Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
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O. A. banda foi apoiado pelo financiamento de uma bolsa NSF IGERT SBE2 (1144726), os fundos de arranque fornecidos pela Universidade de Delaware, e os institutos nacionais de saúde/Instituto Nacional do câncer programa IMAT (R21CA214299). O JHS é apoiado pelo financiamento do programa nacional institutos de saúde/Instituto Nacional de câncer IMAT (R21CA214299) e pelo programa de premiação de carreira da Fundação Nacional de ciência (1751797). O acesso à microscopia foi apoiado por subsídios do NIH-NIGMS (P20 GM103446), do NSF (IIA-1301765) e do estado de Delaware. O microscópio estruturado da iluminação foi adquirido com os fundos do estado do programa federal da concessão da pesquisa e do desenvolvimento de Delaware (16A00471). O microscópio confocal LSM880 usado para a litografia da exploração do laser do dois-fóton foi adquirido com uma concessão compartilhada da instrumentação (S10 OD016361).

1. fotopolimerização de um hidrogel base PEGDA
<ol><li>
Coleta de reagentes
	<ol>
<li>Colete o lítio Phenyl-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosforato (colo), 3,4 kDa poli (etileno) diacrilato de glicol (Pegda), n-vinil pirrolidona (NVP), alexafluor 488 rotulado Pegda (PEG-488), alexafluor 633 rotulado Pegda (PEG-633), e peptídeo pegylated RG PEG-RGDS) de seus respectivos freezers e trazer cada um para a temperatura ambiente.</li>
		<li>Em tubos de microcentrífuga âmbar separados, meça 3 mg de LAP, 10 mg ...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho que alivia grande parte da dificuldade associada à geração e análise de dados de TFM. Uma vez preparados, os hidrogéis fotomodelados são simples de usar, exigindo apenas conhecimento de práticas padrão de cultura tecidual e microscopia de fluorescência. O aspecto livre de referência permite a navegação descuidadas em hidrogéis carregados de células e elimina etapas de processamento de imagens complicadas, como registro de imagem entre imagens de re...

