Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

O. A. Banda è stato sostenuto dal finanziamento di una borsa di studio NSF IGERT SBE2 (1144726), fondi di avvio forniti dall'Università del Delaware e dal National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299). JHS è sostenuta da finanziamenti da parte del National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT Program (R21CA214299) e del National Science Foundation CAREER Award Program (1751797). L'accesso alle microscopie è stato sostenuto dalle sovvenzioni del NIH-NIGMS (P20 GM103446), della NSF (IIA-1301765) e dello Stato del Delaware. Il microscopio di illuminazione strutturata è stato acquisito con fondi dello State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). Il microscopio confocale LSM880 utilizzato per la litografia a scansione laser a due fotoni è stato acquisito con una sovvenzione di strumentazione condivisa (S10 OD016361).

1. Fotopolimerizzare un idrogel di base PEGDA
<ol><li>
Raccolta di reagenti
	<ol>
<li>Raccogliere fenilio di litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3.4 kDa poli(ethylene) diacritaglio glicole (PEGDA), n-vi Pirrodonenyl (NVP), AlexaFluor 488 con etichetta PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 con etichetta PEGDA (PEG-633) e peptide RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) dai rispettivi congelatori e portare ciascuno a temperatura ambiente.</li>
		<li>Nei tubi separati di microcentrismo d'ambra, misurare 3 mg di LA...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro che allevia gran parte della difficoltà associata alla generazione e all'analisi dei dati TFM. Una volta preparati, gli idrogel fotodorali sono semplici da usare, richiedendo solo la conoscenza delle pratiche standard di coltura dei tessuti e la microscopia a fluorescenza. L'aspetto senza riferimenti consente una navigazione spensierata sugli idrogel carichi di cellule ed elimina passaggi di elaborazione delle immagini ingombranti come la registra...

