Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
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O. A. Banda wurde durch ein NSF IGERT SBE2-Stipendium (1144726), Start-up-Fonds der University of Delaware und des National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) unterstützt. JHS wird durch Fördermittel des National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) und des National Science Foundation CAREER Award Program (1751797) unterstützt. Der Zugang zur Mikroskopie wurde durch Zuschüsse des NIH-NIGMS (P20 GM103446), der NSF (IIA-1301765) und des Bundesstaates Delaware unterstützt. Das strukturierte Beleuchtungsmikroskop wurde mit Mitteln des State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471) erworben. Das konfokale Mikroskop LSM880 für die Zwei-Photonen-Laserscanning-Lithographie wurde mit einem gemeinsamen Instrumentationszuschuss (S10 OD016361) erworben.

1. Photopolymerisierung eines PEGDA-Basishydrogels
<ol><li>
Sammeln von Reagenzien
	<ol>
<li>Sammeln Sie Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP), 3,4 kDa-Poly(Ethylen)-Glykoldiakrylat (PEGDA), n-Vinylpyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 mit PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 mit PEGDA (PEG-633) und PEGylatiertem RGDS-Peptid ( PEG-RGDS) aus den jeweiligen Gefriertruhen und bringen sie jeweils auf Raumtemperatur.</li>
		<li>In separaten Bernstein-Mikrozentrifugenröhrchen 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 m...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Workflow bereitzustellen, der einen Großteil der Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Generierung und Analyse von TFM-Daten lindert. Einmal zubereitet, sind die photomusterten Hydrogele einfach zu bedienen und erfordern nur Kenntnisse der Standard-Gewebekulturpraktiken und der Fluoreszenzmikroskopie. Der referenzfreie Aspekt ermöglicht eine sorglose Navigation auf zellbeladenen Hydrogelen und eliminiert umständliche Bildverarbeitungsschritte wie die Bildregistrierung zwische...

Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) ist der Prozess der Annäherung zellulärer Traktionen unter Verwendung interpolierter Verschiebungsfelder von Treuhandmarkern, die von einer anhängerhaften und kontraktilen Zelle erzeugt werden. Mit TFM kann der Einfluss mechanischer Hinweise in der extrazellulären Umgebung auf wichtige zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration untersucht werden1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Leider können viele vorhandene Ansätze schwierig zu implementieren sein oder erfordern vertraut mit hochspezialisierten Analyse- und Rechenwerkzeugen, was die Verwendung von TFM für unerfahrene Forscher erschwert. Wir beschreiben eine Methode zur Generierung einer TFM-Plattform, die einige der Schwierigkeiten bei der Analyse eliminiert und gleichzeitig eine Datenerfassung mit hohem Durchsatz bietet.
Von den bestehenden TFM-Ansätzen umfasst die am häufigsten zur Quantifizierung der Materialdehnung verwendete Die Einbeziehung kleiner fluoreszierender Marker (typischerweise nano- oder mikrometergroße Fluoreszenzperlen) in ein verformbares Hydrogel, wie Polyacrylamid (PAA) oder Polypoly (Ethylenglykol) Diakrylat (PEGDA)13,14,15. Diese auf Perlen basierenden Ansätze bieten die Möglichkeit, fiduziale Marker dicht um eine Zelle von Interesse zu gruppieren, um die Verschiebungsprobezuszeit zu maximieren. Leider kann die Verteilung der Perlen im hydrogel nicht direkt gesteuert werden, so dass die räumliche Organisation zufällig ist. Diese zufällige Platzierung führt zu Problemen wie Perlen, die zu nah beieinander sind, um sie genau zu lösen, oder so verbreiten, dass Flecken des Substrats Daten niedriger Qualität liefern. Die Unfähigkeit vorherzusagen, wo fiducial Marker in Abwesenheit von Zellen liegen, schafft auch eine Einschränkung, dass für jeden gesammelten Satz von Zelltraktionsdaten auch ein zusätzliches Referenzbild der zugrunde liegenden Marker in einem entspannten Zustand erfasst werden muss. Das Referenzbild ist erforderlich, damit die Verschiebung im beanspruchten Bild als Differenz zwischen den gestressten und unbetonten Bildern angenähert werden kann. Um einen entspannten Zustand zu erreichen, werden die zu messenden Zellen entweder chemisch entspannt oder vollständig entfernt. Dieser Prozess verhindert oft die Erfassung weiterer experimenteller Messungen, hemmt Langzeitzellstudien und begrenzt den Durchsatz. Ein Referenzbild erfordert auch Bildregistrierungstechniken, um Driften zu ermöglichen, die während des Experimentierens aufgetreten sein können, was oft zu einer umständlichen manuellen Abgleich von Spannungszustandsbildern zu Referenzbildern führt.
