Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

وقد دعم السيد ا. باندا بتمويل من زمالة NSF IGERT SBE2 (1144726) ، وأموال بدء التشغيل التي قدمتها جامعه ديلاوير ، والمعهد الوطني للصحة/برنامج IMAT للمعهد الوطني للسرطان (R21CA214299). يتم دعم JHS من خلال التمويل من المعاهد الوطنية للصحة/المعهد الوطني للسرطان برنامج IMAT (R21CA214299) وبرنامج المؤسسة الوطنية للعلوم جائزه الحياة المهنية (1751797). تم دعم الوصول المجهري من قبل المنح من المعاهد الوطنية للصحة-NIGMS (P20 GM103446) ، NSF (1301765) وولاية ديلاوير. تم الحصول علي مجهر الاضاءه المهيكلة بأموال من برنامج منحه البحث والتطوير الفدرالي التابع لولاية ديلاوير (16A00471). وتم الحصول علي المجهر البؤري LSM880 المستخدم للطباعة الحجرية بالليزر الثنائي الفوتون بمنحه للاجهزه المشتركة (الإصدار OD016361).

1. فوتوبوليميرينج قاعده الهيدروجيل
<ol><li>
جمع الكواشف
	<ol>
<li>جمع الليثيوم فينيل-2 ، 4 ، 6-تريميثيلالبنبيزيلفوسفونات (اللفة) ، 3.4 كدي بولي (الاثيلين) غليكول التشكيل (PEGDA) ، ن-الفينيل بيروليتم (NVP) ، اليكسافلور 488 المسمي PEGDA (PEG-488) ، اليكسافلور 633 المسمي PEGDA (PEG-633) ، و PEGylated RGDS الببتيد ( PEG-RGDS) من ا...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير سير عمل يخفف كثيرا من الصعوبة المرتبطة بتوليد وتحليل بيانات TFM. وبمجرد الاعداد ، فان الفوتوباتيرنيد المائية سهله الاستخدام ، مما يتطلب معرفه الممارسات الثقافية القياسية للانسجه والمجهر الفلوري. ويتيح الجانب الخالي من الإشارات التنقل الحر علي الهلام الما?...

