Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

O. A. Banda werd gesteund door de financiering van een NSF IGERT SBE2 Fellowship (1144726), opstart fondsen van de Universiteit van Delaware en het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS wordt ondersteund door de financiering van het National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) en het National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). De toegang tot microscopie werd ondersteund door subsidies van de NIH-NIGMS (P20 GM103446), de NSF (IIA-1301765) en de staat Delaware. De gestructureerde verlichtings Microscoop werd verworven met fondsen van de staat van Delaware Federal Research and Development subsidieprogramma (16A00471). De LSM880 confocale Microscoop gebruikt voor Two-photon laser scanning lithografie werd verworven met een gedeelde instrumentatie subsidie (S10 OD016361).

1. photopolymerizing een PEGDA base hydrogel
<ol><li>
Reagentia verzamelen
	<ol>
<li>Verzamel Lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylfosforaat (LAP), 3,4 kDa poly (ethyleen) glycol diacrylaat (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 gelabeld PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 gelabeld PEGDA (PEG-633), en Gepegyleerd RGDS peptide ( PEG-RGDS) uit hun respectieve vriezers en breng elk op kamertemperatuur.</li>
		<li>In afzonderlijke Amber micro centrifugebuizen, maatregel 3 mg van de schoot, 10 mg P...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

Het doel van dit protocol is om een workflow te bieden die veel van de problemen die gepaard gaan met het genereren en analyseren van TFM-gegevens verlicht. Eenmaal voorbereid zijn de photopatterned hydrogels eenvoudig te gebruiken, waarbij alleen kennis van standaard weefselkweek praktijken en fluorescentiemicroscopie vereist is. Het referentie vrije aspect maakt onbezorgd navigeren op hydrogels met cel beladen mogelijk en elimineert omslachtige beeldverwerkings stappen zoals beeldregistratie tussen referentie-en vervor...

Traction Force microscopie (TFM) is het proces van het benaderingen van cellulaire tracties met behulp van geïntermuleerde verplaatsings velden van fiducial markers gegenereerd door een aanhanger en contractiele cel. Met behulp van tfm, de invloed van mechanische aanwijzingen in de extracellulaire omgeving op belangrijke cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie, en migratie kan worden onderzocht1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Helaas, veel bestaande benaderingen kunnen moeilijk te implementeren of vereisen vertrouwdheid met zeer gespecialiseerde analytische en computationele instrumenten waardoor TFM moeilijk voor onervaren onderzoekers om te gebruiken. We beschrijven een methodologie om een TFM-platform te genereren dat een deel van de moeilijkheidsgraad elimineert, terwijl het ook gegevensverzameling met hoge doorvoer oplevert.
Van de bestaande TFM-benaderingen omvat de meest gebruikte voor het kwantificeren van materiaal stam het opnemen van kleine fluorescerende markers (meestal nano-of micrometer-sized fluorescerende kralen) in een vervormbare hydrogel, zoals Polyacrylamide (PAA) of poly (ethyleenglycol) diacrylaat (pegda)13,14,15. Deze kraal-gebaseerde benaderingen bieden de mogelijkheid om dicht cluster fiducial markers rond een cel van belang voor het maximaliseren van de verplaatsing steekproeven. Helaas kan de verdeling van de parels in de hydrogel niet direct worden geregeld, zodat de ruimtelijke ordening willekeurig is. Deze willekeurige plaatsing leidt tot problemen zoals kralen die te dicht bij elkaar zijn om nauwkeurig op te lossen, of zo verspreid dat patches van de ondergrond lage kwaliteitsgegevens opleveren. Het onvermogen om te voorspellen waar fiducial markers liggen in de afwezigheid van cellen creëert ook een beperking dat, voor elke verzamelde set van cel tractie gegevens, ook een extra referentiebeeld van de onderliggende markeringen in een ontspannen toestand moet worden vastgelegd. De referentieafbeelding is vereist, zodat verplaatsing in het beklemtoonde beeld kan worden benaderd als het verschil tussen de gestreste en onbeklemtoonde beelden. Om een ontspannen toestand te bereiken, zijn de cellen die worden gemeten ofwel chemisch ontspannen ofwel volledig verwijderd. Dit proces voorkomt vaak de verwerving van verdere experimentele metingen, remt de lange termijn celstudies, en beperkt de doorvoer. Een referentiebeeld vereist ook beeldregistratie technieken om tegemoet te komen aan drift die kan hebben plaatsgevonden tijdens experimenten, vaak leidend tot omslachtige Handmatige afstemming van stress State beelden om te verwijzen naar afbeeldingen.