Andere TFM-Methoden, die als referenzfrei gelten, implementieren irgendeine Form der Kontrolle über die Verteilung von Treuhandmarkern, entweder durch hochauflösende Lithographie, Mikrokontaktdruck oder Mikrospritzen16,17,18 ,19,20. Referenzfreies TFM wird durch die Annahme erreicht, dass der entspannte Zustand für jeden Treuhandmarker basierend darauf vorhergesagt werden kann, wie Markerpositionen während des Herstellungsprozesses vorgeschrieben wurden. Diese Methoden ermöglichen eine vollständige Erfassung des Spannungszustands einer Zelle innerhalb einer einzelnen Bildaufnahme, bei der die räumlichen Markerverschiebungen im Vergleich zu einer impliziten Referenz gemessen werden, als aus der fiducialmarker-Geometrie abgeleitet werden kann. Während die Konsistenz bei der Markerplatzierung in der Regel mit diesen Plattformen erreicht wird, leiden sie im Allgemeinen unter ihren eigenen Mängeln im Vergleich zu den weit verbreiteten, auf Perlen basierenden Ansätzen, einschließlich: 1) verringerter Traktionsauflösung; 2) verringerte Genauigkeit von Verschiebungen a-ebenen (in einigen Fällen eine vollständige Unfähigkeit zu messen); und 3) verminderte Anpassbarkeit von Plattformsubstraten und Materialien (z. B. Ligandendarstellung, mechanische Eigenschaften).
Um diese Mängel zu beheben, haben wir eine neue referenzfreie TFM-Plattform entwickelt. Die Plattform nutzt multiphotonaktivierte Chemie, um ein kleines Volumen eines Fluorophors mit bestimmten 3D-Positionen innerhalb des Hydrogels zu vernetzen, die als Treuhandmarker zur Messung der Materialbelastung dienen. Auf diese Weise haben wir eine Plattform entwickelt, die ähnlich wie perlenbasierte Ansätze funktioniert, aber mit dem erheblichen Vorteil, dass treue Marker in gerasterte Arrays organisiert sind, die eine referenzfreie Materialdehnungsverfolgung ermöglichen. Diese referenzfreie Immobilie bietet viele Vorteile. In erster Linie ermöglicht es eine nicht-intrusive Überwachung von zellulären Traktionszuständen (d. h. umgeht die Notwendigkeit, Zellen zu entspannen oder zu entfernen, um Referenzpositionen von verdrängten Treuhandmarkern zu erhalten). Dies war unser primäres Ziel bei der Entwicklung dieses Systems, da wir beabsichtigten, andere nachgelagerte Analysemethoden in Verbindung mit TFM zu integrieren, was mit zerstörerischen Endpunkt-TFM-Ansätzen schwierig sein kann. Zweitens ermöglicht die Verwendung einer impliziten Referenz basierend auf gerasterten Arrays eine nahezu vollständige Automatisierung der Verschiebungsanalyse. Die Regelmäßigkeit der Arrays erzeugt einen vorhersagbaren Workflow, bei dem das Auftreten von Ausnahmefällen (d. h. Beispielzellendaten, die unerwartete Artefakte wie suboptimale Markerabstände oder Registrierungsübereinstimmungen enthalten) auf einem Minimum beibehalten werden kann. Drittens bietet der Weg fallder ein Referenzbild die Freiheit, viele Zellen in einer einzigen Probe über einen längeren Zeitraum zu überwachen. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Perlen-basierten Ansätzen, bei denen sich je nach Genauigkeit der automatisierten Bühnenbewegungen des Mikroskops Fehler bei der Positionierung ansammeln und die Schwierigkeit erhöhen können, Referenzbilder auf Zellspannung richtig zu registrieren. Bilder. Insgesamt ermöglicht diese Plattform einen höheren Durchsatz beim Sammeln zellulärer Spannungsdaten.
Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Leser mit der zwei-Photonen- laserscannenden Lithographie-Technik vertraut zu machen, die wir implementiert haben, um diese referenzfreie TFM-Plattform zu generieren, um in-plane und a-plane Traktionskomponenten zu messen, die von Zellen erzeugt werden, die ausgesät werden. auf der Oberfläche. Nicht in diesem Protokoll enthalten ist die Synthese einiger monomerer Komponenten. Im Allgemeinen umfassen diese Reaktionen fast identische "Ein-Topf"-Synthese-Reaktionsschemata, die zuvor21beschrieben wurden, und Alternativen zu diesen Produkten können ebenfalls gekauft werden. Unser Ziel ist es auch, die Leser mit den softwarebasierten Tools vertraut zu machen, die wir erstellt haben, um den Einsatz von handelsüblichen Laser-Scanning-Mikroskopen als 3D-Druckwerkzeuge zu fördern und die Analyse von fiduzialen Markerverschiebungen zu erleichtern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

Die Quantifizierung der zellinduzierten Materialverformung liefert nützliche Informationen darüber, wie Zellen die physikalischen Eigenschaften ihrer Mikroumgebung erkennen und darauf reagieren. Während es viele Ansätze zur Messung zellinduzierter Materialstämme gibt, bieten wir hier eine Methodik zur referenzfreien Dehnungsüberwachung mit Submikronen-Auflösung an. Mit einem zweiphotonenaktivierten photolithographischen Musterverfahren zeigen wir, wie mechanisch und bioaktiv abstimmbare synthetische Substrate mit eingebetteten Arrays von fluoreszierenden Fiduzialenmarkern erzeugt werden, um dreidimensionale ( 3D) Materialverformungsprofile als Reaktion auf Oberflächentraktionen. Mit diesen Substraten können Zellspannungsprofile mit einem einzelnen 3D-Bildstapel einer von Interesse stehenden Zelle abgebildet werden. Unser Ziel mit dieser Methode ist es, die Traktionskraftmikroskopie zu einem zugänglicheren und einfacher zu implementierenden Werkzeug für Forscher zu machen, die zelluläre Mechanotransduktionsprozesse untersuchen, insbesondere Neulinge auf dem Gebiet.

Im gesamten Protokoll gibt es eine Reihe von Prüfpunkten, die Feedback geben, um die Qualität des Mustervorgangs zu bewerten. Um einen Einblick in die Bewertung der Fortschritte an jedem dieser Kontrollpunkte zu geben, liefern wir repräsentative Ergebnisse eines tatsächlichen Experiments. Die Ergebnisse unterstreichen die Anwendung dieses Protokolls auf einem photomusterten Hydrogel, das für die TFM-Analyse menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) vorbereitet wurde. Die Ergebnisse umfassen Rohbilddaten sowi...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die Implementierung der Multiphotonenlithographie zur Herstellung dreidimensionaler Arrays von fluoreszierenden Fiduzialen, die in poly(ethylengglykol)-basierte Hydrogele eingebettet sind und als referenzfreie Traktionskraftmikroskopie verwendet werden können. Plattformen. Anhand dieser Anleitungen wird die Messung der 3D-Materialdehnung und die Berechnung der zellulären Traktionen vereinfacht, um Messungen der Traktionskraft mit hohem Durchsatz zu fördern.

