Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

O. A. Banda ble støttet av midler fra en NSF IGERT SBE2 fellesskap (1144726), oppstart midler gitt av University of Delaware, og National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299). JHS er støttet av finansiering fra National Institutes of Health/National Cancer Institute IMAT program (R21CA214299) og National Science Foundation CAREER Award program (1751797). Mikroskopi tilgang ble støttet av tilskudd fra NIH-NIGMS (P20 GM103446), NSF (IIA-1301765) og staten Delaware. Den strukturerte lys mikroskop ble anskaffet med midler fra staten Delaware Federal Research and Development Grant program (16A00471). Den LSM880 konfokalmikroskopi mikroskop brukes for to-Foton laserskanning litografi ble kjøpt med en delt instrumentering stipend (S10 OD016361).

1. Photopolymerizing en PEGDA base hydrogel
<ol><li>
Samle reagenser
	<ol>
<li>Samle Lithium fenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), 3,4 kDa Poly (etylen) glykol diacrylate (PEGDA), n-vinyl pyrrolidon (NVP), AlexaFluor 488 merket PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 merket PEGDA (PEG-633), og pegylert RGDS peptid ( PEG-RGDS) fra sine respektive frysere og bringe hver til romtemperatur.</li>
		<li>I separate rav mikrosentrifugen rør, måle 3 mg LAP, 10 mg PEGDA, 5 mg PEG-488, 20 mg PEG-633, og 6 mg...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

Målet med denne protokollen er å gi en arbeidsflyt som lindrer mye av vanskelighetene knyttet til generering og analyse av TFM data. Når forberedt, de photopatterned hydrogeler er enkle å bruke, som krever bare kjennskap til standard vev kultur praksis og fluorescens mikroskopi. Referansen-gratis aspekt muliggjør bekymringsløs navigering på celle-Laden hydrogeler og eliminerer tungvint bildebehandling trinn som bilde registrering mellom referanse og deformert bilder. Den resulterende analysen er nesten helt automa...