المجهر قوه الجر (TFM) هي عمليه تقارب القصبات الخلوية باستخدام الحقول الازاحه محرف من علامات ايماني المتولدة من قبل الخلية الملتصقة ومقلص. باستخدام tfm ، وتاثير العظة الميكانيكية في البيئة خارج الخلية علي العمليات الخلوية الهامه مثل الانتشار ، والتمايز ، والهجرة يمكن التحقيق1،2،3،4 ،5،6،7،8،9،10،11،12. لسوء الحظ ، قد يكون من الصعب تنفيذ العديد من النهج الحالية أو تتطلب إلمام بالأداات التحليلية والحسابية عاليه التخصص مما يجعل TFM صعبه للباحثين عديمي الخبرة لاستخدام. ونحن نقدم وصفا لمنهجيه لتوليد منصة TFM التي تزيل بعض الصعوبة في التحليل في حين توفر أيضا الحصول علي البيانات عاليه الانتاجيه.
من النهج الحالية TFM ، والأكثر استخداما لقياس السلالة المادية ينطوي علي ادراج علامات الفلورسنت الصغيرة (عاده نانو أو ميكرومتر الحجم الخرز الفلورسنت) في هيدروجيل تشوه ، مثل بولياكرياميد (PAA) أو بولي (جلايكول الاثيلين) تشكيل (pegda)13،14،15. وتوفر هذه النهج القائمة علي الخرزات القدرة علي وضع علامات لايماني العنقودية الكثيفة حول خليه ذات اهميه لتعظيم أخذ عينات الازاحه. لسوء الحظ ، لا يمكن السيطرة علي توزيع الخرز في جميع انحاء هيدروجيل مباشره بحيث التنظيم المكاني عشوائي. هذا الوضع العشوائي يؤدي إلى مشاكل مثل الخرز التي هي قريبه جدا من بعضها البعض لحل بدقه ، أو حتى تنتشر ان بقع من الركيزة تسفر عن بيانات ذات جوده منخفضه. كما ان عدم القدرة علي التنبؤ بالمكان الذي تقع فيه علامات الإيماني في غياب الخلايا يخلق قيدا أيضا ، بالنسبة لكل مجموعه تجمع من بيانات جر الخلايا ، يجب أيضا التقاط صوره مرجعيه اضافيه للعلامات الاساسيه في حاله الاسترخاء. الصورة المرجعية مطلوبه بحيث يمكن تقريب الازاحه في الصورة المجهدة كالفرق بين الصور المجهدة وغير المجهدة. ولتحقيق حاله استرخاء ، فان الخلايا التي يجري قياسها اما ان تخفف كيميائيا أو ان تتم ازالتها بالبالكامل. هذه العملية غالبا ما تمنع الحصول علي المزيد من القياسات التجريبية ، ويمنع دراسات الخلايا علي المدى الطويل ، ويحد من الانتاجيه. كما تتطلب الصورة المرجعية تقنيات تسجيل الصور لاستيعاب الانحراف الذي قد يكون حدث اثناء التجريب ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى المطابقة اليدوية المرهقة لصور حاله الضغط للاشاره إلى الصور.
طرق tfm الأخرى التي تعتبر خاليه من المرجع ، وتنفيذ شكل من اشكال السيطرة علي توزيع علامات الإيماني ، اما عن طريق الطباعة الحجرية عاليه الدقة ، المطبوعة الاتصال المجهري ، أو ميكرومتر16،17،18 و19و20. ويتحقق TFM خاليه من المرجع من خلال افتراض ان حاله استرخاء لكل علامة ايماني يمكن التنبؤ بها استنادا إلى كيفيه وضع علامة وصفت خلال عمليه التصنيع. تسمح هذه الطرق بالتقاط الكامل لحاله التوتر في الخلية داخل التقاط صوره واحده يتم فيها قياس عمليات أزاحه العلامة ايماني بالمقارنة مع مرجع ضمني مما يمكن الاستدلال عليه من هندسه علامة الإيماني. وبينما يتحقق الاتساق في وضع العلامات عاده باستخدام هذه المنصات ، فانها تعاني عموما من أوجه القصور الخاصة بها مقارنه بالنهج القائمة علي الخرزة المستخدمة علي نطاق واسع ، بما في ذلك: 1) انخفاض قرار الجر ؛ 2) انخفاض دقه النزوح خارج الطائرة (في بعض الحالات عدم القدرة الكاملة علي قياس) ؛ و 3) انخفاض تفصيل من ركائز منصة والمواد (علي سبيل المثال ، يجند العرض ، والخواص الميكانيكية).
لمعالجه أوجه القصور هذه ، قمنا بتصميم منصة TFM الجديدة الخالية من الإشارات. تستخدم المنصة الكيمياء المنشطة متعددة الفوتونات للربط بين كميه صغيره من الفلوروفيمور في مواقع محدده ثلاثية الابعاد داخل هيدروجيل التي تعمل كعلامات ايماني لقياس السلالة المادية. وبهذه الطريقة ، قمنا بتصميم منصة تعمل بشكل مماثل للنهج القائمة علي الخرزة ولكن مع الفائدة الكبيرة التي يتم تنظيم علامات ايماني في صفائف الشواية مما يسمح لتتبع سلاله المواد الخالية من المرجع. توفر هذه الخاصية الخالية من الإشارات العديد من المزايا. أولا وقبل كل شيء ، فانه يسمح لرصد غير تدخليه من الدول الجر الخلوية (اي ، التفاف علي الحاجة إلى الاسترخاء أو أزاله الخلايا للحصول علي المواقع المرجعية من علامات ايماني النازحين). وكان هذا هو هدفنا الأساسي في تصميم هذا النظام ، ونحن عازمون علي دمج الأساليب التحليلية الأخرى المصب جنبا إلى جنب مع TFM ، والتي يمكن ان تكون صعبه مع النهج المدمرة TFM نقطه النهاية. ثانيا ، استخدام مرجع ضمني يستند إلى صفائف موزع جيس يسمح لاتمته شبه كامله من تحليل الازاحه. ويؤدي انتظام المصفوفات إلى إنشاء سير عمل يمكن التنبؤ به حيث يمكن الحفاظ علي الحد الأدنى من حالات الحالات الاستثنائية (اي ، نموذج بيانات الخلية التي تحتوي علي تحف غير متوقعه مثل تباعد العلامات دون الأمثل أو تفاوتات التسجيل). ثالثا ، التخلي عن الحاجة إلى الحصول علي صوره مرجعيه يوفر الحرية لرصد العديد من الخلايا علي عينه واحده علي مدي فترات طويلة من الزمن. وهذا يتناقض مع النهج التقليدية القائمة علي حبه ، حيث ، اعتمادا علي الإخلاص من الحركات المرحلة الألى المجهر ، يمكن ان تتراكم الأخطاء في تحديد المواقع وزيادة صعوبة تسجيل الصور المرجعية بشكل صحيح إلى توتر الخلية الصور. وعموما ، تسهل هذه المنصة إنتاجيه اعلي في جمع بيانات التوتر الخلوي.
مع هذا البروتوكول ، ونحن نامل في تعريف القراء مع اثنين من الفوتون ، ليزر المسح الحجري تقنيه الطباعة التي قمنا بتنفيذها لتوليد هذا منصة TFM خاليه من الإشارات لقياس مكونات الجر في الطائرة وخارج الطائرة التي تولدها الخلايا المصنفة علي السطح. غير مشمولة في هذا البروتوكول هو توليف بعض المكونات مونوميريك. وبصفه عامه ، تتضمن ردود الفعل هذه ما يكاد يكون مطابقا لمخططات التفاعل التوليفي "الواحد" الموصوفة سابقا بأنها21، ويمكن أيضا شراء بدائل لهذه المنتجات. ونحن نهدف أيضا إلى تعريف القراء بالأداات المستندة إلى البرامج التي قمنا بإنشاءها لتعزيز استخدام مجاهر المسح بالليزر المتاحة تجاريا كاداات طباعه ثلاثية الابعاد ولتسهيل تحليل عمليات أزاحه علامات الإيماني.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

