Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим ядро стволовых клеток йельского университета (YSCC) и онкологический центр (YCC) за помощь. Мы благодарим доктора Чжон Кима за его невропатологию обзора. Эта работа была поддержана Коннектикут регенеративной медицины научно-исследовательский фонд, марта Dimes, и NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), онкологический центр йельского и йельского онкологического биологии Учебная программа NCI CA193200 (E.B.) и щедрый неограниченный подарок от Джозефа и Люсиль Мадри.

1. Обслуживание стволовых клеток
<ol><li>Поддерживать H9 hESCs на слое фактора роста снижение подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов, отныне просто называют матрицы) в соответствии с инструкциями производителя.<ol>
<li>Чтобы покрыть одну 6-колодую тарелку или одну тарелку 10 ?...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

Как и другие модели органоидов, это искусственная система, которая поставляется с несколькими оговорками. Хотя было мало партии партии изменения с точки зрения общего уровня выражения, отдельные органоиды действительно проявлять различия. Например, расположение положительных област?...

Из-за множества практических и этических ограничений, было много трудностей в изучении человеческого мозга. Хотя исследования с использованием грызунов имеют решающее значение для нашего понимания человеческого мозга, мыши мозг имеет много различий1,2. Интересно, что мыши имеют плотность нейронов, что, по крайней мере в 7 раз меньше, чем приматов мозга3,4. Хотя приматы ближе к человеку, чем грызуны с эволюционной точки зрения, это не практично для большинства исследователей, чтобы работать с ними. Цель этого протокола состояла в том, чтобы резюмировать многие важные особенности человеческого мозга с помощью упрощенного и менее дорогостоящего метода без необходимости гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста при сохранении разнообразия клеток мозга и клеточной организации.
Формативная работа из лаборатории Сасай использовала сыворотку свободной культуры эмбриональных тел (SFEBq) метод для создания двух- и трехмерных нейронных типов клеток из сигнализированных эмбриональных стволовых клеток (ESCs)5,6. Многие органоидные методы мозга человека следовали относительно похожим путем от сигнализированных ESCs7,8. В отличие от этого, этот протокол начинается с кластеров отдельных человека ESCs (hESCs), похожие на начальные шаги семенной работы Лаборатории Томсона и Чжана до покрытия шаги9,10, а также начальный шаг мозга органоидпротокол лаборатории Паска до добавления экзогенных факторов роста11. Подвал мембраны матрицы (например, матригель) были использованы во многих мозг органоидных протоколов и было показано, что эффективный эшафот8. Однако, наиболее часто используемые мембранные матрицы подвала не приходят без усложнений по мере того как они co-purify с неизвестными количествами факторов роста с партией к изменчивости партии во время продукции12. Кроме того, эти матрицы могут осложнить визуализацию и увеличить риск загрязнения и стоимости.
Хотя человеческий мозг органоиды могут быть использованы для ответа на многие вопросы, Есть определенные ограничения, чтобы иметь в виду. С одной стороны, начиная с эмбриональных стволовых клеток, органоиды больше напоминают незрелые мозги, чем в возрасте мозга и как таковой не может быть идеальным и моделям для заболеваний, которые происходят в пожилом возрасте, как болезнь Альцгеймера. Во-вторых, в то время как наш протокол нашел маркеры развития головного мозга, среднего и заднего мозга, которые полезны для изучения влияния лечения или болезни на клетки из нескольких областей мозга в согласии, другие протоколы могут быть соблюдены, чтобы сосредоточиться на конкретных областях мозга13,14. Наконец, еще одним ограничением органоидных моделей является то, что размер, в то время как средняя длина человеческого мозга около 167 мм, мозг органоидов, сделанных с использованием агитации вырастают до 4 мм8 и органоиды, сформированные этим протоколом, вырастают до 1-2 мм на 10 недель. Тем не менее, этот протокол является важным инструментом для изучения тканей мозга человека и взаимодействия нескольких типов клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Органоиды мозга человека, отличающиеся от эмбриональных стволовых клеток, дают уникальную возможность изучать сложные взаимодействия нескольких типов клеток в трехмерной системе. Здесь мы представляем относительно простой и недорогой метод, который дает органоиды мозга. В этом протоколе человека плюрипотентных стволовых клеток разбиваются на небольшие кластеры вместо одиночных клеток и выращиваются в основных средствах массовой информации без гетерологичной матрицы мембраны подвала или экзогенных факторов роста, что позволяет внутреннее развитие сигналов для формирования рост органоида. Эта простая система производит разнообразие типов клеток мозга, включая глиальные и микроглиальные клетки, стволовые клетки и нейроны передового мозга, среднего мозга и заднего мозга. Органоиды, генерируемые в этом протоколе, также отображают признаки соответствующей временной и пространственной организации, продемонстрированной яркими изображениями поля, гистологией, иммунофлуоресценцией и в режиме реального времени количественной реверсивной транспрессионной цепной реакцией ( qRT-PCR). Поскольку эти органоиды содержат типы клеток из различных частей мозга, они могут быть использованы для изучения множества заболеваний. Например, в недавней работе мы продемонстрировали использование органоидов, полученных из этого протокола, для изучения влияния гипоксии на человеческий мозг. Этот подход может быть использован для изучения массива в противном случае трудно изучить условия, такие как нейроразвития гандикапы, генетические расстройства, и неврологические заболевания.