Traction Force mikroskopi (TFM) er prosessen med tilnærme mobilnettet tractions bruker interpolert forskyvning felt av fiducial markører generert av en tilhenger og kontraktile celle. Ved hjelp av TFM, påvirkning av mekaniske stikkordene i ekstracellulære miljø på viktige cellulære prosesser som spredning, differensiering, og migrasjon kan undersøkes1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Dessverre, mange eksisterende tilnærminger kan være vanskelig å gjennomføre eller krever kjennskap til høyt spesialiserte analytiske og beregningsorientert verktøy gjør TFM vanskelig for uerfarne forskere å bruke. Vi beskriver en metodikk for å generere en TFM-plattform som eliminerer noen av vanskelighetene i analysen, samtidig som det gir datainnhenting med høy gjennomstrømming.
Av de eksisterende TFM tilnærminger, den mest brukte for kvantifisere materielle belastningen innebærer inkorporering av små fluorescerende markører (vanligvis nano-eller mikrometer-sized fluorescerende perler) i en deformerbare hydrogel, for eksempel polyakrylamid (PAA) eller Poly (etylen glykol) diacrylate (PEGDA)13,14,15. Disse perle-baserte tilnærminger gir muligheten til tett klynge fiducial markører rundt en celle av interesse for å maksimere forskyvning prøvetaking. Dessverre kan fordelingen av perlene i hele hydrogel ikke styres direkte, slik at den romlige organisasjonen er tilfeldig. Denne tilfeldige plassering fører til problemer som perler som er for nær hverandre for å nøyaktig løse, eller så spredt at flekker av underlaget gir lav kvalitet data. Manglende evne til å forutsi hvor fiducial markører ligger i fravær av celler skaper også en begrensning som, for hvert samlet sett av celle trekkraft data, en ekstra referanse bilde av de underliggende markører i en avslappet tilstand må også fanges. Referansen bildet er nødvendig slik at forskyvning i stresset bildet kan anslås som forskjellen mellom stresset og trykklette bilder. For å oppnå en avslappet tilstand, cellene som måles er enten kjemisk avslappet eller helt fjernet. Denne prosessen hindrer ofte anskaffelse av ytterligere eksperimentelle målinger, hemmer langsiktige celle studier, og begrenser gjennomstrømming. En referanse bildet krever også bilde registrering teknikker for å imøtekomme for drift som kan ha skjedd under eksperimentering, ofte fører til tungvint manuell Matching av stress tilstand bilder til referanse bilder.
Andre TFM metoder anses referanse-fri, implementere noen form for kontroll over fordelingen av fiducial markører, enten ved høy oppløsning litografi, microcontact utskrift, eller micromolding16,17,18 ,19,20. Referanse-Free TFM oppnås gjennom antagelsen om at avslappet tilstand for hver fiducial markør kan anslås basert på hvordan markør posisjoner ble foreskrevet under fabrikasjon prosessen. Disse metodene gir mulighet for fullstendig fangst av en celle spennings tilstand innenfor et enkelt bilde fangst der fiducial markør forskyvninger måles i forhold til en underforstått referanse enn det som kan utledes fra fiducial markør geometri. Mens konsistens i markørplassering er vanligvis oppnås ved hjelp av disse plattformene, de vanligvis lider av sine egne svakheter i forhold til de mye brukte perle-baserte tilnærminger inkludert: 1) redusert trekkraft oppløsning; 2) redusert nøyaktigheten av ut-av-flyet forskyvninger (i noen tilfeller en fullstendig manglende evne til å måle); og 3) nedsatt customizability av plattform underlag og materialer (f.eks. ligand presentasjon, mekaniske egenskaper).
For å løse disse svakhetene, utviklet vi en ny referanse-fri TFM-plattform. Plattformen benytter multiphoton aktivert kjemi for å krysskobling et lite volum av en fluoroforen i bestemte 3D steder innenfor hydrogel som fungerer som fiducial markører for å måle materielle belastninger. På denne måten har vi designet en plattform som opererer på samme måte som perle-baserte tilnærminger, men med den betydelige fordelen at fiducial markører er organisert i gridded arrays slik at referanse-fri materiale belastning sporing. Dette referanse-fri eiendom gir mange fordeler. Først og fremst gir det for ikke-påtrengende overvåking av cellulære trekkraft tilstander (dvs. omgår behovet for å slappe av eller fjerne celler for å erverve referanse posisjoner av fordrevne fiducial markører). Dette var vårt primære mål i utformingen av dette systemet, som vi hadde til hensikt å innlemme andre nedstrøms analytiske metoder i tandem med TFM, som kan være vanskelig med destruktive endepunkt TFM tilnærminger. For det andre, ved hjelp av en underforstått referanse basert på gridded arrays tillater nesten komplett automatisering av forskyvning analyse. Den regularitet av arrays skaper en forutsigbar arbeidsflyt der forekomsten av eksepsjonelle tilfeller (dvs. eksempel celledata som inneholder uventede gjenstander som suboptimal markør avstand eller registrering uoverensstemmelser) kan opprettholdes på et minimum. For det tredje, avkall behovet for å erverve en referanse bilde gir frihet til å overvåke mange celler på en enkelt prøve over lengre perioder av gangen. Dette står i kontrast til tradisjonelle perle-baserte tilnærminger, der, avhengig av troskap til mikroskopet automatiserte etappe bevegelser, feil i posisjonering kan akkumulere og øke vanskeligheten av riktig å registrere referanse bilder til celle spenning Bilder. Overall, forenkler denne plattformen høyere gjennomstrømming i å samle mobilnettet spennings data.
Med denne protokollen, håper vi å bli kjent med leserne med to-Foton, laserskanning litografi teknikk som vi implementert for å generere denne referansen-fri TFM plattform for å måle i-fly og ut-av-flyet trekkraft komponenter generert av celler seeded på overflaten. Ikke dekket i denne protokollen er syntesen av noen av de monomere komponentene. Generelt, disse reaksjonene inkluderer nesten identiske "en-pott" syntese reaksjons ordninger beskrevet tidligere21, og alternativer til disse produktene kan også kjøpes. Vi har også som mål å gjøre leserne kjent med programvarebasert verktøy vi genererte for å fremme bruken av kommersielt tilgjengelige laser-skanning mikroskop som 3D-utskrift verktøy og for å lette analysen av fiducial markør forskyvninger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

Kvantifisere celle-indusert materiale deformasjon gir nyttig informasjon om hvordan cellene forstand og svare på de fysiske egenskapene til deres mikromiljøet. Mens mange tilnærminger finnes for å måle celle-indusert materiale belastning, her gir vi en metodikk for overvåking stamme med sub-mikron oppløsning i en referanse-fri måte. Ved hjelp av en to-Foton aktivert photolithographic mønstre prosess, viser vi hvordan å generere mekanisk og bio-aktivt tunable syntetiske underlag som inneholder innebygde arrays av fluorescerende fiducial markører for enkelt å måle tredimensjonale ( 3D) materiale deformasjon profiler som svar på overflaten tractions. Ved hjelp av disse underlag, kan celle spennings profiler tilordnes ved hjelp av et enkelt 3D-bilde stabel av en celle av interesse. Vårt mål med denne metodikken er å gjøre traction Force mikroskopi en mer tilgjengelig og enklere å implementere verktøy for forskere som studerer cellulære mechanotransduction prosesser, spesielt nykommere til feltet.