يوفر القياس الكمي لتشوه المواد الناتج عن الخلايا معلومات مفيده تتعلق بكيفية تحسس الخلايا والاستجابة للخصائص الفيزيائية لبيئتها الصغرى. في حين توجد العديد من النهج لقياس السلالة المادية التي يسببها الخلايا ، وهنا نقدم منهجيه لرصد الضغط مع القرار الفرعي ميكرون بطريقه خاليه من الإشارات. باستخدام عمليه الزخرفة الضوئية المنشطة ثنائيه الفوتون ، فاننا نثبت كيفيه توليد ركائز تركيبيه قابله للتوقد ميكانيكيا وحيويا والتي تحتوي علي صفائف مدمجه من علامات ايماني الفلورسنت لقياس ثلاثي الابعاد بسهوله ( 3D) ملامح تشوه المواد استجابه لtractions السطح. باستخدام هذه الركائز ، يمكن تعيين ملفات تعريف توتر الخلية باستخدام كومه صور ثلاثية الابعاد واحده لخليه ذات اهتمام. هدفنا مع هذه المنهجية هو جعل المجهر قوه الجر أكثر سهوله وأسهل لتنفيذ أداه للباحثين دراسة عمليات الميكنة الخلوية ، وخاصه الوافدين الجدد إلى الميدان.

وفي جميع مراحل البروتوكول ، هناك عدد من نقاط التفتيش التي توفر التغذية المرتدة لتقييم نوعيه الاجراء الزخرفة. ولتقديم بعض الأفكار بشان كيفيه تقييم التقدم المحرز في كل نقطه من نقاط التفتيش هذه ، نقدم نتائج تمثيليه للتجربة الفعلية. وتسلط النتائج الضوء علي تطبيق هذا البروتوكول الذي اجري علي ?...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

يوفر هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ الطباعة الحجرية متعددة الفوتونات لصنع صفائف ثلاثية الابعاد من علامات الإيماني الفلورية المضمنة في الهلام المائي القائم علي البولي إيثيلين غليكول لاستخدامه كاشاره خاليه ، مجهر قوه الجر منصات. باستخدام هذه التعليمات ، يتم تبسيط قياس السلالة المادية ثلاثية الابعاد وحساب عمليات التعقب الخلوية لتعزيز قياسات قوه الجر عاليه الانتاجيه.