На рисунке 1 показаны репрезентативные яркие изображения нескольких точек времени, чтобы продемонстрировать, как выглядят клетки/органоиды на разных этапах протокола. HESCs были удалены из ткани культуры пластины, разбиты на мелкие кусочки, и помещены в T75 ультра-низкой к?...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Этот протокол был создан в качестве средства для производства органов мозга в упрощенной, низкой стоимости образом без экзогенных факторов роста или подвальной мембранной матрицы, сохраняя при этом разнообразие типов клеток мозга и многие особенности клеточной организации.

Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Органоиды головного мозга человека являются важным инструментом для изучения заболеваний в системе, которая легко манипулировать и включает в себя человека настройки и соответствующего взаимодействия нескольких типов клеток. Этот метод может быть применен для изучения многочисленных заболеваний головного мозга, в том числе нейроразвития расстройств, токсичных оскорблений, а также роста и лечения рака в головном мозге. Основным преимуществом этого протокола является способность генерировать высоко воспроизводимые органоиды мозга с широким спектром типов нейронных клеток.Это делается с использованием очень упрощенного рабочего процесса, который может быть выполнен большинством лабораторий. И они производятся в временной соответствующей манере без влияния специализированных факторов роста или неопределенных матриц, что делает его очень простой и экономически эффективной системой. Для начала объединить 100 микролитров матрицы с 5,9 миллилитров ледяной Dulbecco модифицированных Eagle Medium или F12 средств массовой информации в 15 миллилитров конической трубки.Пальто каждый хорошо в шесть хорошо пластины с одним миллилитр мембранной матрицы. Оберните пластину в парафиновой пленке и храните на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день, аспирировать излишки мультимедиа из каждой скважины, промыть скважины с F12, и добавить H9 hESCS в общем объеме двух миллилитров mTeSR1 средств массовой информации на скважину.Культура клеток от недели к неделе. Поставка ежедневно с двумя миллилитров mTeSR1 средств массовой информации и место пластины в 37 градусов по Цельсию низкого кислорода инкубатор с 5%кислорода и 5%углекислого газа. Используйте стеклянные инструменты, чтобы отлецировать дифференциации клеток от культуры между проходами.Обновление средств массовой информации ежедневно. Клетки должны быть протекали за четыре-шесть дней до использования клеток H9 для производства органоидов. Чтобы пройти клетки, начните с полоскания их с DMEM F12 средств массовой информации и аспирации избыточной жидкости.После полоскания добавьте раствор протеазы и инкубировать клетки в течение 40 минут, чтобы колонии плавали внутри хорошо. Затем, мыть клетки три раза с помощью DMEM F12 и при необходимости титрат, чтобы сделать куски меньше. Затем распределить клетки в приблизительном соотношении один к восьми в течение четырех шести-хорошо пластин и поместить пластины в инкубатор и кормить ежедневно.Через четыре-шесть дней клетки достигают примерно 80% стечения. Переведайте их в обычный инкубатор. Разбавить раствор протеазного бульона до рабочей концентрации, добавив один миллилитр раствора бульона в пять миллилитров DMEM или F12 среды на каждую шестиясную пластину hESCS.Аспирировать и удалять средства массовой информации культуры клеток, а затем покрыть hESCS с протеазы решения. Поместите пластины в инкубатор в течение 10 до 15 минут или до тех пор, пока края колоний округлиться и начинают отделяться от матрицы, но прежде чем они округлить полностью. Наклоните пластину, аспирировать раствор протеазы и аккуратно промыть клетки двумя миллилитров DMEM или F12 для каждого хорошо три раза.Убедитесь, что колонии остаются прикрепленными к матрице. Поэтому очень важно, чтобы части клеток ES были в соответствующем размере, поэтому убедитесь, что они находятся в dispase для соответствующего количества времени. Если они там слишком мало времени, это может быть очень трудно смыть их и разорвать их на части.И если они там слишком долго, они могут на самом деле просто отойти во время мытья шагов. Добавить обратно около одного до 1,5 миллилитров свежих средств массовой информации mTeSR к каждому хорошо и смыть клетки с пластины в 50 миллилитров конической трубки с использованием нежной пипетки. Аспирировать и распределять hESCS в пластине, пока они не достигнут примерно 1/30th от их первоначального размера.