Andere tfm-methoden die als referentie vrij worden beschouwd, implementeren enige vorm van controle over de distributie van fiducial markers, hetzij door middel van hoge resolutie lithografie, micro contactafdrukken, of micro molding16,17,18 ,19,20. Referentie vrije TFM wordt bereikt door de veronderstelling dat de ontspannen toestand voor elke fiducial marker kan worden voorspeld op basis van hoe markerings posities werden voorgeschreven tijdens het fabricageproces. Deze methoden maken het mogelijk om de spanningstoestand van een cel volledig vast te leggen binnen één beeldopname waarbij fiducial-markerings verplaatsingen worden gemeten in vergelijking met een impliciete verwijzing dan kan worden afgeleid uit de fiducial marker geometrie. Hoewel consistentie in marker plaatsing meestal wordt bereikt met behulp van deze platforms, hebben ze over het algemeen te kampen met hun eigen tekortkomingen ten opzichte van de veelgebruikte op kraal gebaseerde benaderingen, waaronder: 1) verminderde tractie resolutie; 2) verminderde nauwkeurigheid van verplaatsingen buiten het vliegtuig (in sommige gevallen een volledig onvermogen om te meten); en 3) verminderde aanpasbaarheid van platform substraten en materialen (bijv. ligand presentatie, mechanische eigenschappen).
Om deze tekortkomingen aan te pakken, hebben we een nieuw referentie vrij TFM-platform ontworpen. Het platform gebruikt multiphoton geactiveerde chemie om een klein volume van een de te crosslinken naar specifieke 3D-locaties binnen de hydrogel die dienen als fiducial markers om materiaal belasting te meten. Op deze manier hebben we een platform ontworpen dat vergelijkbaar is met kraal-gebaseerde benaderingen, maar met het aanzienlijke voordeel dat fiducial markers zijn georganiseerd in gerafeld arrays, waardoor referentie vrije materiaal strain tracking mogelijk is. Deze referentie vrije woning biedt vele voordelen. Eerst en vooral, het zorgt voor niet-opdringerige monitoring van cellulaire tractie toestanden (d.w.z., omzeilt de noodzaak om te ontspannen of cellen te verwijderen om referentie posities van ontheemde fiducial markers verwerven). Dit was ons primaire doel bij het ontwerpen van dit systeem, omdat we van plan waren om andere downstream analytische methoden in combinatie met TFM op te nemen, wat moeilijk kan zijn met destructieve end-point TFM-benaderingen. Ten tweede maakt het gebruik van een impliciete verwijzing op basis van gerafeerd arrays een near-complete automatisering van verplaatsings analyse mogelijk. De regelmatigheid van de arrays creëert een voorspelbare workflow waarbij het optreden van uitzonderlijke gevallen (d.w.z. voorbeeld celgegevens met onverwachte artefacten zoals suboptimale markerings afstand of registratie-mismatches) minimaal kan worden gehandhaafd. Ten derde biedt het afzien van de noodzaak om een referentiebeeld te verwerven de vrijheid om veel cellen op een enkel monster gedurende langere tijd te bewaken. Dit contrasteert met traditionele op kraal gebaseerde benaderingen, waarbij, afhankelijk van de betrouwbaarheid van de geautomatiseerde fase bewegingen van de Microscoop, fouten in positionering zich kunnen ophopen en de moeilijkheid van het correct registreren van referentiebeelden naar celspanning vergroten Afbeeldingen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit platform een hogere doorvoer bij het verzamelen van cellulaire spanningsgegevens.