La microscopia a forza di trazione (TFM) è il processo di approssimazione delle trazioni cellulari utilizzando campi di spostamento interpolati di marcatori fiduciari generati da una cellula aderente e contrattile. Utilizzando TFM, l'influenza dei segnali meccanici nell'ambiente extracellulare su importanti processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e la migrazione può essere studiata1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Sfortunatamente, molti approcci esistenti possono essere difficili da implementare o richiedono familiarità con strumenti analitici e computazionali altamente specializzati che rendono la TFM difficile da usare per i ricercatori inesperti. Descriviamo una metodologia per generare una piattaforma TFM che elimina alcune delle difficoltà nell'analisi, fornendo allo stesso tempo l'acquisizione di dati ad alto eveloce.
Tra gli attuali approcci TFM, i più comunemente utilizzati per quantificare la deformazione del ceppo materiale comporta l'incorporazione di piccoli marcatori fluorescenti (tipicamente perline fluorescenti di dimensioni nanometriche o micrometriche) in un idrogel deformabile, come la poliacrilammide (PAA) o il polimetro (etilene glicole) diacrilato (PEGDA)13,14,15. Questi approcci basati sul tallone forniscono la capacità di ammassare densamente marcatori fiduciari intorno a una cella di interesse per massimizzare il campionamento di spostamento. Sfortunatamente, la distribuzione delle perline in tutto l'idrogel non può essere controllata direttamente, quindi l'organizzazione spaziale è casuale. Questo posizionamento casuale porta a problemi come perline che sono troppo vicine l'una all'altra per risolvere con precisione, o così diffuse che le patch del substrato producono dati di bassa qualità. L'incapacità di prevedere dove si trovano i marcatori fiduciari in assenza di cellule crea anche un vincolo che, per ogni insieme raccolto di dati di trazione cellulare, deve essere acquisita anche un'immagine di riferimento aggiuntiva dei marcatori sottostanti in uno stato rilassato. L'immagine di riferimento è necessaria in modo che lo spostamento nell'immagine sollecitata possa essere approssimato come differenza tra le immagini sollecitate e non sollecitate. Per ottenere uno stato rilassato, le cellule misurate sono chimicamente rilassate o completamente rimosse. Questo processo spesso impedisce l'acquisizione di ulteriori misurazioni sperimentali, inibisce gli studi sulle cellule a lungo termine e limita la produttività. Un'immagine di riferimento richiede anche tecniche di registrazione delle immagini per accogliere la deriva che potrebbe essersi verificata durante la sperimentazione, spesso portando a un ingombrante abbinamento manuale delle immagini dello stato di sollecitazione alle immagini di riferimento.
Altri metodi TFM considerati privi di riferimento, implementano una qualche forma di controllo sulla distribuzione dei marcatori fiduciari, sia mediante litografia ad alta risoluzione, stampa di microcontatto o micromolding16,17,18 ,19,20. La TFM senza riferimenti si ottiene presupponendo che lo stato rilassato per ogni marcatore fiduciario possa essere previsto in base al modo in cui le posizioni dei marcatori sono state prescritte durante il processo di fabbricazione. Questi metodi consentono di acquisire completamente lo stato di tensione di una cella all'interno di una singola acquisizione di immagine in cui gli spostamenti dei marcatori fiduciari vengono misurati rispetto a un riferimento implicito di quanto possa essere dedotto dalla geometria del marcatore fiduciario. Mentre la coerenza nel posizionamento dei marcatori è in genere raggiunta utilizzando queste piattaforme, in genere soffrono di carenze proprie rispetto agli approcci basati sul tallone ampiamente utilizzati, tra cui: 1) diminuzione della risoluzione di trazione; 2) diminuzione della precisione degli spostamenti fuori piano (in alcuni casi una completa incapacità di misurare); e 3) diminuzione della personalizzazione dei substrati e dei materiali della piattaforma (ad esempio, presentazione del ligando, proprietà meccaniche).
Per far fronte a queste carenze, abbiamo progettato una nuova piattaforma TFM senza riferimenti. La piattaforma utilizza la chimica attivata multifotone per incrociare un piccolo volume di un fluoroforo in specifiche posizioni 3D all'interno dell'idrogel che fungono da marcatori fiduciali per misurare la varietà del materiale. In questo modo, abbiamo progettato una piattaforma che opera in modo simile ad approcci basati su perline, ma con il vantaggio significativo che i marcatori fiduciali sono organizzati in array grigliati che consentono il tracciamento della deformazione dei materiali senza riferimenti. Questa proprietà senza riferimenti offre molti vantaggi. In primo luogo, permette un monitoraggio non intrusivo degli stati di trazione cellulare (cioè, elude la necessità di rilassare o rimuovere le cellule per acquisire posizioni di riferimento di marcatori fiduciari spostati). Questo era il nostro obiettivo primario nella progettazione di questo sistema, in quanto avevamo intenzione di incorporare altri metodi analitici a valle in tandem con TFM, che può essere difficile con approcci TFM di fine punto distruttivi. In secondo luogo, l'utilizzo di un riferimento implicito basato su array grigliati consente un'automazione quasi completa dell'analisi dello spostamento. La regolarità delle matrici crea un flusso di lavoro prevedibile in cui la occorrenza di casi eccezionali (ad esempio, dati di cella di esempio contenenti artefatti imprevisti, ad esempio spaziatura dei marcatori non ottimali o mancata corrispondenza di registrazione) può essere mantenuta al minimo. In terzo luogo, l'ocquali dire la necessità di acquisire un'immagine di riferimento offre la libertà di monitorare molte celle su un singolo campione per lunghi periodi di tempo. Questo contrasta con gli approcci tradizionali basati sul tallone, dove, a seconda della fedeltà dei movimenti automatici dello stadio del microscopio, gli errori di posizionamento possono accumularsi e aumentare la difficoltà di registrare correttamente le immagini di riferimento alla tensione cellulare Immagini. Nel complesso, questa piattaforma facilita una maggiore velocità effettiva nella raccolta dei dati di tensione cellulare.
Con questo protocollo, speriamo di familiarizzare i lettori con la tecnica litografia a scansione laser a due fotoni che abbiamo implementato per generare questa piattaforma TFM senza riferimenti per misurare i componenti di trazione in piano e fuori piano generati dalle cellule semi-seme sulla superficie. Non trattata in questo protocollo è la sintesi di alcuni dei componenti monomerici. In generale, queste reazioni includono schemi di reazione di sintesi di sintesi quasi identici "one-pot" descritti in precedenza21, e alternative a questi prodotti possono anche essere acquistati. Il nostro obiettivo è anche quello di familiarizzare i lettori con gli strumenti basati su software che abbiamo generato per promuovere l'uso di microscopi a scansione laser disponibili in commercio come strumenti di stampa 3D e per facilitare l'analisi degli spostamenti dei marcatori fiduciari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

La quantificazione della deformazione del materiale indotta dalle cellule fornisce informazioni utili sul modo in cui le cellule rilevano e rispondono alle proprietà fisiche del loro microambiente. Sebbene esistano molti approcci per misurare la deformazione dei materiali indotta dalle cellule, qui forniamo una metodologia per monitorare la deformazione con risoluzione sub-micron in modo privo di riferimenti. Utilizzando un processo di modellazione fotolitografica attivata a due fotoni, dimostriamo come generare substrati sintetici meccanicamente e bio-attivamente regolabili contenenti array incorporati di marcatori fiduciali fluorescenti per misurare facilmente tridimensionali ( 3D) profili di deformazione del materiale in risposta alle trazioni superficiali. Utilizzando questi substrati, i profili di tensione delle cellule possono essere mappati utilizzando una singola pila di immagini 3D di una cella di interesse. Il nostro obiettivo con questa metodologia è quello di rendere la microscopia a trazione uno strumento più accessibile e più facile da implementare per i ricercatori che studiano i processi di meccanotrazione cellulare, in particolare i nuovi arrivati sul campo.