Сейчас скопления колоний напоминают кусочки размером от 250 до 350 микрометров. Перенесите клетки в одну сверхнизкую вяленую колбу T75, содержащую 30 миллилитров мультимедиа mTeSR без bFGF. На следующий день наклоните колбу так, чтобы живые клетки объединились в углу.Если есть большое количество клеток, которые прилипли к нижней части колбы, используйте 10 миллилитров пипетки для передачи клеток в новую колбу. Ожидать, чтобы иметь высокую популяцию мертвых клеток в течение первых нескольких дней. После того, как клетки оседают, аспирировать от средств массовой информации и мертвых клеток оставляя около 10 миллилитров средств массовой информации, содержащих живые клетки и добавить 20 миллилитров низких средств массовой информации bFGF дополнены 30 нанограмм на миллилитр bFGF.Через два дня проверьте клетки. Большинство клеток должны выглядеть здоровыми и яркими. Однако, если более трети клеток кажутся темными, наклоните колбу и замените 20 миллилитров мультимедиа на 20 миллилитров низких средств массовой информации bFGF, дополненных 20 нанограммами на миллилитр bFGF.На третий день удалите половину мультимедиа и замените 15 миллилитров средств массовой информации hESC, дополненных 10 нанограммами на миллилитр bFGF. На пятый день замените половину мультимедиа 15 миллилитров нейронных индукционных средств массовой информации. После этого, через день, заменить половину среды с нервной индукции средств массовой информации.После трех недель в культуре, добавить 100X пенициллин-стрептомицин в средствах массовой информации в окончательной концентрации 1X при желании. Освежите половину средств массовой информации через день. В этом протоколе сформированные органоиды мозга выглядели яркими и похожими по размеру без темных умирающих клеток в центрах этих скоплений.Клетки были постепенно отуты от bFGF. На пятый день, они были помещены в нейронных средств индукции, и они остались в этом средств массовой информации на протяжении всего периода культуры. Несмотря на то, что органоиды со временем стало больше и тем темнее, расширились нейронные структуры, похожие на розетки, что указывает на начало нейронной дифференциации и содержит особенности эмбриональной нервной трубки.Чтобы более углубленно взглянуть на экспрессию генов в клетках, был проведен qPCR-анализ. Глутамат транспортер VLGUT1 был выражен в две с половиной недели, увеличилось на пять недель, и оставался последовательным в течение пяти месяцев культуры. Маркер forebrain Foxg1 был выражен на низких уровнях до пяти недель в культуре.Глубокий слой маркера Tbr1 достиг пика около пяти недель и впоследствии уменьшился. В то время как выражение верхнего слоя маркера Satb2, брюшной маркер Eng1, задний маркер спинного мозга Hoxb4, а также олигодендроцит маркер Olig2 все увеличилось с течением времени. В отличие от этого, маркер стволовых клеток Sox2 со временем уменьшился.Глиальный маркер GFAP достиг пика в пять недель и оставался относительно постоянным впоследствии. Не забудьте принять максимальную осторожность при обработке ES клеток на ранней стадии органоидов, чтобы избежать загрязнения, как они выросли без антибиотиков, а также не забудьте кормить в соответствии с графиком. После этой процедуры, вы можете оценить органоиды с помощью таких методов, как количественные RT-PCR для экспрессии генов и иммунофторесценции для экспрессии белка и локализации.Используя этот метод, мы смогли изучить способность небольшой молекулы, чтобы облегчить аспекты неонатальной гипоксической травмы человека, как моделируется в гипоксии камеры. Важно, что эти органоиды человеческого мозга вели себя так же, как эксперименты с мышью in vivo.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Быстрый и эффективный метод для очистки эндодермы клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Инженерные трансплантации подходит сетчатки пигментного эпителия ткани, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Подготовка малых РНК-библиотек для секвенирования ранних эмбрионов мыши

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Генерация и культивация лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослой мыши

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Упрощенный метод получения органоидов почек из плюрипотентных стволовых клеток человека

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Создание органоидов из человеческих зубов в качестве мощного инструмента для механистических исследований и регенеративной терапии

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...