Met dit protocol hopen we de lezers vertrouwd te maken met de Two-photon, laser scanning lithografie techniek die we hebben geïmplementeerd om dit referentie vrije TFM-platform te genereren voor het meten van in-plane en out-of-Plane tractie componenten gegenereerd door cellen die zijn geseerd op het oppervlak. Niet gedekt in dit protocol is de synthese van enkele van de monomere componenten. In het algemeen, deze reacties omvatten bijna identieke "One-pot" synthese reactieschema's beschreven eerder21, en alternatieven voor deze producten kunnen ook worden gekocht. We streven er ook naar om lezers vertrouwd te maken met de softwaregebaseerde hulpmiddelen die we hebben gegenereerd om het gebruik van commercieel verkrijgbare laserscanmicroscopen als 3D-afdruk hulpmiddelen te bevorderen en om de analyse van fiducial-markerings verplaatsingen te vergemakkelijken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

Kwantificerende cel-geïnduceerde materiaal vervorming biedt nuttige informatie over hoe cellen voelen en reageren op de fysieke eigenschappen van hun micro-omgeving. Hoewel er veel benaderingen bestaan voor het meten van de cel-geïnduceerde materiaal belasting, hier bieden we een methodologie voor het bewaken van stam met sub-micron resolutie in een referentie vrije manier. Met behulp van een geactiveerd fotolithografisch patronen-proces met twee fotonen laten we zien hoe mechanisch en biologisch actieve afstembaar synthetische substraten met ingesloten arrays van fluorescerende fiducial markers kunnen worden gegenereerd om eenvoudig driedimensionaal te meten ( 3D) materiaal vervormings profielen in reactie op oppervlakte tracties. Met behulp van deze substraten kunnen celspanningprofielen worden toegewezen met behulp van een enkele 3D-afbeeldingsstapel van een cel van belang. Ons doel met deze methodologie is om tractiekracht microscopie een toegankelijker en gemakkelijker te implementeren instrument voor onderzoekers die cellulaire mechanotransductie processen bestuderen, vooral nieuwkomers op het gebied te maken.

Gedurende het hele protocol zijn er een aantal controlepunten die feedback geven om de kwaliteit van de patroon procedure te beoordelen. Om inzicht te geven in het beoordelen van de voortgang bij elk van deze controlepunten, bieden we representatieve resultaten van een daadwerkelijk experiment. De resultaten accentueren de toepassing van dit protocol uitgevoerd op een photopatterned hydrogel bereid voor tfm-analyse van humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs). De resultaten omvatten onbewerkte afbeeldingsgege...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Tractie kracht microscopie wordt gebruikt om cel gegenereerde krachten te meten. Dit protocol vereenvoudigt de verzameling analyse van tractie kracht gegevens, om het toegankelijker te maken voor onervaren gebruikers. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande referentie-vrije tractie kracht microscopie platforms, is dat multiphoton lithografie maakt een snelle en eenvoudige patrooninstelling herontwerp volgens individuele experimentele behoeften.Er zijn veel belangrijke stappen in de fabricage en implementatie van dit nieuwe referentievrije tractieplatform die gemakkelijker te begrijpen zijn door middel van visuele weergave in plaats van alleen tekst. Voor fotopolymerisatie van de basishydrogel voegt u eerst drie microliter van de pre-polymeeroplossing toe aan een dunne, vlakke plaat perfluoralkyalkanen en plaatst u platte 150 micrometer dikke PDMS-strips omliggende, maar niet in contact met de druppel pre-polymeeroplossing. Plaats een acrylaat silanized coverslip op de PDMS, met de pre-polymeer druppel gecentreerd onder de coverslip om de pre-polymeer druppel plat tot de