Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

O. A. Banda blev støttet af midler fra en NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), Startup midler fra University of Delaware, og National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS understøttes af midler fra National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) og National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi adgang blev støttet af tilskud fra NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) og staten Delaware. Den strukturerede belysning mikroskop blev erhvervet med midler fra staten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 confokale mikroskop anvendes til to-photon Laserscanning litografi blev erhvervet med en delt instrumentering Grant (S10 OD016361).

1. photopolymerizing en PEGDA base hydrogel
<ol><li>
Indsamling af reagenser
	<ol>
<li>Indsamle lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforat (LAP), 3,4 kDa poly (ethylen) glykol diacrylat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mærket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mærket PEGDA (PEG-633) og pegyleret RGDS peptid ( Eller PEG-RGD'ER) fra deres respektive frysere og Bring hver til stuetemperatur.</li>
		<li>I separate rav-mikrocentrifuge glas måles 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 ...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

Målet med denne protokol er at tilvejebringe en arbejdsgang, der letter en stor mængde af vanskelighederne i forbindelse med generering og analyse af TFM-data. Når de er tilberedt, er de photopatterned silicagelrogeler enkle at bruge, kræver kun viden om standard vævskultur praksis og Fluorescens mikroskopi. Det referencefri aspekt muliggør ubekymret navigation på celle belastede silicagelrogeler og eliminerer besværlige billedbehandlings trin såsom billedregistrering mellem reference og deformerede billeder. De...

