Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi tackar Yale Stem Cell Core (YSCC), och Yale Cancer Center (YCC) för hjälp. Vi tackar dr Jung Kim för hans neuropatologi recension. Detta arbete stöddes av Connecticut Regenerativ Medicine Research Fund, March of Dimes, och NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Cancer Center och Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och en generös obegränsad gåva från Joseph och Joseph och Lucille Madri.

1. Stamcellsunderhåll
<ol><li>Underhåll H9 hESCs på ett lager av tillväxtfaktor minskad källare membran matris (se tabellen över material,hädanefter helt enkelt kallad matris) enligt tillverkarens instruktioner.<ol>
<li>För att belägga en 6-brunn tallrik eller en 10 cm maträtt, kombinera 100 μL matris med 5,9 ml iskall Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) / F12 media. Wrap plattor i paraffin film och lagra över natten vid 4 ° C. Använd dem nästa dag för passaging celler efter övers...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

Liknar andra organoid modeller, Detta är ett artificiellt system som kommer med flera varningar. Även om det fanns lite parti till batch variation när det gäller övergripande uttrycknivåer, enskilda organoider uppvisade skillnader. Till exempel var placeringen av Sox-2 positiva områden inte identiska i varje organoid(figur 3). Medan qPCR är lämplig att leta efter övergripande förändringar i partier av celler, ytterligare tekniker såsom single cell RNAseq kommer att användas i framtida studi...

På grund av otaliga praktiska och etiska begränsningar har det varit stora svårigheter att studera den mänskliga hjärnan. Medan studier som använder gnagare har varit avgörande för vår förståelse av den mänskliga hjärnan, har mushjärnan många skillnader1,2. Intressant, möss har en neuronal densitet som är minst 7 gånger mindre än primathjärnan3,4. Även primater är närmare människor än gnagare ur evolutionär synvinkel, är det inte praktiskt för de flesta forskare att arbeta med dem. Syftet med detta protokoll var att sammanfatta många viktiga funktioner i den mänskliga hjärnan med hjälp av en förenklad och billigare metod utan behov av en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer samtidigt som hjärnans cell mångfald och cellulära organisation.
Formativt arbete från Sasai labbet använde serumfri kultur av embryoid organ (SFEBq) metod för att generera två- och tredimensionella neuronala celltyper från signaliserade embryonala stamceller (ESCs)5,6. Många mänskliga hjärnan organoid metoder har följt en relativt liknande väg från signaliserade ESCs7,8. Däremot börjar detta protokoll med kluster av fristående mänskliga ESCs (hESCs), liknande de första stegen i nyskapande arbete thomson och Zhang laboratorier före plätering steg9,10 samt det ursprungliga steget i hjärnan organoid protokoll pasca laboratoriet innan tillsats av exogena tillväxtfaktorer11. Källare membran matriser (t.ex. matrigel) har använts i många hjärnan organoid protokoll och det har visat sig vara en effektiv byggnadsställning8. Emellertid, oftast används källare membran matriser kommer inte utan komplikationer eftersom de samrena med okända mängder tillväxtfaktorer med parti till batch variabilitet under produktion12. Dessutom kan dessa matriser komplicera bildbehandling, och öka risken för kontaminering och kostnad.
Medan mänskliga hjärnan organoider kan användas för att svara på många frågor, Det finns vissa begränsningar att tänka på. För en, från embryonala stamceller, organoider mer liknar omogna hjärnor än åldern hjärnor och som sådan kanske inte är idealiska modeller för sjukdomar som uppstår i ålderdomen, som Alzheimers sjukdom. För det andra, medan vårt protokoll hittade markörer för framhjärnan, midbrain och hindbrain utveckling som är användbara för att studera effekten av en behandling eller sjukdom på celler från flera hjärnregioner i samförstånd, andra protokoll kan följas för att koncentrera sig på specifika hjärnregioner13,14. Slutligen, en annan begränsning av organoid modeller är att av storlek, medan den genomsnittliga längden på en mänsklig hjärna ca 167 mm, hjärnan organoider som gjorts med hjälp av agitation växa upp till 4 mm8 och organoider som bildas av detta protokoll växa till 1-2 mm med 10 veckor. Icke desto mindre, detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera mänskliga hjärnvävnad och samspelet mellan flera celltyper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Mänskliga hjärnorganoider differentierade från embryonala stamceller erbjuder en unik möjlighet att studera komplicerade interaktioner mellan flera celltyper i ett tredimensionellt system. Här presenterar vi en relativt enkel och billig metod som ger hjärnan organoider. I detta protokoll mänskliga pluripotenta stamceller är uppdelade i små kluster i stället för enstaka celler och odlas i grundläggande medier utan en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer, så att den inneboende utvecklingssignaler att forma den organoidens tillväxt. Detta enkla system producerar en mångfald av hjärncelltyper inklusive glia- och mikrogliala celler, stamceller och nervceller i framhjärnan, mellanhjärnan och hindbrain. Organoider som genereras från detta protokoll visar också kännetecken för lämplig tids- och rumslig organisation som demonstreras av brightfield bilder, histologi, immunfluorescens och kvantitativa omvänd transkriptionspolymerasreaktion i realtid ( qRT-PCR). Eftersom dessa organoider innehåller celltyper från olika delar av hjärnan, de kan användas för att studera en mängd sjukdomar. Till exempel, i en nyligen papper visade vi användningen av organoider som genereras från detta protokoll för att studera effekterna av hypoxi på den mänskliga hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan användas för att undersöka en rad annars svåra att studera tillstånd såsom neurodevelopmental handikapp, genetiska sjukdomar, och neurologiska sjukdomar.