dikte van de PDMS afstandhouders.Stel de ingeklemde pre-polymeeroplossing ongeveer één minuut bloot aan UV-licht. Wanneer een hydrogel volledig is gevormd, zorgvuldig scheiden van de coverslip van de PDMS afstandhouders. Gebruik high performance dubbelzijdige acryllijm om een open bodem Petri schotel hechten aan de coverslip.Let er vooral op bij het vasthouden van de hydrogel-beladen coverslip aan de Petri schotel. Een natte schotel of te weinig druk tijdens de toepassing zal het mogelijk maken lekken te vormen, verpest het monster. Druk op het contactoppervlak van de lijm om een volledige afdichting tussen de coverslip, lijm en petrischaal te creëren, waarbij u ervoor zorgt dat het glas niet wordt gebarsten.Gebruik steriele gefilterde PBS om de hydrogel af te spoelen. Voeg vervolgens acht microliters van NVP toe aan 800 microliter van de laboratoriumoplossing die is voorbereid voor de hydrogelsynthese. Als u een binaire afbeelding wilt converteren naar een digitaal masker, opent u MATLAB en opent en voert u de runscript uit.m MATLAB script. Selecteer het binaire TIF-bestand voor conversie en selecteer een map om de bestanden van de regio op te slaan. Voer de gewenste uiteindelijke grootte in micron van de geselecteerde afbeelding in.De invoerafbeelding wordt geschaald en gedimensioneerd om aan deze parameters te voldoen. Als u één pixelarray wilt maken, schakelt u in de opties voor regio van interessegenerator het selectievakje Verwijderen onder Kleine gebieden/enkele pixels uit, schakelt u het selectievakje Vierkanten in en schakelt u Het selectievakje Gebruiken onder Horizontale onderbrekingslijnen uit. Klik vervolgens op OK. Het OVL-bestand wordt gevonden in de eerder opgegeven map.Open het bestand in de microscoopsoftware en laad de gewenste gebieden die de lasersluiter controleerden tijdens twee fotonlaserscanninglithografie. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in omstandigheden met minimaal licht. Voor de fabricage van fiduciale marker arrays onder omstandigheden met weinig licht, grondig mengen 200 microliters van de eerder voorbereide NVP lab oplossing met 20 milligram Alexa Fluor 633 en verwijder alle PBS uit de schotel met de hydrogel.Voeg het PEG-633 mengsel toe aan de hydrogel als een druppel die de basishydrogel volledig omvat en laad de petrischaal op de monsterhouder van het microscoopstadium. Bedek vervolgens de schotel en laat de patroonoplossing minstens 30 minuten in de hydrogel weken, beschermd tegen licht. Als u de microscoop voor beeldvorming wilt configureren, selecteert u de juiste lasers en filters voor het visualiseren van Alexa Fluor 488.Zoek de hydrogel met behulp van het PEG-488 signaal en blokkeer het verzamelen van langere emissiegolflengten van de detector. Gebruik verticale en horizontale tegelscans om het midden van de hydrogel in het XY-vlak te lokaliseren en het gewenste moment in deze positie te bereiken. Gebruik lijnscans in de Z-stack functie om het oppervlak van de hydrogel te lokaliseren en nul de focus in deze positie.Niveau van de hydrogel door het herhalen van de lijn scans uit de buurt van de XY centrum om het oppervlak positie te identificeren, het aanpassen van de set schroeven voor de microscoop stadium, indien nodig. Maak binnen de werkruimte van de microscoopsoftware een apart experimentbestand voor fotopatronen en stel de multi-fotonkracht in op 1,8% en de scansnelheid op zes. Pas de grootte van het afbeeldingskader en de pixels aan om een pixelgrootte van 0,1 micrometer per pixel en een beeldverhouding van 100 op één te bereiken en het regiobestand op het tabblad van het gebied te laden.Gebruik een macro om alle regio's in te stellen om de functie Z-stack te verwerven en in te schakelen. Stel de afstand in op 3,5 