Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

O. A. Banda a reçu le soutien d'une bourse NSF IGERT SBE2 (1144726), de fonds de démarrage fournis par l'Université du Delaware et du National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). Le JHS bénéficie d'un financement du Programme IMAT des National Institutes of Health/National Cancer Institute (R21CA214299) et du Programme de prix CAREER de la National Science Foundation (1751797). L'accès à la microscopie a été soutenu par des subventions du NIH-NIGMS (P20 GM103446), de la NSF (IIA-1301765) et de l'État du Delaware. Le microscope à éclairage structuré a été acquis avec des fonds du Programme fédéral de subventions à la recherche et au développement de l'État du Delaware (16A00471). Le microscope confocal LSM880 utilisé pour la lithographie à balayage laser à deux photons a été acquis grâce à une subvention d'instrumentation partagée (S10 OD016361).

1. Photopolymérisation d'un hydrogel de base PEGDA
<ol><li>
Rassemblement de réactifs
	<ol>
<li>Recueillir le lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poly (éthylène) diacrylate de glycol (PEGDA), pyrrol n-vinyl (NVP), AlexaFluor 488 étiqueté PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 étiqueté PEGDA (PEG-633), et PEPtide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de leurs congélateurs respectifs et amener chacun à la température ambiante.</li>
		<li>Dans les tubes de microcentrifuge ambre sépa...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

L'objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail qui atténue une grande partie de la difficulté associée à la génération et à l'analyse des données TFM. Une fois préparés, les hydrogels photopatterned sont simples à utiliser, exigeant seulement la connaissance des pratiques standard de culture de tissu et de la microscopie de fluorescence. L'aspect sans référence permet une navigation insouciante sur les hydrogels chargés de cellules et élimine les étapes encombrantes de traitement d'image tel...

