Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
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バンダは、NSF IGERT SBE2フェローシップ(1144726)、デラウェア大学が提供するスタートアップファンド、国立衛生・国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)からの資金提供を受けました。JHSは、国立衛生研究所/国立がん研究所IMATプログラム(R21CA214299)と国立科学財団キャリア賞プログラム(1751797)からの資金援助を受けています。顕微鏡検査アクセスは、NIH-NIGMS(P20 GM103446)、NSF(IIA-1301765)およびデラウェア州からの助成金によってサポートされました。構造化照明顕微鏡は、デラウェア州連邦研究開発助成プログラム(16A00471)からの資金で取得されました。2光子レーザー走査リソグラフィに使用されるLSM880共焦点顕微鏡は、共有計装交付金(S10 OD016361)で取得されました。

1. PEGDA塩基ヒドロゲルを光重合
<ol><li>
試薬の収集
	<ol>
<li>リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)、3.4 kDaポリ(エチレン)グリコールダイアクリレート(PEGDA)、n-ビニルピロリドン(NVP)、アレクサフルオール488標識PEGDA(PEG-488)、アレクサフルオール633標識PEGDA(PEGDA)を収集PEG-RGDS)をそれぞれの冷凍庫から、それぞれを室温にします。</li>
		<li>別々の琥珀色...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

このプロトコルの目的は、TFM データの生成と分析に関連する困難の多くを軽減するワークフローを提供することです。一度調製されると、フォトパターン化されたヒドロゲルは使いやすく、標準的な組織培養慣行と蛍光顕微鏡の知識のみを必要とします。リファレンスフリーのアスペクトにより、セルを含むヒドロゲルの気楽なナビゲーションが可能になり、参照画像と変形画像間の画像登...