micrometer voor een totale diepte van 28 micrometer en het totale aantal Z-segmenten van negen. Gebruik vervolgens de functie Posities om specifieke locaties in te stellen op de hydrogel waar de fiduciale markeringsarrays worden gefotopatterd.Als de weken tijd nadert de 30 minuten merk, verwerven opeenvolgende Z-stack lijn scans van het oppervlak van de hydrogel om de vijf minuten om te controleren op zwelling op basis van veranderingen in de locatie van het oppervlak ten opzichte van de nul focus positie. Als er gedurende het interval van vijf minuten geen verandering in de oppervlaktepositie heeft plaatsgevonden, voert u de patrooninstellingen uit en gebruikt u de laser van 488 nanometer om te controleren of het oppervlak van de hydrogel niet is verplaatst tijdens de patronen. Haal vervolgens de hydrogel uit de microscoop, haal de PEG-633-oplossing uit de petrischaal en spoel de schotel af met steriele gefilterde PBS.Als u een cel- en fiduciale markeringsafbeeldingen wilt verkrijgen, keert u de petrischaal terug naar de monsterhouder om de gebieden met patroon te lokaliseren. Zoek een cel van belang en verwerf een verzonden of fluorescerende afbeelding van de cel. Verwerf vervolgens een Z-stack van de patroonarray onder de cel zoals aangetoond, en verwerf een tweede reeks verzonden of fluorescerende beelden van de cel.Bij het verzamelen van een afbeeldingsstapel moeten de resulterende afbeeldingen een regelmatige reeks patroonfuncties weergeven die in intensiteit oscilleren als functie van de Z-positie in de afbeeldingsstack. De tracking. m script biedt verschillende diagnostische beelden, waaronder een Z-projectie van de fluorescerende fiduciale markers om de pre-processing kwaliteit te beoordelen, een plot van de gedetecteerde centroids, kleur gecodeerd als een functie van de Z-positie om de objectdetectie kwaliteit te beoordelen, en een plot van de tracks die de gedetecteerde marker centroids die zijn gekoppeld aan kolommen in de Z-richting om de kwaliteit van het bijhouden van objecten te beoordelen.Het SCRIPT DISP 3D.m biedt een plot van intensiteit als functie van de Z-positie voor elke kolom met gedetecteerde functies in een bepaalde beeldstack om de kwaliteit van de fiduciale markerintensiteitsprofielen te beoordelen. Beide DISP 3D.m en DISP schaar. m samen histogrammen van de gemeten verplaatsingsgeluid in elk van de Cartesiaanse coördinatendimensies en geïnterpoleerde warmtekaarten van verplaatsing. Bovendien final3D_2 de interp.m levert warmtekaarten van de oppervlaktetractieen berekend met behulp van de uitbestede code. Het belangrijkste om te onthouden tijdens deze procedure is dat oplossingen die LAP bevatten gevoelig zijn voor licht en zoveel mogelijk moeten worden beschermd tegen omgevingslichtbronnen. Vergeet niet dat NVP is een vluchtige organische verbinding en moet altijd worden behandeld in een chemische stroom kap.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisatie van Recombinant DNA en eiwit complexen met behulp van Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Een nieuwe methode voor het lokaliseren van Reporter Fluorescent Beads Dichtbij de celkweek Surface voor Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hoge doorvoer Tractiekracht microscopie met behulp van PDM'S onthult dosisafhankelijke effecten van het transformeren van groei factor-β op de epitheliale-naar-mesenchymale overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Implementatie van interferentie reflectie microscopie voor etiket vrije, High-Speed beeldvorming van microtubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Een custom multiphoton microscopie platform voor live beeldvorming van muis hoornvlies en conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...