La microscopie de force de traction (TFM) est le processus d'approximation des tractions cellulaires à l'aide de champs de déplacement interpolés de marqueurs fiducial générés par une cellule adhérente et contractile. En utilisant TFM, l'influence des indices mécaniques dans l'environnement extracellulaire sur les processus cellulaires importants tels que la prolifération, la différenciation et la migration peut être étudiée1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Malheureusement, de nombreuses approches existantes peuvent être difficiles à mettre en œuvre ou exiger une connaissance des outils d'analyse et de calcul hautement spécialisés qui rendent l'ondes de POINTE difficile à utiliser pour les chercheurs inexpérimentés. Nous décrivons une méthodologie pour générer une plate-forme TFM qui élimine une partie de la difficulté d'analyse tout en fournissant également l'acquisition de données à haut débit.
Parmi les approches TFM existantes, la plus couramment utilisée pour quantifier la souche matérielle consiste à incorporation de petits marqueurs fluorescents (généralement des perles fluorescentes de la taille d'un nanomètre ou d'un micromètre) dans un hydrogel déformable, comme le polyacrylamide (PAA) ou le poly (éthylène glycol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Ces approches à base de perles permettent de regrouper densément les marqueurs fiduciaux autour d'une cellule d'intérêt afin de maximiser l'échantillonnage par déplacement. Malheureusement, la distribution des perles dans l'hydrogel ne peut pas être directement contrôlée de sorte que l'organisation spatiale est aléatoire. Ce placement aléatoire conduit à des problèmes tels que les perles qui sont trop proches les uns des autres pour résoudre avec précision, ou si la propagation que les taches du substrat donnent des données de faible qualité. L'incapacité de prédire où se trouvent les marqueurs fiducial en l'absence de cellules crée également une contrainte que, pour chaque ensemble collecté de données de traction cellulaire, une image de référence supplémentaire des marqueurs sous-jacents dans un état détendu doit également être capturée. L'image de référence est nécessaire pour que le déplacement dans l'image stressée puisse être approximatif comme la différence entre les images stressées et non stressées. Pour atteindre un état détendu, les cellules mesurées sont soit chimiquement détendues, soit complètement enlevées. Ce processus empêche souvent l'acquisition d'autres mesures expérimentales, inhibe les études cellulaires à long terme et limite le débit. Une image de référence nécessite également des techniques d'enregistrement d'images pour tenir compte de la dérive qui peut avoir eu lieu pendant l'expérimentation, conduisant souvent à l'appariement manuel encombrant des images d'état de stress aux images de référence.
D'autres méthodes TFM jugées sans référence, mettent en œuvre une certaine forme de contrôle sur la distribution des marqueurs fiducial, soit par lithographie haute résolution, impression par microcontact, ou micromolding16,17,18 ,19,20. Le TFM sans référence est réalisé en supposant que l'état détendu de chaque marqueur fiducial peut être prédit en fonction de la façon dont les positions de marqueur ont été prescrites pendant le processus de fabrication. Ces méthodes permettent de saisir complètement l'état de tension d'une cellule au sein d'une seule capture d'image dans laquelle les déplacements de marqueurs fiducial sont mesurés par rapport à une référence implicite que l'on peut déduire de la géométrie du marqueur fiducial. Bien que l'uniformité dans le placement des marqueurs soit généralement atteinte à l'aide de ces plates-formes, elles souffrent généralement de leurs propres lacunes par rapport aux approches largement utilisées basées sur les perles, y compris : 1) une diminution de la résolution de traction; 2) diminution de l'exactitude des déplacements hors avion (dans certains cas, une incapacité totale de mesurer); et 3) diminution de la personnalisation des substrats et des matériaux de plate-forme (p. ex., présentation de ligands, propriétés mécaniques).
Pour remédier à ces lacunes, nous avons conçu une nouvelle plate-forme TFM sans référence. La plate-forme utilise la chimie activée par multiphoton pour relier un petit volume d'un fluorophore dans des emplacements 3D spécifiques dans l'hydrogel qui servent de marqueurs fiducial pour mesurer la souche matérielle. De cette façon, nous avons conçu une plate-forme qui fonctionne de la même façon que les approches basées sur les perles, mais avec l'avantage significatif que les marqueurs fiducial sont organisés en tableaux quadrillés permettant le suivi sans référence des souches matérielles. Cette propriété sans référence offre de nombreux avantages. D'abord et avant tout, il permet une surveillance non intrusive des états de traction cellulaire (c.-à-d., contourne la nécessité de détendre ou d'enlever les cellules pour acquérir des positions de référence des marqueurs fiduciaux déplacés). C'était notre objectif principal dans la conception de ce système, car nous avions l'intention d'intégrer d'autres méthodes d'analyse en aval en tandem avec TFM, ce qui peut être difficile avec des approches destructrices de point final TFM. Deuxièmement, l'utilisation d'une référence implicite basée sur des tableaux quadrillés permet une automatisation quasi complète de l'analyse des déplacements. La régularité des tableaux crée un flux de travail prévisible où l'occurrence de cas exceptionnels (c.-à-d. des données de cellules d'échantillon contenant des artefacts imprévus tels que l'espacement sous-optimal des marqueurs ou les décalages d'enregistrement) peut être maintenue au minimum. Troisièmement, l'oubli de la nécessité d'acquérir une image de référence offre la liberté de surveiller de nombreuses cellules sur un seul échantillon sur de longues périodes de temps. Cela contraste avec les approches traditionnelles à base de perles, où, selon la fidélité des mouvements automatisés de stade du microscope, les erreurs de positionnement peuvent s'accumuler et augmenter la difficulté d'enregistrer correctement les images de référence à la tension cellulaire Images. Dans l'ensemble, cette plate-forme facilite un débit plus élevé dans la collecte de données sur les tensions cellulaires.
Avec ce protocole, nous espérons familiariser les lecteurs avec la technique de lithographie à balayage laser à deux photons que nous avons mise en œuvre pour générer cette plate-forme TFM sans référence pour mesurer les composants de traction en avion et hors plane générés par les cellules enseduites en surface. Non couvert dans ce protocole est la synthèse de certains des composants monomériques. En général, ces réactions comprennent des schémas de réaction de synthèse « un pot » presque identiques décrits précédemment21, et des alternatives à ces produits peuvent également être achetées. Nous visons également à familiariser les lecteurs avec les outils logiciels que nous avons générés pour promouvoir l'utilisation de microscopes à balayage laser disponibles dans le commerce comme outils d'impression 3D et pour faciliter l'analyse des déplacements de marqueurs fiducials.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

La quantification de la déformation des matériaux induits par les cellules fournit des informations utiles sur la façon dont les cellules détectent et réagissent aux propriétés physiques de leur microenvironnement. Bien qu'il existe de nombreuses approches pour mesurer la souche matérielle induite par les cellules, nous fournissons ici une méthodologie pour la surveillance de la souche avec une résolution sous-micron d'une manière sans référence. À l'aide d'un processus de modelage photolithographique à deux photons, nous démontrons comment générer des substrats synthétiques réglables mécaniquement et bioactivement contenant des rangées intégrées de marqueurs fiducial fluorescents pour mesurer facilement les trois dimensions ( 3D) profils de déformation des matériaux en réponse aux tractions de surface. À l'aide de ces substrats, les profils de tension cellulaire peuvent être cartographiés à l'aide d'une seule pile d'images 3D d'une cellule d'intérêt. Notre objectif avec cette méthodologie est de faire de la microscopie de force de traction un outil plus accessible et plus facile à mettre en œuvre pour les chercheurs qui étudient les processus de mécanotransduction cellulaire, en particulier les nouveaux arrivants sur le terrain.