Gjennom hele protokollen er det en rekke sjekkpunkter som gir tilbakemelding for å vurdere kvaliteten på mønster prosedyren. For å gi innsikt om hvordan man vurderer fremdriften ved hvert av disse kontrollpunktene, gir vi representative resultater for et eksperiment. Resultatene markere anvendelsen av denne protokollen utført på en photopatterned hydrogel forberedt på TFM analyse av menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs). Resultatene inkluderer rå bildedata i tillegg til behandlede data utganger i hve...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform at JoVE.com

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Denne protokollen gir instruksjoner for gjennomføring multiphoton litografi å dikte tredimensjonale arrays av fluorescerende fiducial markører innebygd i Poly (etylen glykol)-basert hydrogeler for bruk som referanse-fri, traction Force mikroskopi Plattformer. Ved hjelp av disse instruksjonene, måling av 3D-materiale belastning og beregning av cellulære tractions er forenklet for å fremme høy gjennomstrømming traction Force målinger.

Fabrikasjon og implementering av en referanse-fri traction Force mikroskopi plattform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Trekkraft kraft mikroskopi brukes til å måle cellegenererte krefter. Denne protokollen forenkler innsamlingsanalysen av trekkraftkraftdata, for å gjøre den mer tilgjengelig for uerfarne brukere. Den største fordelen med denne teknikken over eksisterende referansefrie trekkraft kraft mikroskopi plattformer, er at multiphoton litografi gir en rask og enkel mønsterinnstilling innstilling redesign i henhold til individuelle eksperimentelle behov.Det er mange viktige trinn i fabrikasjon og implementering av denne nye referansefrie trekkraftplattformen som er lettere å forstå gjennom visuell representasjon i stedet for tekst alene. For fotopolymerisering av basehydrogelen, legg først til tre mikroliter av prepolymerløsningen på et tynt, flatt ark med perfluoroalkoxyalkaner, og legg flate 150 mikrometer tykke PDMS-strimler rundt, men ikke i kontakt med, dråpen av pre-polymer løsning. Plasser en akrylatsilanisert dekkslipp på PDMS, med pre-polymer dråpe sentrert under dekkslips for å flate pre-polymer dråpe til tykkelsen på PDMS avstandss avstandsstykkene.Utsett den sandwichede prepolymerløsningen for UV-lys i omtrent ett minutt. Når en hydrogel er fullt dannet, må du forsiktig skille dekkglasset fra PDMS avstandsslene. Bruk dobbeltsidig akryllim med høy ytelse til å feste en åpen bunn Petriskål til dekkslippen.Vær spesielt forsiktig når du yter den hydrogel-laden dekkslips til Petri parabolen. En våt tallerken eller for lite trykk under søknaden vil tillate lekkasjer å danne, ødelegge prøven. Påfør trykk på klebemiddelkontaktflaten for å skape en komplett forsegling mellom dekkslips, lim og petriskål, og ta vare på å ikke knekke glasset.Bruk sterilt filtrert PBS til å skylle hydrogelen. Tilsett deretter åtte mikroliter av NVP til 800 mikroliter av laboratorieløsningen som er klargjort for hydrogelsyntesen. Hvis du vil konvertere et binært bilde til en digital maske, åpner du MATLAB og åpner og kjører runscript.m MATLAB script. Velg den binære TIF-filen for konvertering, og velg en mappe for å lagre regionens filer. Skriv inn ønsket endelig størrelse i mikron av det valgte bildet.Inndatabildet skaleres og dimensjoneres slik at det samsvarer med disse parameterne. Hvis du vil opprette én enkelt pikselmatrise, fjerner du merket for Fjern tic under Små områder/enkeltpiksler i Område for interessegenerator, merker av for Fjern tic under Små områder/enkeltpiksler, merker av for Kvadrater tic og fjerner merket for Bruk under Vannrette bruddlinjer. Klikk deretter OK. OVL-filen vil bli funnet i den tidligere angitte mappen.Åpne filen i mikroskopprogramvaren og last de ønskede områdene som kontrollerte laserlukkeren under to foton laserskanning litografi. Følgende trinn bør utføres under forhold med minimalt lys. For fabrikasjon av fiducial arrays under dårlige lysforhold, bland 200 mikroliter grundig av den tidligere tilberedte NVP-laboratorieløsningen med 20 milligram Alexa Fluor 633 og fjern alle PBS fra fatet som inneholder hydrogelen.Tilsett PEG-633-blandingen til hydrogelen som en dråpe som helt omfatter basehydrogelen og last petriskålen på prøveholderen på mikroskopstadiet. Dekk deretter parabolen og la mønsterløsningen suge inn i hydrogelen i minst 30 minutter, beskyttet mot lys. Hvis du vil konfigurere mikroskopet for bildebehandling, velger du de riktige laserne og filtrene for visualisering av Alexa Fluor 488.Finn hydrogelen ved hjelp av PEG-488-signalet og blokker innsamlingen