Trækkraft mikroskopi (TFM) er processen med at tilnærme cellulære distraktionerne ved hjælp interpoleret forskydning felter af fiducial markører genereret af en vedhængende og kontraktile celle. Ved hjælp af TFM kan indflydelsen fra mekaniske signaler i det ekstracellulære miljø på vigtige cellulære processer såsom spredning, differentiering og migration undersøges1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Desværre kan mange eksisterende tilgange være vanskelige at gennemføre eller kræve kendskab til højt specialiserede analytiske og beregningsmæssige værktøjer gør TFM vanskeligt for uerfarne forskere til at bruge. Vi beskriver en metode til at generere en TFM platform, der eliminerer nogle af de vanskeligheder i analysen, samtidig med at høj gennemløb dataindsamling.
Af de eksisterende TFM-tilgange omfatter de hyppigst anvendte til kvantificering af materiale stammen inkorporering af små fluorescerende markører (typisk fluorescerende perler i nano-eller mikrometer størrelse) i en deformerbar hydrogel, såsom polyacrylamid (PAA) eller poly (ethylenglycol) diacrylat (pegda)13,14,15. Disse perle baserede tilgange giver mulighed for tæt klynge fiducial markører omkring en celle af interesse for at maksimere forskydning prøveudtagning. Desværre kan fordelingen af perlerne i hele hydrogel ikke styres direkte, så den rumlige organisation er tilfældig. Denne tilfældige placering fører til problemer såsom perler, der er for tæt på hinanden til præcist at løse, eller så sprede, at patches af substrat udbytte lav kvalitet data. Den manglende evne til at forudsige, hvor fiducial markører ligger i fravær af celler også skaber en begrænsning, at for hver indsamlede sæt af celle trækkraft data, en yderligere referencebillede af de underliggende markører i en afslappet tilstand skal også tages til fange. Referencebilledet er påkrævet, så forskydningen i det stressede billede kan tilnærses som forskellen mellem de stressede og ustressede billeder. For at opnå en afslappet tilstand, de celler, der måles, er enten kemisk afslappet eller helt fjernet. Denne proces forhindrer ofte erhvervelse af yderligere eksperimentelle målinger, hæmmer langsigtede celle undersøgelser, og begrænser gennemløb. En referencebillede kræver også billedregistrering teknikker til at rumme for drift, som kan have fundet sted under eksperimenter, ofte fører til besværlig manuel matchning af stress tilstand billeder til reference billeder.
Andre TFM-metoder, som anses for reference frie, gennemfører en eller anden form for kontrol over fordelingen af fiducial markører, enten ved højopløsnings litografi, mikrokontakttrykning eller mikromolding16,17,18 ,19,20. Den reference frie TFM opnås ved at antage, at den afslappede tilstand for hver fiducial markør kan forudsiges ud fra, hvordan markør positioner blev ordineret under fremstillingsprocessen. Disse metoder giver mulighed for fuldstændig opsamling af en celles spændingstilstand inden for et enkelt billede, hvor fiducial markør forskydninger måles i forhold til en implicit reference, end der kan udledes af den fiducial markør geometri. Selv om konsistens i markørplacering typisk opnås ved hjælp af disse platforme, lider de generelt af deres egne mangler i forhold til de udbredte perle baserede tilgange, herunder: 1) nedsat trækkraft opløsning; 2) nedsat nøjagtighed af out-of-plane forskydninger (i nogle tilfælde en fuldstændig manglende evne til at måle); og 3) nedsat customizability af platform substrater og materialer (f. eks. ligand præsentation, mekaniske egenskaber).
For at afhjælpe disse mangler designede vi en ny reference-fri TFM-platform. Platformen udnytter multiphoton aktiveret kemi til at link en lille volumen af en fluoroforet i specifikke 3D steder inden for hydrogel, der tjener som fiducial markører til at måle materiale stamme. På denne måde har vi designet en platform, der fungerer på samme måde som Bead-baserede tilgange, men med den betydelige fordel, at fiducial markører er organiseret i gridded arrays giver mulighed for reference-fri materiale stamme tracking. Denne reference-fri ejendom giver mange fordele. Først og fremmest, det giver mulighed for ikke-påtrængende overvågning af cellulære trækkraft stater (dvs., omgår behovet for at slappe af eller fjerne celler til at erhverve referencepositioner af fordrevne fiducial markører). Dette var vores primære mål i udformningen af dette system, da vi havde til hensigt at indarbejde andre downstream analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskeligt med destruktive end-punkt TFM tilgange. For det andet, ved hjælp af en implicit reference baseret på gridded arrays giver mulighed for nær-komplet automatisering af fortrængnings analyse. Den formelle rigtighed af arrays skaber en forudsigelig arbejdsgang, hvor forekomsten af ekstraordinære tilfælde (dvs. prøve celledata, der indeholder uventede artefakter såsom suboptimal markør afstand eller registrering mismatch) kan opretholdes på et minimum. For det tredje giver afkald på behovet for at erhverve et referencebillede frihed til at overvåge mange celler på en enkelt prøve over længere tidsperioder. Dette står i kontrast til traditionelle perle baserede tilgange, hvor fejl i positionering kan akkumulere og øge vanskeligheden ved korrekt registrering af reference billeder til celle spændinger, afhængigt af hvordan mikroskopet er i automatiseret fase bevægelser. Billeder. Samlet set, denne platform letter højere gennemløb i indsamling cellulære spænding data.
Med denne protokol, vi håber at gøre læserne med de to-foton, Laserscanning litografi teknik, som vi implementeret for at generere denne reference-fri TFM platform til at måle in-plane og out-of-plane trækkraft komponenter genereret af celler seedet på overfladen. Ikke omfattet af denne protokol er syntesen af nogle af de monomeriske komponenter. Generelt omfatter disse reaktioner næsten identiske "One-pot"-syntese reaktions ordninger, der er beskrevet tidligere21, og alternativer til disse produkter kan også købes. Vi sigter også mod at gøre læserne bekendt med de softwarebaserede værktøjer, vi har genereret for at fremme brugen af kommercielt tilgængelige laser scannings mikroskoper som 3D-udskrivnings værktøjer og for at lette analysen af de fiducial markør forskydninger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

Kvantificering af celle induceret materiale deformation giver nyttige oplysninger om, hvordan cellerne fornemmer og reagerer på de fysiske egenskaber i deres mikromiljø. Mens mange tilgange findes til måling af celle-induceret materiale stamme, her giver vi en metode til overvågning af stamme med sub-micron opløsning på en reference-fri måde. Ved hjælp af en to-foton aktiveret photolithographic mønster proces, viser vi, hvordan man genererer mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske substrater, der indeholder indlejrede arrays af fluorescerende fiducial markører til nemt at måle tredimensionelle ( 3D) materiale deformation profiler som reaktion på overflade tractions. Ved hjælp af disse substrater kan celle spændings profiler tilknyttes ved hjælp af en enkelt 3D-billedstak af en celle af interesse. Vores mål med denne metode er at gøre Traction Force mikroskopi en mere tilgængelig og lettere at implementere værktøj til forskere, der studerer cellulære mekanisotransduktionsprocesser, især nytilkomne til marken.