A microscopia de força de tração (TFM) é o processo de aproximação das tracções celulares, utilizando campos de deslocamento interpolados de marcadores de geração de células, gerados por uma célula aderente e contrátil. Usando TFM, a influência de pistas mecânicas no ambiente extracelular em importantes processos celulares como proliferação, diferenciação e migração pode ser investigada1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Infelizmente, muitas abordagens existentes podem ser difíceis de implementar ou exigir familiaridade com ferramentas analíticas e computacionais altamente especializadas, tornando a TFM difícil para os pesquisadores inexperientes usarem. Nós descrevemos uma metodologia para gerar uma plataforma de TFM que elimine alguma da dificuldade na análise ao igualmente fornecer a aquisição de dados da elevado-taxa de transferência.
Das aproximações existentes de TFM, o mais geralmente usado para quantificar a tensão material envolve a incorporação de marcadores fluorescentes pequenos (tipicamente grânulos fluorescentes nano-ou micrômetro-feitos medida) em um Hydrogel deformável, tal como o poliacrilamida (PAA) ou poli (etileno glicol) diacrylate (Pegda)13,14,15. Essas abordagens baseadas em talão fornecem a capacidade de densamente agrupar marcadores de confiança em torno de uma célula de interesse para maximizar a amostragem de deslocamento. Infelizmente, a distribuição dos grânulos durante todo o hidrogel não pode diretamente ser controlada assim que a organização Spatial é aleatória. Esta colocação aleatória leva a problemas como grânulos que são muito próximos uns dos outros para resolver com precisão, ou assim espalhar que os patches do substrato produzem dados de baixa qualidade. A incapacidade de prever onde os marcadores de origem estão na ausência de células também cria uma restrição que, para cada conjunto coletado de dados de tração celular, uma imagem de referência adicional dos marcadores subjacentes em um estado relaxado também deve ser capturada. A imagem de referência é necessária para que o deslocamento na imagem forçada possa ser aproximado como a diferença entre as imagens estressadas e não estressados. Para alcançar um estado relaxado, as células que estão sendo medidos são quimicamente relaxado ou completamente removido. Este processo impede frequentemente a aquisição de umas medidas experimentais mais adicionais, inibe estudos a longo prazo da pilha, e limita a taxa de transferência. Uma imagem de referência também requer técnicas de registro de imagem para acomodar a deriva que pode ter ocorrido durante a experimentação, muitas vezes levando a uma combinação manual complicada de imagens de estado de stress para fazer referência a imagens.
Outros métodos de TFM considerados livres de referência, implementam alguma forma de controle sobre a distribuição de marcadores de uma espécie, seja por litografia de alta resolução, impressão de microcontato ou micromoldagem16,17,18 ,19,20. A TFM sem referência é alcançada através do pressuposto de que o estado relaxado para cada marcador de produção pode ser previsto com base em como as posições dos marcadores foram prescritas durante o processo de fabricação. Esses métodos permitem a captura completa do estado de tensão de uma célula dentro de uma única captura de imagem na qual os deslocamentos de marcador de referência são medidos em comparação com um referencial implícito do que pode ser inferido a partir da geometria do marcador de origem. Embora a consistência na colocação do marcador seja tipicamente alcançada usando essas plataformas, elas geralmente sofrem de suas próprias deficiências em relação às abordagens baseadas em talão amplamente utilizadas, incluindo: 1) diminuição da resolução de tração; 2) diminuição da precisão dos deslocamentos fora do plano (em alguns casos, uma completa incapacidade de medir); e 3) diminuição da customizabilidade dos substratos e materiais da plataforma (por exemplo, apresentação de ligantes, propriedades mecânicas).
Para abordar essas deficiências, projetamos uma nova plataforma TFM sem referência. A plataforma utiliza a química ativada multifóton para Crosslink um pequeno volume de um fluoróforo em locais 3D específicos dentro do hidrogel que servem como marcadores para medir a cepa material. Desta maneira, nós projetamos uma plataforma que opere similarmente às aproximações grânulo-baseadas mas com o benefício significativo que os marcadores de base são organizados em matrizes gridded permitindo o seguimento material referência-livre da tensão. Esta propriedade livre de referência oferece muitas vantagens. Em primeiro lugar, ele permite o monitoramento não intrusivo dos Estados de tração celular (ou seja, contorna a necessidade de relaxar ou remover células para adquirir posições de referência de marcadores de condensação deslocados). Este era nosso objetivo preliminar em projetar este sistema, como nós pretendemos incorporar outros métodos analíticos a jusante em conjunto com o TFM, que pode ser difícil com aproximações destrutivas do ponto final TFM. Em segundo lugar, usando uma referência implícita com base em matrizes de grade permite a automação Near-Complete da análise de deslocamento. A regularidade das matrizes cria um fluxo de trabalho previsível em que a ocorrência de casos excepcionais (ou seja, dados de células de amostra contendo artefatos inesperados, como espaçamento de marcador suboptimal ou incombinações de registro) podem ser mantidos no mínimo. Em terceiro lugar, renunciar à necessidade de adquirir uma imagem de referência fornece a liberdade de monitorar muitas células em uma única amostra durante longos períodos de tempo. Isso contrasta com as abordagens tradicionais baseadas em esferas, onde, dependendo da fidelidade dos movimentos automáticos de estágio do microscópio, erros no posicionamento podem acumular e aumentar a dificuldade de registrar corretamente as imagens de referência à tensão celular Imagens. Globalmente, esta plataforma facilita uma maior taxa de transferência na recolha de dados de tensão celular.
Com este protocolo, esperamos familiarizar os leitores com a técnica de litografia de digitalização a laser de dois fótons que implementamos para gerar esta plataforma TFM sem referência para medir os componentes de tração no plano e fora do plano gerados pelas células semeadas na superfície. Não coberto neste protocolo é a síntese de alguns dos componentes monoméricos. Em geral, essas reações incluem esquemas de reação de síntese quase idênticos de "um pote" descritos anteriormente21, e alternativas para esses produtos também podem ser compradas. Também pretendemos familiarizar os leitores com as ferramentas baseadas em software que geramos para promover o uso de microscópios de digitalização a laser comercialmente disponíveis como ferramentas de impressão 3D e para facilitar a análise de deslocamentos de marcadores de base.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

Quantificar a deformação material induzida por células fornece informações úteis sobre como as células se sentem e respondem às propriedades físicas de seu microambiente. Embora existam muitas abordagens para medir a cepa material induzida por células, aqui fornecemos uma metodologia para monitorar a deformação com resolução de submícron de forma livre de referência. Usando um processo de padronização fotolitográfica ativado de dois fótons, demonstramos como gerar substratos sintéticos mecanicamente e bioativamente ajustáveis contendo matrizes incorporadas de marcadores de energia fluorescente para medir facilmente três dimensões ( 3D) perfis de deformação de material em resposta a tracções superficiais. Usando esses substratos, os perfis de tensão celular podem ser mapeados usando uma única pilha de imagens 3D de uma célula de interesse. Nosso objetivo com esta metodologia é tornar a microscopia de força de tração uma ferramenta mais acessível e mais fácil de implementar para pesquisadores que estudam processos de mecanotransdução celular, especialmente os recém-chegados ao campo.