牽引力顕微鏡(TFM)は、付着細胞および収縮細胞によって生成された受動マーカーの補間変位場を使用して細胞トラクションを近似するプロセスである。TFMを用いて、増殖、分化、および移行などの重要な細胞プロセスに対する細胞外環境における機械的手がかりの影響を調査することができる1、2、3、4 ,5,6,7,8,9,10,11,12.残念ながら、既存のアプローチの多くは実装が難しいか、高度に専門化された分析ツールや計算ツールに精通している必要があり、経験の浅い研究者が TFM を使用することは困難です。分析の難しさを解消しつつ、ハイスループットのデータ取得を提供するTFMプラットフォームを生成する方法論について述べた。
既存のTFMアプローチのうち、材料株の定量化に最も一般的に使用されるのは、ポリアクリルアミド(PAA)またはポリなどの変形可能なヒドロゲルに小さな蛍光マーカー(通常はナノまたはマイクロメートルサイズの蛍光ビーズ)を取り込むことを含む。(エチレングリコール) ダイアクリレート (PEGDA)13,14,15.これらのビーズベースのアプローチは、変位サンプリングを最大化するために、対象のセルの周りにフィデューシャルマーカーを密集させる機能を提供します。残念ながら、ヒドロゲル全体のビーズの分布を直接制御することはできないため、空間的な組織はランダムです。このランダムな配置は、ビーズが互いに近すぎて正確に解決できないなどの問題を引き起こしたり、基板のパッチが低品質のデータを生み出すように広がったりします。細胞が存在しない場合に、フィデューシャルマーカーがどこに存在するかを予測できないため、収集されたセルトラクションデータのセットごとに、緩和された状態で基になるマーカーの追加参照画像もキャプチャする必要があるという制約が生じます。強調されたイメージとストレスのないイメージの差として、強調されたイメージの変位を近似できるように、参照イメージが必要です。リラックスした状態を達成するために、測定される細胞は化学的にリラックスするか、または完全に除去される。このプロセスは、多くの場合、さらなる実験測定値の獲得を妨げ、長期細胞研究を阻害し、スループットを制限する。参照画像はまた、実験中に発生した可能性のあるドリフトに対応するために画像登録技術を必要とし、多くの場合、画像を参照するストレス状態画像の面倒な手動マッチングにつながります。
参照フリーとみなされる他のTFM法は、高解像度リソグラフィ、マイクロコンタクト印刷、またはマイクロモールディング16、17、18のいずれかによって、フィデューシャルマーカーの分布を何らかの形で制御する、19、20.リファレンスフリーTFMは、製造プロセス中にマーカー位置がどのように規定されたかに基づいて、各フィデューシャルマーカーの緩和状態を予測できるという仮定によって達成される。これらの方法は、フィデュースマーカーの変位が、フィデュースマーカージオメトリから推測できるよりも暗黙的な参照と比較して測定される単一の画像キャプチャ内でセルの張力状態を完全にキャプチャすることを可能にします。マーカー配置の一貫性は通常、これらのプラットフォームを使用して達成されますが、一般的に、1)トラクション解像度の低下を含む広く使用されているビーズベースのアプローチに対する独自の欠点に苦しんでいます。2)平面外変位の精度の低下(場合によっては完全に測定できない)。そして3)プラットフォーム基板および材料のカスタマイズ性の低下(例えば、リガンド提示、機械的特性)。
これらの欠点に対処するために、新しいリファレンスフリー TFM プラットフォームを設計しました。このプラットフォームは、マルチフォトン活性化化学を利用して、材料の歪みを測定するためのフィデューシャルマーカーとして機能するヒドロゲル内の特定の3D位置に蛍光素の少量を架け取ります。このように、我々はビーズベースのアプローチと同様に動作するプラットフォームを設計しましたが、フィデューシャルマーカーがグリッド化された配列に編成され、参照フリーの材料ひずみ追跡を可能にするという大きな利点があります。このリファレンスフリーのプロパティは、多くの利点を提供します。まず第一に、細胞トラクション状態の非侵入的なモニタリングを可能にする(すなわち、細胞をリラックスまたは除去する必要性を回避し、変位した受託マーカーの参照位置を獲得する必要を回避する)。これは、破壊的なエンドポイントTFMアプローチでは困難なTFMと組み合わせて他の下流分析方法を組み込むことを意図したので、このシステムを設計する上で私たちの主な目標でした。次に、グリッド配列に基づく暗黙的な参照を使用すると、変位解析のほぼ完全な自動化が可能になります。配列の規則性は、例外的なケースの発生 (つまり、最適でないマーカー間隔や登録の不一致など、予期しないアーティファクトを含むサンプルセル データ) を最小限に抑えることができる予測可能なワークフローを作成します。第3に、参照画像を取得する必要性を持つ場合は、長期間にわたって単一のサンプル上の多くのセルを自由に監視できます。これは従来のビーズベースのアプローチとは対照的で、顕微鏡の自動ステージの動きの忠実さに応じて、位置決めの誤差が蓄積し、細胞張力に基準画像を適切に登録する難易度を高めることができます。画像。全体的に、このプラットフォームは、細胞張力データを収集する上で高いスループットを容易にします。
このプロトコルを使用して、我々は、種子細胞によって生成された平面外のトラクション成分を測定するために、このリファレンスフリーTFMプラットフォームを生成するために実装した2光子、レーザースキャニングリソグラフィ技術を読者に理解したいと考えています。表面に。このプロトコルではカバーされていないのは、一部の単量体成分の合成である。一般に、これらの反応は、前述の21とほぼ同一の「ワンポット」合成反応スキームを含み、これらの製品に代わるものも購入することができる。また、市販のレーザー走査顕微鏡を3D印刷ツールとして使用し、受託マーカー変位の解析を容易にするために、生成したソフトウェアベースのツールを読者に理解することを目指しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

細胞誘発物質の変形を定量化すると、細胞が微小環境の物理的特性をどのように感知し、それに反応するかに関する有用な情報が提供されます。細胞誘発物質株を測定するための多くのアプローチが存在する一方で、ここでは、参照フリーの方法でサブミクロン分解能で歪みを監視するための方法論を提供します。2光子活性化フォトリソグラフィパターニングプロセスを用いて、蛍光線マーカーの埋め込み配列を含む機械的および生体的に微細に微細に誘導可能な合成基板を生成し、3次元を容易に測定する方法を示します(3D)サーフェストラクションに応答する材料変形プロファイル。これらの基質を使用して、セル張力プロファイルは、対象セルの単一の 3D イメージ スタックを使用してマッピングできます。この方法論の目標は、トラクションフォース顕微鏡検査をよりアクセスしやすく、細胞メカノトランスダクションプロセスを研究する研究者、特にこの分野の新規参入者のためのツールを実装しやすくすることです。