Tout au long du protocole, il y a un certain nombre de points de contrôle qui fournissent des commentaires pour évaluer la qualité de la procédure de modelage. Afin de fournir un aperçu de la façon d'évaluer les progrès réalisés à chacun de ces points de contrôle, nous fournissons les résultats représentatifs d'une expérience réelle. Les résultats mettent en évidence l'application de ce protocole effectué sur un hydrogel photopatterned préparé pour l'analyse de TFM des cellules endothéliales ombilic...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Ce protocole fournit des instructions pour la mise en œuvre de la lithographie multiphoton pour fabriquer des tableaux tridimensionnels de marqueurs fiducial fluorescents intégrés dans des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) pour une utilisation comme microscopie sans force de traction sans référence. Plates-formes. À l'aide de ces instructions, la mesure de la souche de matériau 3D et le calcul des tractions cellulaires sont simplifiés afin de promouvoir des mesures de la force de traction à haut débit.

Fabrication et mise en œuvre d'une plate-forme de microscopie de traction sans référence

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

La microscopie de force de traction est utilisée pour mesurer les forces générées par les cellules. Ce protocole simplifie l’analyse de collecte des données de force de traction, afin de les rendre plus accessibles aux utilisateurs inexpérimentés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux plates-formes de microscopie de force de traction sans référence existantes, est que la lithographie multiphoton permet une refonte rapide et facile du réglage de modelage en fonction des besoins expérimentaux individuels.Il existe de nombreuses étapes clés dans la fabrication et la mise en œuvre de cette nouvelle plate-forme de traction sans référence qui sont plus faciles à comprendre par la représentation visuelle plutôt que par le texte seul. Pour la photopolymérisation de l’hydrogel de base, ajoutez d’abord trois microlitres de la solution pré-polymère sur une mince feuille plate d’alcanes perfluoroalkoxy, et placez à plat 150 bandes PDMS épaisses de micromètres entourant, mais pas en contact avec, la goutte de solution pré-polymère. Placez un coverslip silanized acrylate sur le PDMS, avec la gouttelette pré-polymère centrée sous le coverslip pour aplatir la gouttelette pré-polymère à l’épaisseur des espaceurs PDMS.Exposez la solution pré-polymère en sandwich à la lumière UV pendant environ une minute. Lorsqu’un hydrogel est entièrement formé, séparez soigneusement le coverslip des espaceurs PDMS. Utilisez un adhésif acrylique à double face haute performance pour fixer une boîte de Pétri à fond ouvert au coverslip.Faites un soin particulier lorsque vous adhérant à la couverture chargée d’hydrogel à la boîte de Pétri. Un plat humide ou trop peu de pression pendant l’application permettra aux fuites de se former, ruinant l’échantillon. Appliquez une pression sur la surface de contact adhésive pour créer un joint complet entre le couvercle, l’adhésif et la boîte de Pétri, en prenant soin de ne pas casser le verre.Utilisez du PBS filtré stérile pour rincer l’hydrogel. Ajoutez ensuite huit microlitres de NVP à 800 microlitres de la solution de laboratoire préparés pour la synthèse de l’hydrogel. Pour convertir une image binaire en masque numérique, ouvrez MATLAB et ouvrez et exécutez le runscript.m Script MATLAB. Sélectionnez le fichier TIF binaire pour la conversion et sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de la région. Entrez la taille finale désirée dans les microns de l’image sélectionnée.L’image d’entrée sera mise à l’échelle et dimensionnée pour correspondre à ces paramètres. Pour créer un tableau de pixels unique, dans la région des options de générateur d’intérêt, décochez la case Supprimer tic sous petites régions/pixels simples, cochez la case tic squares et décochez l’utilisation sous lignes de rupture horizontales. Ensuite, cliquez sur OK. Le fichier OVL se trouve dans le dossier précédemment spécifié.Ouvrez le fichier dans le logiciel microscope et chargez les régions désirées qui contrôlaient l’obturateur laser au cours de deux lithographies photons à balayage laser. Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions avec un minimum de lumière. Pour la fabrication de tableaux de marqueurs fiducials dans des conditions de faible lumière, mélangez soigneusement 200 microlitres de la solution de laboratoire NVP précédemment préparée avec 20 milligrammes d’Alexa Fluor 633 et retirez tout le PBS du plat contenant l’hydrogel.Ajouter le mélange PEG-633 à l’hydrogel comme gouttelette qui englobe complètement l’hydrogel de base et charger la boîte de Pétri sur le porte-échantillon de l’étape du microscope. Couvrez ensuite le plat et laissez tremper la solution de modelage dans l’hydrogel pendant au moins 30 minutes, à l’abri de la lumière. Pour configurer le microscope pour l’imagerie, sélectionnez les lasers et filtres appropriés