Ao longo do protocolo, há uma série de pontos de verificação que fornecem feedback para avaliar a qualidade do procedimento de padronização. Para fornecer alguma introspecção a respeito de como avaliar o progresso em cada um destes checkpoints, nós fornecemos resultados representativos de um experimento real. Os resultados evidenciam a aplicação deste protocolo realizado em um hidrogel fotomodelado preparado para análise de TFM de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os resultados incluem d...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Este protocolo fornece instruções para implementar a litografia multifóton para fabricar matrizes tridimensionais de marcadores de referência fluorescente incorporados em hidrogéis de poli (etileno glicol) para uso como microscopia de força de tração, livre de referências Plataformas. Usando estas instruções, a medida da tensão material 3D e o cálculo de trações celulares são simplificados para promover medidas da força da tração da elevado-produção.

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

A microscopia de força de tração é usada para medir forças geradas por células. Este protocolo simplifica a análise de coleta de dados de força de tração, a fim de torná-lo mais acessível a usuários inexperientes. A principal vantagem dessa técnica em relação às plataformas de microscopia de força de tração sem referência existentes, é que a litografia multifotal permite um redesign rápido e fácil de configuração de padronização de acordo com as necessidades experimentais individuais.Existem muitos passos fundamentais na fabricação e implementação desta nova plataforma de tração sem referências que são mais fáceis de entender através da representação visual em vez de apenas texto. Para fotopolimerização do hidrogel base, primeiro adicione três microlitros da solução pré-polímero em uma fina folha plana de alkanes perfluoroalkoxy, e coloque tiras PDMS de 150 micrômetros de espessura planas ao redor, mas não em contato com a queda da solução pré-polímero. Coloque uma mancha de cobertura silanlada no PDMS, com a gotícula pré-polímera centrada sob a tampa para achatar a gotícula pré-polímero até a espessura dos espaçadores PDMS.Exponha a solução de pré-polímero sanduíche à luz UV por cerca de um minuto. Quando um hidrogel estiver totalmente formado, separe cuidadosamente o deslizamento de cobertura dos espaçadores PDMS. Use adesivo acrílico de dupla performance de alto desempenho para anexar uma placa de Petri de fundo aberto ao deslizamento de tampa.Tome cuidado especial ao aderir o deslizamento de cobertura carregado de hidrogel à placa de Petri. Um prato molhado ou pouca pressão durante a aplicação permitirá que vazamentos se formem, arruinando a amostra. Aplique pressão na superfície de contato adesivo para criar uma vedação completa entre a folha de cobertura, adesivo e placa de Petri, tomando cuidado para não quebrar o vidro.Use PBS filtrado estéril para enxaguar o hidrogel. Em seguida, adicione oito microliters de NVP a 800 microliters da solução de laboratório preparada para a síntese de hidrogel. Para converter uma imagem binária em uma máscara digital, abra o MATLAB e abra e execute o runscript.m roteiro MATLAB. Selecione o arquivo TIF binário para conversão e selecione uma pasta para salvar os arquivos da região. Insira o tamanho final desejado em mícrons da imagem selecionada.A imagem de entrada será dimensionada e dimensionada para corresponder a esses parâmetros. Para criar uma matriz de um único pixel, na Região de Opções de Gerador de Juros, desmarque a caixa remova tic em Pequenas Regiões/Pixel únicos, verifique a caixa tic Squares e desmarque Use em Linhas de Quebra Horizontal. Em seguida, clique em OK. O arquivo OVL será encontrado na pasta especificada anteriormente.Abra o arquivo no software do microscópio e carregue as regiões desejadas que controlaram o obturador a laser durante duas litografias de varredura a laser de fótons. As etapas a seguir devem ser realizadas em condições com luz mínima. Para fabricação de matrizes de marcadores fiduciais em condições de baixa luz, misture completamente 200 microliters da solução de laboratório NVP previamente preparada com 20 miligramas de Alexa Fluor 633 e remova todo o PBS do prato contendo o hidrogel.Adicione a mistura PEG-633 ao hidrogel como uma gota que abrange completamente o hidrogel base e carregue a placa de Petri no suporte de amostra do