Nel corso del protocollo, vi sono una serie di punti di controllo che forniscono feedback per valutare la qualità della procedura di modellazione. Per fornire alcune informazioni su come valutare i progressi in ciascuno di questi punti di controllo, forniamo risultati rappresentativi di un esperimento vero e proprio. I risultati evidenziano l'applicazione di questo protocollo eseguito su un idrogel fotofatto preparato per l'analisi TFM delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I risultati includono ...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'implementazione della litografia multifotone per fabbricare array tridimensionali di marcatori fiduciari fluorescenti incorporati in idrogel a base di poli(etilene glicole) per l'uso come microscopia a forza di trazione senza riferimenti Piattaforme. Utilizzando queste istruzioni, la misurazione della deformazione del materiale 3D e il calcolo delle trazioni cellulari è semplificata per promuovere misurazioni della forza di trazione ad alta produttività.

Fabbricazione e implementazione di una piattaforma di microscopia della forza di trazione senza riferimenti

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

La microscopia a forza di trazione viene utilizzata per misurare le forze generate dalle cellule. Questo protocollo semplifica l'analisi di raccolta dei dati della forza di trazione, al fine di renderli più accessibili agli utenti inesperti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle piattaforme di microscopia a forza di trazione senza riferimenti esistenti, è che la litografia multifotona consente una riprogettazione rapida e semplice dell'impostazione del patterning in base alle singole esigenze sperimentali.Ci sono molti passaggi chiave nella fabbricazione e nell'implementazione di questa nuova piattaforma di trazione senza riferimenti che sono più facili da capire attraverso la rappresentazione visiva piuttosto che il solo testo. Per la fotopolimerizzazione dell'idrogel di base, aggiungere prima tre microlitri della soluzione prepoli polimerica su un foglio sottile e piatto di alcani perfluoroalossici e posizionare strisce PDMS piatte spesse 150 micrometri che circondano, ma non a contatto con, la goccia di soluzione pre-polimerica. Posizionare un coverslip silanizzato acrilato sul PDMS, con la goccia pre-polimerica centrata sotto la coverslip per appiattire la goccia pre-polimerica allo spessore dei distanziati PDMS.Esporre la soluzione pre-polimerica sandwich alla luce UV per circa un minuto. Quando un idrogel è completamente formato, separare accuratamente il coverslip dai distanziati PDMS. Utilizzare un adesivo acrilico a doppia parte ad alte prestazioni per attaccare una piastra di Petri a fondo aperto al coperchio.Prestare particolare attenzione quando si aderisce il coverslip carico di idrogel alla piastra di Petri. Un piatto bagnato o una pressione troppo bassa durante l'applicazione consentiranno la forma di perdite, rovinando il campione. Applicare pressione sulla superficie di contatto adesiva per creare una tenuta completa tra la coverlip, l'adesivo e la piastra di Petri, facendo attenzione a non rompere il vetro.Utilizzare PBS filtrato sterile per risciacquare l'idrogel. Quindi aggiungere otto microlitri di NVP a 800 microlitri della soluzione di laboratorio preparata per la sintesi dell'idrogel. Per convertire un'immagine binaria in una maschera digitale, aprite MATLAB e aprite ed eseguite runscript.m Script MATLAB. Selezionare il file TIF binario per la conversione e selezionare una cartella per salvare i file dell'area. Immettere la dimensione finale desiderata nei micron dell'immagine selezionata.L'immagine di input verrà ridimensionata e quotata in modo che corrisponda a questi parametri. Per creare un singolo array di pixel, nelle opzioni generatore area di interesse deselezionare la casella Rimuovi tic in Piccole regioni/singoli pixel, selezionare la casella Quadrati e deselezionare Usa in Linee di interruzione orizzontali. Quindi, fare clic su OK. Il file OVL si trova nella cartella specificata in precedenza.Aprire il file nel software al microscopio e caricare le regioni desiderate che controllavano l'otturatore laser durante la litografia a scansione laser a due fotoni. I seguenti passaggi devono essere eseguiti in condizioni con una luce minima. Per la fabbricazione di array di marcatori fiduciari in condizioni di scarsa illuminazione, mescolare accuratamente 200 microlitri della soluzione di laboratorio NVP precedentemente preparata con 20 milligrammi di Alexa Fluor 633 e rimuovere tutto il PBS dal piatto contenente l'idrogel.Aggiungere la miscela PEG-633 all'idrogel come goccia che comprende completamente l'idrogel di base e caricare la piastra di Petri