Name: fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform
Uploaded: 2019-10-06T14:30:00
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O. A. Banda fue apoyado por la financiación de una beca NSF IGERT SBE2 (1144726), fondos de startup proporcionados por la Universidad de Delaware, y los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Cáncer PROGRAMA IMAT (R21CA214299). JHS es apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Cáncer Programa IMAT (R21CA214299) y el Programa de Premios CAREER de la Fundación Nacional de Ciencia (1751797). El acceso a la microscopía fue apoyado por subvenciones del NIH-NIGMS (P20 GM103446), el NSF (IIA-1301765) y el estado de Delaware. El microscopio de iluminación estructurada fue adquirido con fondos del Programa Federal de Becas de Investigación y Desarrollo del Estado de Delaware (16A00471). El microscopio confocal LSM880 utilizado para la litografía de escaneo láser de dos fotones fue adquirido con una beca de instrumentación compartida (S10 OD016361).

1. Fotopolimerización de un hidrogel base PEGDA
<ol><li>
Reactivos de recolección
	<ol>
<li>Recoger el litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP), 3,4 kDa de poli(etileno) diacrilato de glicol (PEGDA), pirrolidona de n-vinilo (NVP), AlexaFluor 488 etiquetado PEGDA (PEG-488), AlexaFluor 633 etiquetado PEGDA (PEG-633) y péptido RGDS PEGylated ( PEG-RGDS) de sus respectivos congeladores y llevar cada uno a temperatura ambiente.</li>
		<li>En tubos de microcentrífuga ámbar separados, mida 3 mg d...

<ol>
	<li>Rauskolb, C., Sun, S., Sun, G., Pan, Y., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+tension+inhibits+Hippo+signaling+through+an+Ajuba-Warts+complex.">Cytoskeletal tension inhibits Hippo signaling through an Ajuba-Warts complex.</a> Cell. 158 (1), 143-156 (2014).</li><li>Huang, S., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Cyclin+D1,+p27Kip1,+and+Cell+Cycle+Progression+in+Human+Capillary+Endothelial+Cells+by+Cell+Shape+and+Cytoskeletal+Tension.">Control of Cyclin D1, p27Kip1, and Cell Cycle Progression in Human Capillary Endothelial Cells by Cell Shape and Cytoskeletal Tension.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (11), 3179-3193 (1998).</li><li>Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Fluctuations+within+Focal+Adhesions+Mediate+ECM-Rigidity+Sensing+to+Guide+Directed+Cell+Migration.">Force Fluctuations within Focal Adhesions Mediate ECM-Rigidity Sensing to Guide Directed Cell Migration.</a> Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).</li><li>&#193;lvarez-Gonz&#225;lez, B., Meili, R., Bastounis, E., Firtel, R. A., Lasheras, J. C., Del &#193;lamo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+balance+of+cortical+tension+and+axial+contractility+enables+fast+amoeboid+migration.">Three-dimensional balance of cortical tension and axial contractility enables fast amoeboid migration.</a> Biophysical Journal. 108 (4), 821-832 (2015).</li><li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling.">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li><li>Reilly, G. C., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+extracellular+matrix+properties+regulate+stem+cell+differentiation.">Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation.</a> Journal of Biomechanics. 43 (1), 55-62 (2010).</li><li>Wen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+matrix+stiffness+and+protein+tethering+in+stem+cell+differentiation.">Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation.</a> Nature Materials. 13 (10), 979-987 (2014).</li><li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation.">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li><li>Steward, A. J., Kelly, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+differentiation.">Mechanical regulation of mesenchymal stem cell differentiation.</a> Journal of Anatomy. 227 (6), 717-731 (2015).</li><li>Lv, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+regulation+of+stem+cell+differentiation+by+matrix+stiffness.">Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 103 (2015).</li><li>Tijore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Cytoskeletal+Tension+in+the+Induction+of+Cardiomyogenic+Differentiation+in+Micropatterned+Human+Mesenchymal+Stem+Cell.">Role of Cytoskeletal Tension in the Induction of Cardiomyogenic Differentiation in Micropatterned Human Mesenchymal Stem Cell.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1399-1407 (2015).</li><li>Lombardi, M. L., Knecht, D. A., Dembo, M., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+in+Dictyostelium+reveals+distinct+roles+for+myosin+II+motor+and+actin-crosslinking+activity+in+polarized+cell+movement.">Traction force microscopy in Dictyostelium reveals distinct roles for myosin II motor and actin-crosslinking activity in polarized cell movement.</a> Journal of Cell Science. 120 (9), 1624-1634 (2007).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+traction+force+microscopy+reveals+out-of-plane+rotational+moments+about+focal+adhesions.">Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (3), 881-886 (2013).</li><li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances.">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Microscopy+of+Migrating+Normal+and+H-ras+Transformed+3T3+Fibroblasts.">Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).</li><li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastomeric+sensor+surfaces+for+high-Throughput+single-cell+force+cytometry.">Elastomeric sensor surfaces for high-Throughput single-cell force cytometry.