I hele protokollen er der en række kontrolpunkter, som giver feedback til at vurdere kvaliteten af mønstret procedure. For at give en vis indsigt i, hvordan man vurderer fremskridtene på hvert af disse checkpoints, giver vi repræsentative resultater af et egentligt eksperiment. Resultaterne fremhæver anvendelsen af denne protokol udført på en photopatterhydrogel, der er forberedt til TFM-analyse af humane navle vene endotheliale celler (Huvec'er). Resultaterne omfatter rå billeddata samt forarbejdede data udgange...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Denne protokol indeholder instruktioner til implementering af multiphoton litografi til at fabrikere tredimensionelle arrays af fluorescerende fiducial markører indlejret i poly (ethylenglycol)-baserede silicagelrogeler til brug som reference-fri, trækkraft mikroskopi Platforme. Ved hjælp af disse instruktioner forenkles måling af 3D-materiale stamme og beregning af cellulære distraktionerne for at fremme målinger af trækkraft med høj gennemløb.

Fabrikation og implementering af en reference-fri trækkraft mikroskopi platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Trækkraftmikroskopi bruges til at måle cellegenererede kræfter. Denne protokol forenkler indsamlingsanalysen af trækkraftdata for at gøre dem mere tilgængelige for uerfarne brugere. Den største fordel ved denne teknik i forhold til eksisterende reference-fri trækkraft mikroskopi platforme, er, at multiphoton litografi giver en hurtig og nem mønster indstilling redesign i henhold til de enkelte eksperimentelle behov.Der er mange vigtige trin i fremstillingen og gennemførelsen af denne nye reference-fri trækkraft platform, der er lettere at forstå gennem visuel repræsentation snarere end tekst alene. Til fotopolymerisering af basishydrgelen skal der først tilsættes tre mikroliter af præpolymeropløsningen på et tyndt, fladt ark perfluoroalkoxy-alkalner, og der skal være flade 150 mikrometer tykke PDMS-strimler omkring, men ikke i kontakt med dråben af præpolymeropløsning. Placer en acrylat silanized coverslip på PDMS, med pre-polymer dråbe centreret under coverslip at flade pre-polymer dråbe til tykkelsen af PDMS afstandsløbere.Udsæt den klemt præ polymeropløsning til UV-lys i ca. et minut. Når en hydrogel er fuldt dannet, skal du forsigtigt adskille dækslæbet fra PDMS afstandsklip. Brug højtydende dobbeltsidet akryllim til at fastgøre en åben bund petriskål til dækslæbet.Vær særlig forsigtig, når du klæber den hydrogel-belæssede coverslip til Petriskålen. En våd skål eller for lidt tryk under påføring vil tillade lækager til at danne, ødelægger prøven. Tryk på den klæbende kontaktflade for at skabe en komplet tætning mellem dækslæbet, limen og petriskålen, idet du skal passe på ikke at knække glasset.Brug sterilt filtreret PBS til at skylle hydrogelen. Derefter tilsættes otte mikroliter NVP til 800 mikroliter af laboratorieopløsningen, der er forberedt til hydrogelsyntesen. Hvis du vil konvertere et binært billede til en digital maske, skal du åbne MATLAB og åbne og køre løbesescriptet.m MATLAB-script. Vælg den binære TIF-fil til konvertering, og vælg en mappe for at gemme områdets filer. Indtast den ønskede endelige størrelse i mikron af det valgte billede.Inputbilledet skaleres og dimensioneres, så det svarer til disse parametre. Hvis du vil oprette en enkelt pixelmatrix, skal du fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet Fjern tic under Små områder/enkelte pixel i indstillinger for interessegenerator, markere afkrydsningsfeltet Firkanter og fjerne markeringen i Brug under Vandrette brydlinjer. Klik derefter på OK. OVL-filen findes i den tidligere angivne mappe.Åbn filen i mikroskopsoftwaren, og indlæs de ønskede områder, der styrede laserdodderen under to fotonlaserscannings litografi. Følgende trin bør udføres under forhold med minimalt lys. Til fremstilling af fiducial markør arrays under svagt lys betingelser, grundigt blande 200 mikroliter af den tidligere forberedte NVP lab løsning med 20 milligram Alexa Fluor 633 og fjerne alle PBS fra skålen indeholder hydrogel.Peg-633-blandingen til hydrogelen som en dråbe, der helt omfatter basishydrgelen, og petriskålen læsses på prøveholderen på mikroskopstadiet. Derefter dække fadet og lad mønsteropløsningen suge ind i hydrogel i mindst 30 minutter, beskyttet mod lys. Hvis du vil konfigurere mikroskopet til billedbehandling, skal du vælge de relevante lasere og filtre til visualisering af Alexa Fluor 488.Hydrogelen skal lokaliseres ved hjælp af PEG-488-signalet, og indkreds samlingen af længere emissionsbølgelængder fra detektoren. Brug