pour visualiser Alexa Fluor 488.Localisez l’hydrogel à l’aide du signal PEG-488 et bloquez la collecte des longueurs d’onde à émissions plus longues du détecteur. Utilisez des balayages verticaux et horizontaux de tuiles pour localiser le centre de l’hydrogel dans le plan XY et zéro la scène dans cette position. Utilisez des balayages de ligne dans la fonction Z-stack pour localiser la surface de l’hydrogel et zéro la mise au point dans cette position.Niveler l’hydrogel en répétant les balayages de ligne loin du centre XY pour identifier la position de surface, en ajustant les vis réglées pour l’étape du microscope, au besoin. Dans l’espace de travail logiciel microscope, créer un fichier d’expérience distinct pour le photopatterning et définir la puissance multi-photons à 1,8% et la vitesse de numérisation à six. Ajustez la taille du cadre de l’image et des pixels pour atteindre une taille de pixel de 0,1 micromètre par pixel et un rapport d’aspect de 100 pour un et chargez le fichier régions dans l’onglet de la région.Utilisez une macro pour définir toutes les régions pour acquérir et activer la fonction Z-stack. Réglez l’espacement à 3,5 micromètres pour une profondeur totale de 28 micromètres et un nombre total de tranches Z de neuf. Utilisez ensuite la fonction Positions pour définir des emplacements spécifiques sur l’hydrogel où les tableaux de marqueurs fiducials seront photopatterned.À mesure que le temps de trempage approche de la marque de 30 minutes, obtenez des balayages successifs de la ligne Z-stack de la surface de l’hydrogel toutes les cinq minutes pour vérifier l’enflure en fonction des changements dans l’emplacement de la surface par rapport à la position de mise au point à zéro. Si aucun changement de position de surface ne s’est produit au cours de l’intervalle de cinq minutes, exécutez les paramètres de modelage et utilisez le laser de 488 nanomètres pour vérifier que la surface de l’hydrogel ne s’est pas déplace pendant le modelage. Retirez ensuite l’hydrogel du microscope, aspirez la solution PEG-633 de la boîte de Pétri et rincez le plat avec du PBS filtré stérile.Pour acquérir une cellule et des images de marqueur fiducial, retournez la boîte de Pétri au porte-échantillon pour localiser les zones modelées. Localiser une cellule d’intérêt et acquérir une image transmise ou fluorescente de la cellule. Puis acquérir une pile Z du tableau à motifs sous la cellule comme démontré, et d’acquérir un deuxième ensemble d’images transmises ou fluorescentes de la cellule.Lors de la collecte d’une pile d’images, les images résultantes doivent afficher un tableau régulier de fonctionnalités à motifs qui oscillent en intensité en fonction de la position Z dans la pile d’images. Le suivi. m script fournit plusieurs images diagnostiques, y compris une projection Z des marqueurs fiduciaux fluorescents pour évaluer la qualité de pré-traitement, une parcelle des centroïdes détectés, la couleur codée en fonction de la position Z pour évaluer la qualité de détection des objets, et une parcelle des pistes représentant les centroïdes marqueurs détectés qui ont été reliés en colonnes dans la direction Z pour évaluer la qualité de suivi des objets.Le script DISP 3D.m fournit une parcelle d’intensité en fonction de la position Z pour chaque colonne de fonctionnalités détectées dans une pile d’images donnée afin d’évaluer la qualité des profils d’intensité du marqueur fiducial. Les deux DISP 3D.cisaillement m et DISP. m ensemble fournissent des histogrammes du bruit de déplacement mesuré dans chacune des dimensions de coordonnées cartésiennes ainsi que des cartes thermiques interpolées du déplacement. En outre, l’interp final3D_2.m fournit des cartes thermiques des tractions de surface calculées à l’aide du code externalisé. La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est que les solutions contenant lap sont sensibles à la lumière et doivent être protégés autant que possible contre les sources de lumière ambiante. Rappelez-vous que NVP est un composé organique volatil et doit toujours être manipulé dans un capot d’écoulement chimique.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisation de l&#39;ADN recombinant et des complexes de protéines par microscopie à force atomique

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Recherche

Bio-ingénierie

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Une nouvelle méthode pour localiser rapporteur fluorescent Perles près de la surface de culture cellulaire pour Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Un haut-débit Plate-forme Cell biopuces pour corrélative Analyse de la différenciation des cellules et des forces de traction

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Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

La microscopie de la force de traction à haut débit à l'aide du SMD révèle les effets dépendants de la dose de la transformation du facteur de croissance sur la transition épithéliale à mesenchymale

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...