av lengre utslippsbølgelengder fra detektoren. Bruk vertikale og horisontale flisskanninger for å lokalisere midten av hydrogelen i XY-planet og null scenen i denne posisjonen. Bruk linjeskanninger i Z-stakkfunksjonen til å lokalisere overflaten på hydrogelen og null fokus i denne posisjonen.Utjevn hydrogelen ved å gjenta linjeskanninger bort fra XY-senteret for å identifisere overflateposisjonen, justere de innstilte skruene for mikroskopstadiet etter behov. I arbeidsområdet for mikroskopprogramvare oppretter du en egen eksperimentfil for fotopapirering og setter multi-fotonkraften til 1,8 %og skannehastigheten til seks. Juster størrelsen på bilderammen og pikslene for å oppnå en pikselstørrelse på 0,1 mikrometer per piksel og et sideforhold på 100 til én, og last inn områdefilen i kategorien for området.Bruk en makro til å angi at alle områdene skal anskaffes og aktivere Z-stakkfunksjonen. Sett avstanden til 3,5 mikrometer for en total dybde på 28 mikrometer og totalt antall Z-skiver på ni. Bruk deretter Posisjoner-funksjonen til å angi bestemte steder på hydrogelen der fiducial markørarrayene skal fotopatterned.Når soak-tiden nærmer seg 30 minutters merket, kan du skaffe påfølgende Z-stack-linjeskanninger av overflaten av hydrogelen hvert femte minutt for å se etter hevelse basert på endringer i overflatens plassering i forhold til nullet fokusposisjon. Hvis det ikke har oppstått noen endring i overflateposisjonen i løpet av intervallet på fem minutter, kjører du mønsterinnstillingene og bruker 488 nanometerlaseren til å kontrollere at overflaten på hydrogelen ikke beveger seg under mønsteret. Fjern deretter hydrogelen fra mikroskopet, aspirer PEG-633-oppløsningen fra petriskålen, og skyll fatet med sterilt filtrert PBS.For å skaffe seg en celle og fiducial markør bilder, returnere Petri parabolen til prøveholderen for å finne mønstrede områder. Finn en celle av interesse og tilegne deg et overført eller fluorescerende bilde av cellen. Deretter får du en Z-stabel av den mønstrede matrisen under cellen som demonstrert, og får et andre sett med overførte eller fluorescerende bilder av cellen.Når du samler inn en bildestakk, skal de resulterende bildene vise et vanlig utvalg av mønstrede funksjoner som svinger i intensitet som en funksjon av Z-posisjonen i bildestakken. Sporingen. m script gir flere diagnostiske bilder, inkludert en Z-projeksjon av fluorescerende fiducial markører for å vurdere pre-behandling kvalitet, en tomt av de oppdagede centroids, fargekodet som en funksjon av Z-posisjon for å vurdere objekt deteksjon kvalitet, og en tomt av sporene som representerer den oppdagede markøren centroids som har blitt koblet til kolonner i Z-retning for å vurdere objektsporing kvalitet.DISP 3D.m-skriptet gir et intensitetsplott som en funksjon av Z-posisjonen for hver kolonne med oppdagede funksjoner i en gitt bildestakk for å vurdere kvaliteten på fiducial markørintensitetsprofilene. Begge DISP 3D.m og DISP skjær. m sammen gi histogrammer av målt forskyvning støy i hver av de kartesiske koordinat dimensjoner samt interpolerte varmekart over forskyvning. I tillegg interp final3D_2.m gir varmekart over overflatetrevnet beregnet ved hjelp av outsourcet kode. Det viktigste å huske under denne prosedyren er at løsninger som inneholder LAP er følsomme for lys og bør beskyttes så mye som mulig fra omgivelseslyskilder. Husk at NVP er en flyktig organisk forbindelse og bør alltid håndteres i en kjemisk strømningshette.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Måling av mekaniske egenskaper Living Cells hjelp Atomic Force Mikroskopi

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

En ny metode for lokalisering Reporter fluoriserende perler Nær Cell Culture Surface for trekkraft Mikros

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En High-throughput Cell microarray plattform for samsvarende analyse av celledifferensiering og Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Tørr Film Photoresist-baserte elektrokjemisk Microfluidic Biosensor plattform: Enheten fabrikasjon, på prosessoren analysen forberedelser og systemdriften

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Høy gjennomstrømming traction Force mikroskopi bruke PDMS avslører dose avhengige effekter av transformere vekstfaktor-β på epitel-til-mesenchymal overgang

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Gjennomføring av interferens refleksjon mikroskopi for Label-fri, High-Speed Imaging av Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

En tilpasset multiphoton mikroskopi plattform for live imaging av mus cornea og conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...