lodrette og vandrette feltscanninger til at finde midten af hydrogelen i XY-planet og nul trin i denne position. Brug linjescanninger i Z-stack-funktionen til at finde hydrogelens overflade og nulfokus i denne position.Niveau hydrogel ved at gentage linjen scanninger væk fra XY center for at identificere overfladepositionen, justere de indstillede skruer til mikroskop fase, efter behov. I mikroscope-softwarearbejdsområdet skal du oprette en separat eksperimentfil til fotopattering og indstille multifoton-strømmen til 1,8 % og scanningshastigheden til seks. Juster størrelsen på billedrammen og pixel for at opnå en pixelstørrelse på 0,1 mikrometer pr. pixel og et højde-bredde-forhold på 100 til et, og indlæs områdefilen i områdets fane.Brug en makro til at indstille alle de områder, der skal hentes og aktiveres. Afstand skal indstilles til 3,5 mikrometer for en samlet dybde på 28 mikrometer og det samlede antal Z-skiver på ni. Brug derefter funktionen Positioner til at angive bestemte steder på hydrogelen, hvor de fiduciale markørarrays vil blive fotopatterned.Som suge tid nærmer sig 30 minutter mærket, erhverve successive Z-stack linje scanninger af overfladen af hydrogel hvert femte minut for at kontrollere for hævelse baseret på ændringer i placeringen af overfladen i forhold til nulstillet fokus position. Hvis der ikke er sket nogen ændring i overfladepositionen i løbet af intervallet på fem minutter, skal du køre mønsterindstillingerne og bruge 488 nanometerlaseren til at kontrollere, at hydrogelens overflade ikke bevægede sig under mønsteret. Fjern derefter hydrogelen fra mikroskopet, aspirere PEG-633-opløsningen fra petriskålen, og skyl skålen med sterilt filtreret PBS.Hvis du vil anskaffe en celle- og fiducial markørbilleder, skal petriskålen returneres til prøveholderen for at finde de mønstrede områder. Find en celle af interesse og erhverve en overført eller fluorescerende billede af cellen. Anskjære derefter en Z-stack af den mønstrede matrix under cellen som påvist, og erhverve et andet sæt transmitterede eller fluorescerende billeder af cellen.Når du indsamler en billedstak, skal de resulterende billeder vise en regelmæssig vifte af mønstrede funktioner, der svinger i intensitet som en funktion af Z-positionen i billedstakken. Sporingen. m script giver flere diagnostiske billeder, herunder en Z-projektion af fluorescerende fiducial markører til at vurdere den præ-behandling kvalitet, et plot af de fundne centroider, farvekodet som en funktion af Z position til at vurdere objektet afsløring kvalitet, og et plot af de spor, der repræsenterer de fundne markør centroids, der er blevet knyttet til kolonner i Z retning til at vurdere objektet tracking kvalitet.DISP 3D.m-scriptet giver et billede af intensitet som en funktion af Z-positionen for hver kolonne af fundne funktioner i en given billedstak for at vurdere kvaliteten af de fiduciale markørintensitetsprofiler. Begge DISP 3D.m og DISP-forskydning. m sammen giver histogrammer af den målte forskydningsstøj i hver af de kartesiske koordinatdimensioner samt interpolerede varmekort over forskydning. Desuden er interp final3D_2.m giver varme kort over overfladen trækkraft beregnet ved hjælp af outsourcet kode. Det vigtigste at huske under denne procedure er, at opløsninger, der indeholder LAP, er følsomme over for lys og bør beskyttes så meget som muligt mod omgivende lyskilder. Husk, at NVP er en flygtig organisk forbindelse og altid skal håndteres i en kemisk flowhætte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode til lokalisering Reporter fluorescerende kugler nærheden cellekulturen overflade for trækkraft Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force mikroskopi Imaging og Kraft spektroskopi af understøttede lipiddobbeltlag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En High-throughput Cell Microarray Platform for korrelative Analyse af Cell Differentiering og Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Høj kapacitet trækkraft mikroskopi ved hjælp af PDMS afslører dosis-afhængige effekter af omdanne vækstfaktor-β på epitelial-til-Mesenchymal overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Gennemførelse af interferens refleksion mikroskopi for label-fri, High-Speed billeddannelse af Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Trækkraft mikroskopi integreret med Microfluidics til kemo-aktisk kollektiv migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

En brugerdefineret multifoton mikroskopi platform for Live Imaging af mus hornhinde og konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...