プロトコル全体を通じて、パターニング手順の品質を評価するためのフィードバックを提供するチェックポイントがいくつかあります。各チェックポイントの進捗状況を評価する方法に関する洞察を提供するために、実際の実験の代表的な結果を提供します。結果は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)のTFM分析のために調製されたフォトパターンヒドロゲルに対して行われたこのプロトコルの適用を...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ベースのヒドロゲルに埋め込まれた蛍光線マーカーの3次元配列を製造するための多光子リソグラフィーを実装するための指示を提供し、参照フリー、トラクション力顕微鏡として使用します。プラットフォーム。これらの指示を使用して、3D材料ひずみの測定および細胞牽引の計算は高スループット牽引力の測定を促進するために簡単にされる。

リファレンスフリートラクションフォース顕微鏡プラットフォームの製造と実装

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

牽引力顕微鏡は細胞生成力を測定するために使用される。このプロトコルは、経験の浅いユーザーにアクセスしやすくするために、牽引力データの収集分析を簡素化します。既存の基準のない牽引力顕微鏡のプラットホームに対するこの技術の主な利点は、多光子リソグラフィーが個々の実験の必要性に従って迅速かつ容易なパターン設定の再設計を可能にする。この新しい参照フリー牽引プラットフォームの作成と実装には、テキストだけではなく視覚的表現を通じて理解しやすい多くの重要なステップがあります。ベースヒドロゲルの光重合のために、まず、プレポリマー溶液の3マイクロリットルをパーフルオロアルコキシアルカンの薄い平らなシートに加え、平らな150マイクロメートル厚PDMSストリップを周囲に配置しますが、前ポリマー溶液のドロップには触れられません。PDMS上にアクリレートシラナイズカバースリップを置き、プリポリマー液滴をカバースリップの下に中央に置き、プリポリマー液滴をPDMSスペーサーの厚さに平らにします。サンドイッチプレポリマー溶液を約1分間UV光に曝します。ヒドロゲルが完全に形成されたら、PDMSスペーサーからカバースリップを慎重に分離します。カバースリップにオープンボトムペトリ皿を取り付けるために高性能両面アクリル接着剤を使用してください。ペトリ皿にヒドロゲルを積んだカバースリップを付着するときは、特別な注意を払ってください。濡れた皿やアプリケーション中の圧力が少なすぎると、漏れが発生し、サンプルが台無しになります。接着剤接触面に圧力をかけ、カバースリップ、接着剤、ペトリ皿の間に完全なシールを作成し、ガラスを割らないよう注意してください。滅菌濾過されたPBSを使用してヒドロゲルをすすいだ。次に、ヒドロゲル合成のために調製したラボ溶液の800マイクロリットルに8マイクロリットルのNVPを加えます。バイナリイメージをデジタルマスクに変換するには、MATLABを開いて、runscript を開いて実行します。m MATLAB スクリプト。変換するバイナリ TIF ファイルを選択し、リージョンのファイルを保存するフォルダを選択します。選択した画像の最終サイズをミクロンで入力します。入力イメージは、これらのパラメータに合わせてスケーリングおよび寸法が設定されます。単一ピクセル配列を作成するには、[対象ジェネレータ オプションの領域] で、[小さい領域/単一ピクセル] の下にある [ティックを削除] チェックボックスをオフにし、[正方形] チェック ボックスをオンにして、[水平破断線] の [使用] をオフにします。次に、[OK] をクリックします。OVL ファイルは、以前に指定したフォルダーにあります。顕微鏡ソフトウェアでファイルを開き、2つの光子レーザースキャンリソグラフィー中にレーザーシャッターを制御した所望の領域をロードします。次の手順は、最小限の光で実行する必要があります。低照度条件下での受託マーカーアレイの製造のために、前に調製したNVPラボ溶液の200マイクロリットルを20ミリグラムのAlexa Fluor 633と完全に混合し、ヒドロゲルを含む皿からPBSのすべてを取り除きます。