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).</li><li>Bergert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+reference+free+traction+force+microscopy.">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Schwarz, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cellular+forces+at+focal+adhesions+using+elastic+micro-patterned+substrates.">Measurement of cellular forces at focal adhesions using elastic micro-patterned substrates.</a> Materials Science and Engineering: C. 23 (3), 387-394 (2003).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Pirone, D. M., Gray, D. S., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+lying+on+a+bed+of+microneedles:+An+approach+to+isolate+mechanical+force.">Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).</li><li>Desai, R. a., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+Post-Array-Detectors+(mPADs):+an+Approach+to+Isolate+Mechanical+Forces.">Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces.</a> Journal of Visualized Experiments. , 1-5 (2007).</li><li>Banda, O. A., Sabanayagam, C. R., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference-Free+Traction+Force+Microscopy+Platform+Fabricated+via+Two-Photon+Laser+Scanning+Lithography+Enables+Facile+Measurement+of+Cell-Generated+Forces.">Reference-Free Traction Force Microscopy Platform Fabricated via Two-Photon Laser Scanning Lithography Enables Facile Measurement of Cell-Generated Forces.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 11 (20), 18233-18241 (2019).</li><li>Guo, J., Keller, K. A., Govyadinov, P., Ruchhoeft, P., Slater, J. H., Mayerich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+flow+in+augmented+networks+(AFAN):+an+approach+to+generating+three-dimensional+biomimetic+microfluidic+networks+with+controlled+flow.">Accurate flow in augmented networks (AFAN): an approach to generating three-dimensional biomimetic microfluidic networks with controlled flow.</a> Analytical Methods. 11 (1), 8-16 (2019).</li><li>Heintz, K. A., Mayerich, D., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+Laser-based+Fabrication+of+Vascular-derived+Microfluidic+Networks.">Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-10 (2017).</li><li>Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+3D+Biomimetic+Microfluidic+Networks+in+Hydrogels.">Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (17), 2153-2160 (2016).</li><li>Slater, J. H., Miller, J. S., Yu, S. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Multifaceted+Micropatterned+Surfaces+with+Laser+Scanning+Lithography.">Fabrication of Multifaceted Micropatterned Surfaces with Laser Scanning Lithography.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2876-2888 (2011).</li><li>Slater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+and+Modulation+of+the+Cellular+Architecture+of+a+User-Chosen+Cell+of+Interest+Using+Cell-Derived,+Biomimetic+Patterning.">Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning.</a> ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).</li><li>Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surface+Patterning+Promotes+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation.">Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 8 (34), 21883-21892 (2016).</li><li>Slater, H. J., Banda, A. O., Heintz, A. K., Nie, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+Surfaces+for+Cell+Engineering.">Biomimetic Surfaces for Cell Engineering.</a> Carbon Nanomaterials for Biomedical Applications. , 543-569 (2016).</li><li>. Slater Lab Code Repositories Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/SlaterLab">https://github.com/SlaterLab</a> (2019)</li><li>Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poch&#233;, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomimetic+patterning+in+hydrogels+to+guide+cellular+organization.">Three-dimensional biomimetic patterning in hydrogels to guide cellular organization.</a> Advanced Materials. 24 (17), 2344-2348 (2012).</li><li>Toyjanova, J., Bar-Kochba, E., L&#243;pez-Fagundo, C., Reichner, J., Hoffman-Kim, D., Franck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution,+large+deformation+3D+traction+force+microscopy.">High resolution, large deformation 3D traction force microscopy.</a> PLoS ONE. 9 (4), 1-12 (2014).</li><li>Pradhan, S., Keller, K. A., Sperduto, J. L., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+Laser-Based+Hydrogel+Degradation+and+Applications+in+Cell+and+Tissue+Engineering.">Fundamentals of Laser-Based Hydrogel Degradation and Applications in Cell and Tissue Engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (24), 1-28 (2017).</li><li>Tibbitt, M. W., Shadish, J. A., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymers+for+Multiphoton+Lithography+in+Biomaterials+and+Hydrogels.">Photopolymers for Multiphoton Lithography in Biomaterials and Hydrogels.</a> Multiphoton Lithography. , 183-220 (2016).</li></ol>

El objetivo de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo que alivie gran parte de la dificultad asociada con la generación y análisis de datos TFM. Una vez preparados, los hidrogeles fotopatrónidos son fáciles de usar, lo que requiere sólo el conocimiento de las prácticas estándar de cultivo de tejidos y la microscopía de fluorescencia. El aspecto libre de referencia permite la navegación despreocupada en hidrogeles cargados de células y elimina los engorrosos pasos de procesamiento de imágenes, como ...