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

ويستخدم المجهر قوة الجر لقياس القوات التي تولدها الخلية. ويبسط هذا البروتوكول تحليل جمع بيانات قوة الجر، من أجل جعلها أكثر سهولة للمستخدمين عديمي الخبرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على منصات المجهر قوة الجر الخالية من المرجعية الحالية ، هي أن الطباعة الحجرية متعددة الصور تسمح بإعادة تصميم إعداد النقش السريع والسهل وفقًا للاحتياجات التجريبية الفردية.هناك العديد من الخطوات الرئيسية في تصنيع وتنفيذ منصة الجر الجديدة الخالية من المراجع التي يسهل فهمها من خلال التمثيل المرئي بدلاً من النص وحده. بالنسبة للوثنية من الهيدروجيل الأساسي ، أضف أولاً ثلاثة ميكروليترات من محلول ما قبل البوليمر على ورقة رقيقة ومسطحة من الككانات البيرفلوروالكوكسي ، ووضع شرائط PDMS سميكة 150 ميكرومتر مسطحة تحيط ، ولكن ليس على اتصال ، قطرة محلول ما قبل البوليمر. ضع غطاءً سيلانيز سيلانيت أكريليت على PDMS، مع أن تكون قطرات ما قبل البوليمر مركزة تحت الغطاء لتسطيح قطرات ما قبل البوليمر بسماكة تباعدات PDMS.يعرض حل ما قبل البوليمر إلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقة واحدة. عندما يتم تشكيل هيدروجيل بالكامل، يفصل بعناية الغطاء عن الفواصل PDMS. استخدام عالية الأداء الاكريليك من جانبين لاصقة لإرفاق مفتوح أسفل طبق بيتري إلى coverslip.خذ عناية خاصة عند التمسك غطاء الهيدروجيل محملة بطبق بيتري. طبق الرطب أو ضغط قليل جدا أثناء تطبيق سوف تسمح التسريبات لتشكيل، وتدمير العينة. تطبيق الضغط على سطح لاصقة لخلق ختم كامل بين غطاء لاصق، لاصق، وطبق بيتري، مع الحرص على عدم كسر الزجاج.استخدام برنامج تلفزيوني معقم مصفاة لشطف الهيدروجيل. ثم إضافة ثمانية ميكرولترات من NVP إلى 800 ميكرولترات من محلول المختبر المعدة لتوليف هيدروجيل. لتحويل صورة ثنائية إلى قناع رقمي، افتح MATLAB وافتح و قم بتشغيل runscript.m MATLAB النصي. حدد ملف TIF ثنائي للتحويل وحدد مجلد لحفظ ملفات المنطقة. إدخال الحجم النهائي المطلوب في ميكرون من الصورة المختارة.سيتم تحجيم صورة الإدخال و أبعادها لمطابقة هذه المعلمات. لإنشاء صفيف بكسل واحد، في منطقة من خيارات مولد الفائدة، قم بإلغاء تحديد مربع إزالة tic ضمن وحدات بكسل صغيرة/مفردة، حدد مربع الساحات تيك ثم ألغ تحديد استخدام ضمن خطوط فاصل أفقي. ثم انقر فوق موافق. سيتم العثور على الملف OVL في المجلد المحدد مسبقاً.افتح الملف في برنامج المجهر وحمّل المناطق المطلوبة التي تتحكم في مصراع الليزر أثناء التصوير الحجري بالليزر الفوتونين. يجب تنفيذ الخطوات التالية في ظروف مع الحد الأدنى من الضوء. لتصنيع صفائف علامة fiducial في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة، مزيج دقيق 200 ميكرولترات من محلول مختبر NVP المعدة مسبقا مع 20 ملليغرام من فلور اليكسا 633 وإزالة كل من برنامج تلفزيوني من الطبق الذي يحتوي على هيدروجيل.أضف خليط PEG-633 إلى الهيدروجيل كقطيرة تشمل تماماً الهيدروجيل الأساسي وتحميل طبق بيتري على حامل العينة من مرحلة المجهر. ثم تغطية الطبق والسماح لمحلول النقش لامتصاص في الهيدروجيل لمدة 30 دقيقة على الأقل، محمية من الضوء. لتكوين المجهر للتصوير، حدد الليزر المناسب والفلاتر لتصور فلور أليكسا 488.حدد موقع الهيدروجيل باستخدام إشارة PEG-488 وحظر جمع أطوال موجية أطول من الكاشف. استخدام لوحات عمودية وأفقية بمسح لتحديد موقع مركز الهيدروجيل في الطائرة س ص وصفر المرحلة في هذا الموقف. استخدام خط المسح الضوئي في دالة Z-المكدس لتحديد موقع سطح الهيدروجيل وصفر التركيز في هذا الموقف.