Herstellung und Implementierung einer referenzfreien Traktionskraftmikroskopie-Plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Die Traktionskraftmikroskopie wird verwendet, um zellgenerierte Kräfte zu messen. Dieses Protokoll vereinfacht die Erfassung von Traktionskraftdaten, um sie für unerfahrene Benutzer zugänglicher zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden referenzfreien Traktionskraftmikroskopieplattformen besteht darin, dass die Multiphotonenlithographie eine schnelle und einfache Mustereinstellung ermöglicht, die den individuellen experimentellen Bedürfnissen entspricht.Es gibt viele wichtige Schritte bei der Herstellung und Implementierung dieser neuen referenzfreien Traktionsplattform, die durch visuelle Darstellung leichter zu verstehen sind als durch Text allein. Zur Photopolymerisation des Basishydrogels zunächst drei Mikroliter der Vorpolymerlösung auf eine dünne, flache Platte perfluoralkoxyalkane geben und flache 150 Mikrometer dicke PDMS-Streifen um den Tropfen der Vorpolymerlösung umgeben, aber nicht in Kontakt mit ihm platzieren. Legen Sie einen acrylat-silanisierten Deckelschlupf auf das PDMS, wobei das Vorpolymer-Tröpfchen unter dem Deckschein zentriert ist, um das Vorpolymertröpfchen auf die Dicke der PDMS-Abstandshalter abzuflachen.Setzen Sie die Sandwich-Vorpolymerlösung für etwa eine Minute UV-Licht aus. Wenn ein Hydrogel vollständig ausgebildet ist, trennen Sie den Deckelrutsch vorsichtig von den PDMS-Abstandshaltern. Verwenden Sie hochleistungsstarken doppelseitigen Acrylkleber, um eine offene Petrischale am Deckel zu befestigen.Achten Sie besonders darauf, wenn Sie den hydrogelbeladenen Deckelrutsch an der Petrischale anbringen. Eine nasse Schale oder zu wenig Druck während der Anwendung lässt Leckagen entstehen und ruiniert die Probe. Drücken Sie auf die Klebekontaktfläche, um eine vollständige Abdichtung zwischen Deckel-, Klebstoff- und Petrischale zu schaffen, wobei darauf geachtet wird, das Glas nicht zu knacken.Verwenden Sie steril gefilterte PBS, um das Hydrogel zu spülen. Dann fügen Sie acht Mikroliter NVP zu 800 Mikroliter der Laborlösung für die Hydrogelsynthese vorbereitet. Um ein binäres Bild in eine digitale Maske zu konvertieren, öffnen Sie MATLAB, und führen Sie das runscript aus.m MATLAB-Skript. Wählen Sie die binäre TIF-Datei für die Konvertierung aus, und wählen Sie einen Ordner aus, um die Dateien der Region zu speichern. Geben Sie die gewünschte endgültige Größe in Mikrometern des ausgewählten Bildes ein.Das Eingabebild wird skaliert und bemaßt, um diesen Parametern zu entsprechen. Um ein einzelnes Pixelarray zu erstellen, deaktivieren Sie in den Generatoroptionen "Region of Interest" das Kontrollkästchen "Tic entfernen" unter Kleine Regionen/Einzelne Pixel, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Quadrate und deaktivieren Sie die Option Verwenden unter Horizontale Bruchlinien. Klicken Sie dann auf OK. Die OVL-Datei befindet sich im zuvor angegebenen Ordner.Öffnen Sie die Datei in der Mikroskop-Software und laden Sie die gewünschten Bereiche, die den Laserverschluss während zweiphotonen Laserscanning Lithographie gesteuert. Die folgenden Schritte sollten unter Bedingungen mit minimalem Licht durchgeführt werden. Für die Herstellung von fiducial Marker-Arrays bei schlechten Lichtverhältnissen 200 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NVP-Laborlösung mit 20 Milligramm Alexa Fluor 633 gründlich mischen und alle PBS aus der Schale entfernen, die das Hydrogel enthält.Fügen Sie das PEG-633-Gemisch als Tröpfchen, das das Basishydrogel vollständig umfasst, in das Hydrogel einundund- und laden Sie die Petrischale auf den Probenhalter der Mikroskopstufe. Dann bedecken Sie die Schale und lassen Sie die Musterlösung in das Hydrogel für mindestens 30 Minuten einweichen, vor Licht geschützt. Um das Mikroskop für die Bildgebung zu konfigurieren, wählen Sie die geeigneten Laser und Filter zur Visualisierung von Alexa Fluor 488 aus.Suchen Sie das Hydrogel mit dem PEG-488-Signal und blockieren Sie die Erfassung längerer Emissionswellenlängen aus dem Detektor. Verwenden Sie vertikale und horizontale Kachelscans, um die Mitte des Hydrogels in der XY-Ebene und null die Stufe in dieser Position zu lokalisieren. Verwenden Sie Linienscans in der Z-Stack-Funktion, um die