Bild 1 visar representativa brightfield bilder av flera tidpunkter för att visa hur cellerna / organoider ser ut i hela de olika stadierna av protokollet. HESCs avlägsnades från vävnadsodlingsplattan, bröts i små bitar och placerades i en T75 ultralåg fastsättningskolv där de bildade sfärer. Det är viktigt att notera att cellerna ser ljusa och liknande i storlek, utan mörka, döende celler i mitten av dessa kluster. Cellerna avvejkades gradvis av bFGF. På dag 5 placerades de i n...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Detta protokoll genererades som ett sätt att producera hjärnan organoider på ett förenklat, lågt kostnadssätt utan exogena tillväxtfaktorer eller källaren membran matris samtidigt som mångfalden av hjärnan celltyper och många funktioner i cellulära organisation.

En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

Mänskliga hjärnorganoider är ett viktigt verktyg för att studera sjukdom i ett system som lätt manipuleras och innehåller en mänsklig inställning och lämplig interaktion av flera celltyper. Denna teknik kan tillämpas för att studera ett flertal sjukdomar i hjärnan, inklusive neuroutvecklingsstörningar, giftiga förolämpningar, och tillväxt och behandling av cancer i hjärnan. Den största fördelen med detta protokoll är förmågan att generera mycket reproducerbara hjärnorganoider med en bred variation av neuronala celltyper.Detta görs med hjälp av ett mycket förenklat arbetsflöde som skulle kunna åstadkommas av de flesta laboratorier. Och dessa produceras på ett tillfälligt lämpligt sätt utan påverkan från specialiserade tillväxtfaktorer eller odefinierade matriser vilket gör det till ett mycket enkelt och kostnadseffektivt system. Till att börja med kombinera 100 mikroliter matris med 5,9 milliliter iskall Dulbeccos Modified Eagle Medium eller F12 media i en 15 milliliter koniska röret.Täck varje brunn i en sex-brunnsplatta med en milliliter av membranmatrisen. Linda plattan i paraffin film och lagra över natten på fyra grader Celsius. Nästa dag, aspirera överflödigt media från varje brunn, skölj brunnarna med F12, och lägg H9 hESCS i en total volym av två milliliter mTeSR1 media per brunn.Odla cellerna från vecka till vecka. Förse dagligen med två milliliter mTeSR1-media och placera plattan i en 37 grader Celsius låg syreinkubator med 5%syre och 5%-koldioxid. Använd glasverktyg för att såda ut skilja celler från kulturen mellan passager.Uppdatera media dagligen. Celler bör passaged fyra till sex dagar före utnyttjande av H9-cellerna för organoid produktion. För att passage cellerna, börja med att skölja dem med DMEM F12 media och aspirera överflödig vätska.Efter sköljning, tillsätt proteaslösning och inkubera cellerna i 40 minuter för att kolonier ska flyta inom brunnen. Därefter tvätta cellerna tre gånger med hjälp av DMEM F12 och vid behov titrera för att göra bitarna mindre. Fördela sedan cellerna vid ett ungefärligt förhållandet mellan en till åtta över fyra sex-brunnsplattor och placera plattorna i inkubatorn och mata dagligen.Efter fyra till sex dagar når cellerna ungefär 80%konfluency. Övergår dem till en vanlig inkubator. Späd proteasbeståndslösningen till en arbetskoncentration genom att tillsätta en milliliter av stamlösningen till fem milliliter DMEM eller F12-medium per varje sex-brunnsplatta med hESCS.Aspirera och ta bort cellodlingsmediet, täck sedan hESCS med proteaslösningen. Placera plattorna i inkubatorn i 10 till 15 minuter eller tills koloniernas kanter rundar uppåt och börjar separera från matrisen men innan de avrundar helt. Luta plattan, aspirera proteaslösningen, och tvätta försiktigt cellerna med två milliliter DMEM eller F12 för varje brunn tre gånger.Se till att kolonierna håller sig fästa vid matrisen. Så det är viktigt att bitarna av ES-celler är i lämplig storlek så se till att de är i dispase för lämplig tid. Om de är där inne för en alltför kort tid, kan det vara mycket svårt att spola bort dem och bryta isär dem.Och om de är där inne för länge, kan de faktiskt bara lossna under tvätten steg. Lägg tillbaka ungefär en till 1,5 milliliter färskt mTeSR-media till varje brunn och spola cellerna från plattan i en 50 milliliter koniska rör med hjälp av mild pipettering. Aspirera och dispensera hESCS inom plattan