mm di 10 settimane. Ciò nonostante, Questo protocollo fornisce uno strumento importante per studiare il tessuto cerebrale umano e l'interazione di più tipi di cellule.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Gli organoidi cerebrali umani differenziati dalle cellule staminali embrionali offrono l'opportunità unica di studiare interazioni complicate di più tipi di cellule in un sistema tridimensionale. Qui vi presentiamo un metodo relativamente semplice e poco costoso che produce organoidi cerebrali. In questo protocollo le cellule staminali pluripotenti umane sono suddivise in piccoli ammassi invece di singole cellule e coltivate in supporti di base senza una matrice di membrana del seminterrato etesologa o fattori di crescita esogeni, consentendo ai segnali di sviluppo intrinseci di modellare il crescita dell'organoide. Questo semplice sistema produce una varietà di tipi di cellule cerebrali tra cui cellule gliali e microgliali, cellule staminali e neuroni del prosencefalo, del cervello medio e del cervello posteriore. Gli organoidi generati da questo protocollo mostrano anche segni distintivi di un'appropriata organizzazione temporale e spaziale dimostrati da immagini luminose, istologia, immunofluorescenza e reazione della catena di trascrizione inversa quantitativa in tempo reale ( qRT-PCR). Poiché questi organoidi contengono tipi di cellule da varie parti del cervello, possono essere utilizzati per studiare una moltitudine di malattie. Per esempio, in un recente articolo abbiamo dimostrato l'uso di organoidi generati da questo protocollo per studiare gli effetti dell'ipossia sul cervello umano. Questo approccio può essere utilizzato per studiare una serie di condizioni altrimenti difficili da studiare come gli handicap del neurosviluppo, i disturbi genetici e le malattie neurologiche.

La figura 1 mostra immagini rappresentative di diversi punti temporali per dimostrare l'aspetto delle celle/organoidi in tutte le diverse fasi del protocollo. Gli HESC sono stati rimossi dalla piastra di coltura dei tessuti, spezzati in piccoli pezzi, e collocati in una fiaschetta di attacco ultra-bassa T75 dove formavano sfere. È importante notare che le cellule sembrano luminose e simili in termini di dimensioni, senza cellule scure e morenti nei centri di questi ammassi. Le cellule sono ...

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A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell'organizzazione cellulare.

Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Gli organoidi cerebrali umani sono uno strumento significativo per studiare le malattie in un sistema che è facilmente manipolabile e incorpora un ambiente umano e l'interazione appropriata di più tipi di cellule. Questa tecnica può essere applicata per studiare numerose malattie del cervello, tra cui disturbi del neurosviluppo, insulti tossici e la crescita e il trattamento del cancro nel cervello. Il principale vantaggio di questo protocollo è la capacità di generare organoidi cerebrali altamente riproducibili con un'ampia varietà di tipi di cellule neuronali.Questo viene fatto utilizzando un flusso di lavoro molto semplicistico che potrebbe essere realizzato dalla maggior parte dei laboratori. E questi sono prodotti in modo temporaneo appropriato senza l'influenza di fattori di crescita specializzati o matrici indefinite che lo rende un sistema molto semplice ed economico. Per iniziare, combinare 100 microlitri di matrice con 5,9 millilitri di mezzi Eagle Medium o F12 a freddo ghiaccio in un tubo conico da 15 millilitri.Rivestire ogni bene in una piastra a sei pozzetti con un millilitro della matrice di membrana. Avvolgere il piatto in pellicola di paraffina e conservare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, aspirare i supporti in eccesso da ogni pozzo, sciacquare i pozzi con F12 e aggiungere H9 hESCS in un volume totale di due millilitri di supporti mTeSR1 per pozzo.Coltura delle cellule di settimana in settimana. Fornire quotidianamente due millilitri di supporti mTeSR1 e posizionare la piastra in un incubatore di ossigeno basso Celsius di 37 gradi con 5% di ossigeno e 5% di anidride carbonica. Usa strumenti di vetro per distogliare le cellule differenzianti dalla coltura tra i passaggi.Aggiornare i contenuti multimediali ogni giorno. Le cellule devono essere passaggio da quattro a sei giorni prima di utilizzare le celle H9 per la produzione di organoidi. Per passare le cellule, iniziare risciacquandole con mezzi DMEM F12 e aspirando il liquido in eccesso.Dopo il risciacquo, aggiungere la soluzione di proteasi e incubare le cellule per 40 minuti affinché le colonie galleggino all'interno del pozzo. Successivamente, lavare le celle tre volte utilizzando DMEM F12 e, se necessario, titolare per rendere i pezzi più piccoli. Quindi distribuire le cellule con un rapporto approssimativo uno a otto su quattro piastre a sei pozzi e posizionare le piastre nell'incubatrice e nutrirsi quotidianamente.Dopo quattro o sei giorni, le celle raggiungono circa l'80% di confluenza. Passa a un incubatore regolare. Diluire la soluzione di proteasi a una concentrazione di lavoro aggiungendo un millilitro della soluzione stock a cinque millilitri di mezzo DMEM o F12 per ogni piastra a sei pozzetti di hESCS.Aspirare e rimuovere il supporto di coltura cellulare, quindi coprire l'hESCS con la soluzione di proteasi. Posizionare le piastre nell'incubatrice per 10-15 minuti o fino a quando i bordi delle colonie si arrotondano e iniziano a separarsi dalla matrice ma prima che si arrotondano completamente. Inclinare la piastra, aspirare la soluzione di proteasi e lavare delicatamente le cellule con due millilitri di DMEM o F12 per ogni pozzo tre volte.Assicurati che le colonie rimangano attaccate alla matrice. Quindi è fondamentale che i pezzi di cellule ES abbiano le dimensioni appropriate, quindi assicurati che siano in dispasi per la quantità appropriata di tempo. Se sono lì dentro per troppo poco tempo, può essere molto difficile scaricarli e separarli.E se sono lì dentro per troppo tempo, possono semplicemente staccarsi durante i passaggi di lavaggio. Aggiungere di nuovo circa uno o 1,5 millilitri di supporti mTeSR freschi a ciascun pozzo e sciacquare le celle dalla piastra in un tubo conico da 50 millilitri utilizzando una tubazione delicata. Aspirare e erogare hESCS all'interno della piastra fino a raggiungere circa 1/30 della loro dimensione originale.Ora gli ammassi di colonie assomigliano a pezzi di dimensioni da 250 a 350 micrometri. Trasferire le celle in un singolo pallone T75 ad attacco ultra basso contenente 30 millilitri di supporti mTeSR senza bFGF. Il giorno dopo, inclina il pallone in modo che le cellule vive si bilivano nell'angolo.Se ci sono un gran numero di cellule che hanno aderito al fondo del pallone, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le cellule in un nuovo pallone. Aspettatevi di avere un'alta popolazione di cellule morte per i primi giorni. Una volta che le cellule si depositano, aspirare il mezzo e le cellule morte lasciando circa 10 millilitri di mezzi contenenti le cellule vive e aggiungere 20 millilitri di supporti bFGF bassi integrati con 30 nanogrammi per millilitro di bFGF.Dopo due giorni, controllare le celle. La maggior parte delle cellule dovrebbe apparire sana e luminosa. Tuttavia, se più di un terzo delle cellule appare scuro, inclinare il pallone e sostituire 20 millilitri di supporti con 20 millilitri di supporti bFGF bassi integrati con 20 nanogrammi per millilitro di bFGF.Il terzo giorno, rimuovere metà del supporto e sostituire con 15 millilitri di supporti hESC integrati con 10 nanogrammi per millilitro di bFGF. Il quinto giorno, sostituire metà dei media con 15 millilitri di mezzi di induzione neurale. Dopodi tempo, a giorni nostri, sostituisci metà del mezzo con mezzi di induzione neurale.Dopo tre settimane di coltura, aggiungere 100X Penicillina-Streptomicina ai supporti ad una concentrazione finale di 1X se lo si desidera. Aggiorna metà dei media a giorni diversi. In questo protocollo, gli organoidi cerebrali formati sembravano luminosi e di dimensioni simili senza cellule morenti scure al centro di questi ammassi.Le cellule sono state gradualmente svezzate da bFGF. Il quinto giorno, sono stati collocati in mezzi di induzione neurale e sono rimasti in questi media per tutto il periodo della cultura. Sebbene gli organoidi siano aumentati e quindi più scuri nel tempo, le strutture simili a rosetta neurali si sono espanse, il che indica l'inizio della differenziazione neurale e contiene caratteristiche del tubo neurale embrionale.Per dare un'occhiata più approfondita all'espressione genica all'interno delle cellule, è stata eseguita l'analisi qPCR. Il trasportatore di glutammato VLGUT1 è stato espresso a due settimane e mezza, è aumentato a cinque settimane e è rimasto coerente attraverso cinque mesi di cultura. Un marcatore di forebraina Foxg1 è stato espresso a bassi livelli fino a cinque settimane in cultura.Il marcatore dello strato profondo Tbr1 ha raggiunto il picco di circa cinque settimane e si è successivamente ridotto. Mentre l'espressione del marcatore dello strato superiore Satb2, il marcatore ventrale Eng1, il marcatore del midollo spinale del cervello posteriore Hoxb4, così come il marcatore oligodendrocita Olig2 sono aumentati nel tempo. Al contrario, il marcatore di cellule staminali Sox2 è diminuito nel tempo.Il marcatore gliale GFAP raggiunse il picco di cinque settimane e rimase relativamente costante in seguito. Ricorda di prestare la massima attenzione quando maneggia le cellule ES negli organoidi in fase iniziale per evitare la contaminazione mentre vengono coltivate senza antibiotici e ricorda anche di nutrirsi secondo i tempi previsti. Seguendo questa procedura, è possibile valutare gli organoidi utilizzando tecniche come rt-PCR quantitativa per l'espressione genica e l'immunofluorescenza per l'espressione e la localizzazione delle proteine.Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di studiare la capacità di una piccola molecola di alleviare gli aspetti della lesione ipossia neonatale umana modellata in una camera di ipossia. È significativo che questi organoidi cerebrali umani si siano comportati in modo simile agli esperimenti sui topi in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Un metodo rapido ed efficace per la purificazione delle cellule endoderma generato da cellule staminali embrionali umane

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Stabilire gli organoidi dal dente umano come un potente strumento verso la ricerca meccanicistica e la terapia rigenerativa

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...