estágio do microscópio. Em seguida, cubra o prato e deixe a solução de padronização mergulhar no hidrogel por pelo menos 30 minutos, protegido da luz. Para configurar o microscópio para imagem, selecione os lasers e filtros apropriados para visualizar o Alexa Fluor 488.Localize o hidrogel usando o sinal PEG-488 e bloqueie a coleta de comprimentos de onda de emissão mais longos do detector. Use tomografias verticais e horizontais para localizar o centro do hidrogel no plano XY e zerar o estágio nesta posição. Use varreduras de linha na função Z-stack para localizar a superfície do hidrogel e zerar o foco nesta posição.Nivele o hidrogel repetindo a linha escaneia para longe do centro XY para identificar a posição da superfície, ajustando os parafusos definidos para o estágio do microscópio, conforme necessário. Dentro do espaço de trabalho do software do microscópio, crie um arquivo de experimento separado para fotopatterning e defina a potência multifótons para 1,8% e a velocidade de digitalização para seis. Ajuste o tamanho do quadro de imagem e pixels para alcançar um tamanho de pixel de 0,1 micrômetro por pixel e uma proporção de 100 para um e carregue o arquivo das regiões na guia da região.Use uma macro para definir todas as regiões para adquirir e ativar a função Z-stack. Ajuste o espaçamento para 3,5 micrômetros para uma profundidade total de 28 micrômetros e número total de fatias Z de nove. Em seguida, use a função Posições para definir locais específicos no hidrogel onde os conjuntos de marcadores fiduciais serão fotopatterados.À medida que o tempo de imersão se aproxima da marca de 30 minutos, adquira sucessivas varreduras da linha Z-stack da superfície do hidrogel a cada cinco minutos para verificar se há inchaço com base em mudanças na localização da superfície em relação à posição de foco zerada. Se não houver alteração na posição da superfície durante o intervalo de cinco minutos, execute as configurações de padronização e use o laser de 488 nanômetros para verificar se a superfície do hidrogel não se moveu durante a padronização. Em seguida, remova o hidrogel do microscópio, aspire a solução PEG-633 da placa de Petri e enxágue a placa com PBS filtrado estéril.Para adquirir uma célula e imagens de marcador fiduciário, devolva a placa de Petri ao porta-amostras para localizar as áreas padronizadas. Localize uma célula de interesse e adquira uma imagem transmitida ou fluorescente da célula. Em seguida, adquira uma pilha Z da matriz padronizada sob a célula como demonstrado, e adquira um segundo conjunto de imagens transmitidas ou fluorescentes da célula.Ao coletar uma pilha de imagens, as imagens resultantes devem exibir uma matriz regular de recursos padronizados que oscilam em intensidade em função da posição Z dentro da pilha de imagens. O rastreamento. o script m fornece várias imagens diagnósticas, incluindo uma projeção Z dos marcadores fiduciários fluorescentes para avaliar a qualidade do pré-processamento, um plot dos centrosids detectados, a cor codificada em função da posição Z para avaliar a qualidade de detecção do objeto e um gráfico das faixas representando os centrosídeos marcadores detectados que foram ligados em colunas na direção Z para avaliar a qualidade de rastreamento do objeto.O script DISP 3D.m fornece um gráfico de intensidade em função da posição Z para cada coluna de recursos detectados em uma determinada pilha de imagens para avaliar a qualidade dos perfis de intensidade do marcador fiducial. Ambos disp 3D.m e tesoura DISP. m juntos fornecem histogramas do ruído de deslocamento medido em cada uma das dimensões coordenadas cartesianas, bem como mapas de calor interpolados de deslocamento. Além disso, o interp final3D_2.m fornece mapas de calor das trações superficiais calculadas usando o código terceirizado. A coisa mais importante a ser lembrada durante este procedimento é que as soluções que contêm LAP são sensíveis à luz e devem ser protegidas o máximo possível de fontes de luz ambiente. Lembre-se que o NVP é um composto orgânico volátil e deve ser sempre manuseado em uma coifa de fluxo químico.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengenharia

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Microscopia de força de tração de alta produtividade usando PDMS revela efeitos dose-dependentes do fator de crescimento transformador-β na transição epitelial-para-mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...