tills de når ungefär 1/30th av sin ursprungliga storlek.Nu kolonin kluster liknar 250 till 350 mikrometer stora bitar. Överför cellerna till en enda ultra låg fastsättning T75 kolv som innehåller 30 milliliter mTeSR-media utan bFGF. Nästa dag, luta kolven så att de levande cellerna pool i hörnet.Om det finns ett stort antal celler som har hållit sig till botten av kolven, använd en pipett på 10 milliliter för att överföra cellerna till en ny kolv. Räkna med att ha en hög befolkning av döda celler för de första dagarna. När cellerna bosätta sig, aspirera bort media och döda celler lämnar cirka 10 milliliter av media som innehåller levande celler och tillsätt 20 milliliter låg bFGF media kompletteras med 30 nanogram per milliliter bFGF.Efter två dagar, kontrollera cellerna. De flesta av cellerna bör se friska och ljusa. Om dock mer än en tredjedel av cellerna verkar mörka, luta kolven och ersätta 20 milliliter media med 20 milliliter låg bFGF media kompletteras med 20 nanogram per milliliter bFGF.På dag tre, ta bort hälften av media och ersätta med 15 milliliter hESC media kompletteras med 10 nanogram per milliliter bFGF. På dag fem, ersätta hälften av media med 15 milliliter av neuralinduktionsmedia. Efter det, varannan dag, ersätta hälften av mediet med neural induktionsmedia.Efter tre veckor i kultur, tillsätt 100X Penicillin-Streptomycin till media vid en slutlig koncentration av 1X om så önskas. Uppdatera hälften av media varannan dag. I detta protokoll såg de bildade hjärnorganoiderna ljusa och liknande ut i storlek utan mörka döende celler i dessa klusters centra.Cellerna var gradvis avvanda av bFGF. Dag fem placerades de i neural induktionsmedia och de förblev i detta media under hela kulturperioden. Även om organoiderna blev större och därmed mörkare med tiden, expanderade de neurala rosettliknande strukturerna vilket indikerar initieringen av neural differentiering och innehåller drag av det embryonala neuralröret.För att ta en mer ingående titt på genuttrycket inom cellerna utfördes qPCR-analys. Den glutamat transportören VLGUT1 uttrycktes vid två och en halv vecka, ökade vid fem veckor, och förblev konsekvent genom fem månader av kultur. En framhjärna markör Foxg1 uttrycktes på låga nivåer fram till fem veckor i kultur.Den djupa lager markören Tbr1 nådde sin kulmen runt fem veckor och minskade därefter. Medan uttrycket av det övre skiktet markör Satb2, den ventrala markören Eng1, hindbrain ryggmärgsmarkören Hoxb4, liksom oligodendrocyte markör Olig2 alla ökat med tiden. Däremot minskade stamcellsmarkören Sox2 med tiden.Den stödjeceller markör GFAP nådde som mest på fem veckor och förblev relativt konstant därefter. Kom ihåg att ta största möjliga omsorg när du hanterar ES-celler i tidigt stadium organoider för att undvika kontaminering eftersom de odlas utan antibiotika och även komma ihåg att mata enligt schema. Efter denna procedur kan du utvärdera organoiderna med tekniker som kvantitativa RT-PCR för genuttryck och immunofluorescens för proteinuttryck och lokalisering.Med hjälp av denna teknik, kunde vi studera förmågan hos en liten molekyl för att lindra aspekter av mänskliga neonatal hypoxisk skada som modelleras i en hypoxi kammare. Det är signifikant att dessa mänskliga hjärnorganoider uppförde sig på samma sätt som in vivo-musexperiment.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

En snabb och effektiv metod för rening av endoderm celler genereras från mänskliga embryonala stamceller

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Engineering Transplantation-lämplig Retinal Pigment epitel vävnad härrör från mänskliga embryonala stamceller

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Beredning av små RNA-bibliotek för sekvensering från tidiga musembryon

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation och kultur av linguala organoider som härrör från vuxna mussmak stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

En förenklad metod för att generera njurorganoider från humana pluripotenta stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

Etablera organoider från mänsklig tand som ett kraftfullt verktyg mot mekanistisk forskning och regenerativ terapi

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...