PEG-633混合物を、塩基ヒドロゲルを完全に包含する液滴としてヒドロゲルに加え、ペトリ皿を顕微鏡ステージのサンプルホルダーにロードします。その後、皿を覆い、パターニング溶液を少なくとも30分間ヒドロゲルに浸し、光から保護します。イメージング用の顕微鏡を構成するには、Alexa Fluor 488を視覚化するための適切なレーザーとフィルタを選択します。PEG-488信号を使用してヒドロゲルを見つけ、検出器からの長い発光波長の収集をブロックします。垂直および水平タイル スキャンを使用して、XY 平面内のハイドロゲルの中心を特定し、この位置のステージをゼロにします。Zスタック関数でラインスキャンを使用してヒドロゲルの表面を見つけ、この位置でフォーカスをゼロにします。XYセンターから離れたラインスキャンを繰り返してヒドロゲルをレベル付けし、必要に応じて、マイクロスコープステージ用のセットねじを調整して表面位置を特定します。顕微鏡ソフトウェアワークスペース内で、フォトパターン作成用の別の実験ファイルを作成し、マルチフォトンパワーを1.8%、スキャン速度を6に設定します。イメージフレームとピクセルのサイズを調整して、ピクセル単位で 0.1 マイクロメートルのピクセルサイズと 100 対 1 のアスペクト比を実現し、リージョン ファイルを領域のタブに読み込みます。Z スタック関数を取得してオンにする領域をすべて設定するには、マクロを使用します。間隔を 3.5 マイクロメートルに設定し、合計深さ 28 マイクロメートル、Z スライスの総数を 9 に設定します。次に、Positions 関数を使用して、フィデューシャル マーカー配列がフォトパターン化されるヒドロゲル上の特定の位置を設定します。ソークタイムが30分のマークに近づくと、5分ごとにヒドロゲルの表面の連続したZスタックラインスキャンを取得し、ゼロフォーカス位置に対する表面の位置の変化に基づいて腫れをチェックします。5分間に表面位置に変化が生じなかった場合は、パターニング設定を実行し、488ナノメートルレーザーを使用して、パターニング中にヒドロゲルの表面が動かなかったことを確認します。次に、顕微鏡からヒドロゲルを取り出し、ペトリ皿からPEG-633溶液を吸引し、滅菌濾過PBSで皿を洗い換えます。細胞および受託マーカー画像を取得するには、ペトリ皿をサンプルホルダーに戻してパターン化された領域を見つけます。目的の細胞を見つけ、細胞の透過画像または蛍光画像を取得します。次に、示されているように、細胞の下にあるパターン化された配列のZスタックを取得し、細胞の送信または蛍光画像の第2のセットを取得する。イメージ スタックを収集する場合、結果のイメージは、イメージ スタック内の Z 位置の関数として、強度で振動するパターン化されたフィーチャの通常の配列を表示する必要があります。追跡。mスクリプトは、前処理品質を評価するための蛍光受託者マーカーのZ投影、検出された重心のプロット、物体検出品質を評価するZ位置の関数として色分けされた、Z方向のカラムにリンクされた検出されたマーカー重心を表すトラックのプロットなど、いくつかの診断画像を提供し、オブジェクトトラッキング品質を評価します。DISP 3D.mスクリプトは、特定の画像スタックで検出された特徴の各列のZ位置の関数として強度のプロットを提供し、受託者マーカー強度プロファイルの品質を評価します。両方の DISP 3D。m と DISP のせん断。mは、各デカルト座標寸法における測定された変位ノイズのヒストグラムと、変位の補間されたヒートマップを提供します。また、インター final3D_2。m は、外部委託されたコードを使用して計算されたサーフェス トラクションのヒート マップを提供します。この手順で覚えておくべき最も重要なことは、LAP を含むソリューションは光に敏感であり、周囲の光源から可能な限り保護する必要があります。NVPは揮発性有機化合物であり、常に化学流れフードで処理する必要があることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

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