مستوى الهيدروجيل عن طريق تكرار خط بمسح بعيدا عن مركز XY لتحديد موضع السطح، وضبط مجموعة مسامير لمرحلة المجهر، حسب الضرورة. ضمن مساحة عمل برنامج المجهر، قم بإنشاء ملف تجربة منفصل للتصوير الضوئي وتعيين الطاقة متعددة الفوتونات إلى 1.8٪ وسرعة المسح الضوئي إلى ستة. اضبط حجم إطار الصورة والبكسل لتحقيق حجم بكسل 0.1 ميكرومتر لكل بكسل ونسبة عرض إلى ارتفاع 100 إلى واحد، ثم قم بتحميل ملف المناطق في علامة تبويب المنطقة.استخدام ماكرو لتعيين كافة المناطق للحصول على وتشغيل دالة Z-مكدس. تعيين التباعد إلى 3.5 ميكرومتر لعمق إجمالي 28 ميكرومتر والعدد الإجمالي لشرائح Z من تسعة. ثم استخدم وظيفة المواضع لتعيين مواقع محددة على الهيدروجيل حيث سيتم صفائف علامة fiducial يكون photopatterned.مع اقتراب وقت الناقع من علامة 30 دقيقة ، احصل على مسح متتالي لخط Z -stack لسطح الهيدروجيل كل خمس دقائق للتحقق من وجود تورم استنادًا إلى التغييرات في موقع السطح نسبة إلى موضع التركيز الصفري. إذا لم يحدث أي تغيير في موضع السطح على مدى الفاصل الزمني لمدة خمس دقائق، تشغيل إعدادات النقش واستخدام الليزر 488 نانومتر للتحقق من أن سطح الهيدروجيل لم يتحرك أثناء النقش. ثم قم بإزالة الهيدرجيل من المجهر، وقم بتبخر محلول PEG-633 من طبق بيتري، وشطف الطبق بـ PBS العقيمة المصفاة.للحصول على خلية وصور علامة fiducial، والعودة طبق بيتري إلى حامل العينة لتحديد المناطق منقوشة. تحديد موقع خلية ذات أهمية والحصول على صورة منقولة أو فلورية من الخلية. ثم الحصول على Z-المكدس من مجموعة منقوشة تحت الخلية كما هو موضح، والحصول على مجموعة ثانية من الصور المرسلة أو الفلورية الخلية.عند تجميع مجموعة صور، يجب أن تعرض الصور الناتجة مجموعة منتظمة من الميزات المنقوشة التي تتذبذب في شدتها كدالة لموضع Z داخل مجموعة الصور. التعقب m البرنامج النصي يوفر عدة صور التشخيص، بما في ذلك الإسقاط Z من علامات الفلورسنت فيدوسي لتقييم جودة المعالجة المسبقة، مؤامرة من المركزية المكتشفة، واللون مرمزة كدالة من موقف Z لتقييم جودة الكشف عن الكائن، ومؤامرة من المسارات التي تمثل تمركز علامة الكشف التي تم ربطها في أعمدة في الاتجاه Z لتقييم جودة تتبع الكائن.يوفر البرنامج النصي 3D .M DISP مؤامرة من الكثافة كدالة للموقف Z لكل عمود من الميزات المكتشفة في مجموعة صور معينة لتقييم جودة التشكيلات كثافة علامة fiducial. كلا DISP 3D.م و DISP القص. m معا توفير المدرجات البيانية للضوضاء النزوح قياس في كل من الأبعاد الإحداثية الديكارتية فضلا عن الخرائط الحرارية المستقَدّلة من النزوح. وبالإضافة إلى ذلك، final3D_2 تداخل.m يوفر خرائط الحرارة من الجر السطح تحسب باستخدام التعليمات البرمجية الاستعانة بمصادر خارجية. أهم شيء يجب تذكره أثناء هذا الإجراء هو أن الحلول التي تحتوي على LAP حساسة للضوء ويجب أن تكون محمية قدر الإمكان من مصادر الضوء المحيط. تذكر أن NVP هو مركب عضوي متطاير ويجب التعامل معه دائمًا في غطاء للتدفق الكيميائي.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

عالية الإنتاجية الجر قوة الفحص المجهري باستخدام PDMS يكشف عن الآثار التي تعتمد على الجرعة من تحويل عامل النمو-β على الانتقال الظهاري إلى Mesenchymal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

تنفيذ مجهريانعكاس التداخل للتصوير عالي السرعة وخالٍ من الملصقات من الأنابيب الدقيقة

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...