Oberfläche des Hydrogels zu lokalisieren und den Fokus in dieser Position zu null.Nivellieren Sie das Hydrogel, indem Sie die Linienscans vom XY-Mittelpunkt entfernen, um die Oberflächenposition zu identifizieren, und passen Sie die eingestellten Schrauben für die Mikroskopstufe nach Bedarf an. Erstellen Sie im Arbeitsbereich der Mikroskopsoftware eine separate Experimentierdatei für die Fotomusterung und stellen Sie die Multi-Photonenleistung auf 1,8 % und die Scangeschwindigkeit auf sechs ein. Passen Sie die Größe des Bildrahmens und der Pixel an, um eine Pixelgröße von 0,1 Mikrometer pro Pixel und ein Seitenverhältnis von 100 zu eins zu erreichen, und laden Sie die Regionsdatei in die Registerkarte der Region.Verwenden Sie ein Makro, um alle Bereiche festzulegen, die die Z-Stack-Funktion abrufen und aktivieren möchten. Stellen Sie den Abstand auf 3,5 Mikrometer für eine Gesamttiefe von 28 Mikrometern und eine Gesamtanzahl von Z-Slices von neun ein. Verwenden Sie dann die Positions-Funktion, um bestimmte Positionen auf dem Hydrogel festzulegen, an denen die fiduzialen Marker-Arrays fotomustert werden.Wenn sich die Einweichzeit der 30-Minuten-Marke nähert, erhalten Sie alle fünf Minuten aufeinanderfolgende Z-Stack-Linienscans der Oberfläche des Hydrogels, um auf Schwellungen basierend auf Veränderungen in der Position der Oberfläche relativ zur Nullfokusposition zu überprüfen. Wenn sich die Oberflächenposition im Fünf-Minuten-Intervall nicht geändert hat, führen Sie die Mustereinstellungen aus, und verwenden Sie den 488-Nanometer-Laser, um zu überprüfen, ob sich die Oberfläche des Hydrogels während der Musterung nicht bewegt hat. Dann entfernen Sie das Hydrogel aus dem Mikroskop, aspirieren Sie die PEG-633 Lösung aus der Petrischale und spülen Sie die Schale mit steril gefiltertem PBS.Um eine Zelle und fiducial Marker-Bilder zu erfassen, geben Sie die Petrischale an den Probenhalter zurück, um die gemusterten Bereiche zu lokalisieren. Suchen Sie eine Zelle von Interesse und erfassen Sie ein übertragenes oder fluoreszierendes Bild der Zelle. Erfassen Sie dann einen Z-Stack des gemusterten Arrays unter der Zelle, wie gezeigt, und erfassen Sie einen zweiten Satz übertragener oder fluoreszierender Bilder der Zelle.Beim Sammeln eines Bildstapels sollten die resultierenden Bilder ein regelmäßiges Array gemusterter Features anzeigen, die in der Intensität als Funktion der Z-Position innerhalb des Bildstapels oszillieren. Das Tracking. m-Skript bietet mehrere diagnostische Bilder, darunter eine Z-Projektion der fluoreszierenden Fiduzialenmarker zur Bewertung der Vorverarbeitungsqualität, ein Diagramm der erkannten Zentroide, eine Farbe, die als Funktion der Z-Position kodiert ist, um die Objekterkennungsqualität zu bewerten, und ein Diagramm der Spuren, die die erkannten Markerzentroide darstellen, die in Spalten in Z-Richtung verknüpft wurden, um die Objektverfolgungsqualität zu bewerten.Das DISP 3D.m-Skript bietet eine Intensitätsdarstellung als Funktion der Z-Position für jede Spalte der erkannten Features in einem bestimmten Bildstapel, um die Qualität der profilierten Markerintensitätsprofile zu bewerten. Beide DISP 3D.m und DISP Schere. m zusammen liefern Histogramme des gemessenen Verschiebungsrauschens in jeder der kartesischen Koordinatenmaße sowie interpolierte Heatmaps der Verschiebung. Darüber hinaus final3D_2 die interp.m liefert Wärmekarten der Oberflächentraktionen, die mit dem ausgelagerten Code berechnet werden. Das Wichtigste, was man sich bei diesem Verfahren merken sollte, ist, dass Lösungen, die LAP enthalten, lichtempfindlich sind und so weit wie möglich vor Umgebungslichtquellen geschützt werden sollten. Denken Sie daran, dass NVP eine flüchtige organische Verbindung ist und immer in einer chemischen Durchflusshaube behandelt werden sollte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualisierung von rekombinanten DNA-und Protein-Komplexe mit Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Forschung

Biotechnik

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie für etikettenfreie High-Speed-Bildgebung von Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Eine benutzerdefinierte Multiphotonen-Mikroskopie-Plattform für Live-Bildgebung von Maus-Cornea und Konjunktiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...