sul supporto del campione dello stadio del microscopio. Quindi coprire il piatto e lasciare che la soluzione di modelliatura si immergi nell'idrogel per almeno 30 minuti, protetta dalla luce. Per configurare il microscopio per l'imaging, selezionare i laser e i filtri appropriati per visualizzare Alexa Fluor 488.Individuare l'idrogel utilizzando il segnale PEG-488 e bloccare la raccolta di lunghezze d'onda di emissione più lunghe dal rivelatore. Utilizzare scansioni verticali e orizzontali delle piastrelle per individuare il centro dell'idrogel nel piano XY e azzerare lo stadio in questa posizione. Utilizzare le scansioni di linea nella funzione Z-stack per individuare la superficie dell'idrogel e azzerare la messa a fuoco in questa posizione.Livellare l'idrogel ripetendo le scansioni di linea lontano dal centro XY per identificare la posizione della superficie, regolando le viti impostate per lo stadio del microscopio, se necessario. All'interno dell'area di lavoro software del microscopio, creare un file di esperimento separato per la fotopatterning e impostare la potenza multi-fotone sull'1,8% e la velocità di scansione su sei. Regola le dimensioni del fotogramma dell'immagine e dei pixel per ottenere una dimensione in pixel di 0,1 micrometri per pixel e proporzioni da 100 a uno e carica il file delle aree nella scheda dell'area.Utilizzare una macro per impostare tutte le aree per acquisire e attivare la funzione Z-stack. Impostare la spaziatura su 3,5 micrometri per una profondità totale di 28 micrometri e un numero totale di fette Z di nove. Quindi utilizzare la funzione Posizioni per impostare posizioni specifiche sull'idrogel in cui verranno fotopatterned gli array di marcatori fiduciari.Man mano che il tempo di immersione si avvicina al segno di 30 minuti, acquisire successive scansioni della linea Z-stack della superficie dell'idrogel ogni cinque minuti per verificare la presenza di gonfiore in base ai cambiamenti nella posizione della superficie rispetto alla posizione di messa a fuoco azzerato. Se non si è verificato alcun cambiamento nella posizione della superficie nell'intervallo di cinque minuti, eseguire le impostazioni di patterning e utilizzare il laser a 488 nanometri per verificare che la superficie dell'idrogel non si sia mossa durante la creazione della serie. Quindi rimuovere l'idrogel dal microscopio, aspirare la soluzione PEG-633 dalla piastra di Petri e sciacquare la piastra con PBS filtrato sterile.Per acquisire una cella e immagini di marcatori fiduciari, riportare la piastra di Petri al portacampioni per individuare le aree modellate. Individuare una cella di interesse e acquisire un'immagine trasmessa o fluorescente della cella. Quindi acquisire una pila Z dell'array modellato sotto la cella come dimostrato, e acquisire un secondo set di immagini trasmesse o fluorescenti della cella.Quando si raccoglie uno stack di immagini, le immagini risultanti devono visualizzare una serie regolare di feature con motivi che oscillano in intensità in funzione della posizione Z all'interno dello stack di immagini. Il tracciamento. m script fornisce diverse immagini diagnostiche, tra cui una proiezione Z dei marcatori fiduciari fluorescenti per valutare la qualità di pre-elaborazione, un grafico dei centroidi rilevati, codificato a colori in funzione della posizione Z per valutare la qualità di rilevamento degli oggetti e un grafico delle tracce che rappresentano i baricentri marcatori rilevati che sono stati collegati in colonne nella direzione Z per valutare la qualità di tracciamento degli oggetti.Lo script DISP 3D.m fornisce un grafico di intensità in funzione della posizione Z per ogni colonna di funzionalità rilevate in un dato stack di immagini per valutare la qualità dei profili di intensità del marcatore fiduciario. Entrambi DISP 3D.m e taglio DISP. m insieme forniscono istogrammi del rumore di spostamento misurato in ciascuna delle dimensioni delle coordinate cartesiane e mappe di calore interpolate di spostamento. Inoltre, l'interp final3D_2.m fornisce mappe di calore delle trazioni superficiali calcolate utilizzando il codice in outsourcing. La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che le soluzioni contenenti LAP sono sensibili alla luce e dovrebbero essere protette il più possibile da fonti di luce ambientale. Ricorda che NVP è un composto organico volatile e deve sempre essere maneggiato in una cappa a flusso chimico.

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La microscopia della forza di trazione ad alta velocità di throughput tramite PDMS rivela effetti dipendenti dalla dose di trasformazione del fattore di crescita , sulla transizione epitelil-to-mesenchymic

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