La microscopía de fuerza de tracción (TFM) es el proceso de aproximación de las tracciones celulares utilizando campos de desplazamiento interpolados de marcadores fiduciarios generados por una célula adherente y contráctil. Usando TFM, la influencia de las señales mecánicas en el entorno extracelular en procesos celulares importantes como la proliferación, diferenciación y migración se puede investigar1,2,3,4 ,5,6,7,8,9,10,11,12. Desafortunadamente, muchos enfoques existentes pueden ser difíciles de implementar o requieren familiaridad con herramientas analíticas y computacionales altamente especializadas, lo que dificulta el uso de TFM para investigadores inexpertos. Describimos una metodología para generar una plataforma TFM que elimina parte de la dificultad en el análisis al tiempo que proporciona una adquisición de datos de alto rendimiento.
De los enfoques de MFT existentes, el más comúnmente utilizado para cuantificar la tensión del material implica la incorporación de pequeños marcadores fluorescentes (típicamente cuentas fluorescentes del tamaño de nano o micrometro) en un hidrogel deformable, como la poliacrilamida (PAA) o la poli Diacrilato de etilenglicol (PEGDA)13,14,15. Estos enfoques basados en cuentas proporcionan la capacidad de agrupar densamente marcadores fiduciarios alrededor de una celda de interés para maximizar el muestreo de desplazamiento. Desafortunadamente, la distribución de las cuentas a través del hidrogel no se puede controlar directamente por lo que la organización espacial es aleatoria. Esta colocación aleatoria conduce a problemas tales como perlas que están demasiado cerca unas de otras para resolver con precisión, o así se extienden que los parches del sustrato producen datos de baja calidad. La incapacidad de predecir dónde se encuentran los marcadores fiduciarios en ausencia de celdas también crea una restricción que, para cada conjunto recopilado de datos de tracción de celda, también se debe capturar una imagen de referencia adicional de los marcadores subyacentes en un estado relajado. La imagen de referencia es necesaria para que el desplazamiento en la imagen estresada se pueda aproximar como la diferencia entre las imágenes estresadas y no estresadas. Para lograr un estado relajado, las células que se miden se relajan químicamente o se eliminan por completo. Este proceso a menudo impide la adquisición de mediciones experimentales adicionales, inhibe los estudios celulares a largo plazo y limita el rendimiento. Una imagen de referencia también requiere técnicas de registro de imágenes para adaptarse a la deriva que puede haber ocurrido durante la experimentación, lo que a menudo conduce a una coincidencia manual engorrosa de imágenes de estado de tensión para hacer referencia a imágenes.
Otros métodos de MFT considerados libres de referencias, implementan algún tipo de control sobre la distribución de marcadores fiduciarios, ya sea por litografía de alta resolución, impresión de microcontactos o micromoldeo16,17,18 ,19,20. El MFT libre de referencias se logra a través de la suposición de que el estado relajado para cada marcador fiduciario se puede predecir en función de cómo se prescribieron las posiciones de los marcadores durante el proceso de fabricación. Estos métodos permiten la captura completa del estado de tensión de una celda dentro de una única captura de imagen en la que se miden los desplazamientos de marcadores fiduciarios en comparación con una referencia implícita que se puede deducir de la geometría del marcador fiduciario. Mientras que la consistencia en la colocación de marcadores se logra típicamente usando estas plataformas, generalmente sufren de sus propias deficiencias en relación con los enfoques ampliamente utilizados basados en cuentas incluyendo: 1) disminución de la resolución de tracción; 2) disminución de la precisión de los desplazamientos fuera del plano (en algunos casos una incapacidad total de medir); y 3) disminución de la personalización de sustratos y materiales de plataforma (por ejemplo, presentación de ligandos, propiedades mecánicas).
Para abordar estas deficiencias, diseñamos una nueva plataforma tofa de referencia libre de referencias. La plataforma utiliza química activada por multifotones para recruzar un pequeño volumen de un fluoróforo en ubicaciones 3D específicas dentro del hidrogel que sirven como marcadores fiduciarios para medir la tensión del material. De esta manera, hemos diseñado una plataforma que funciona de manera similar a los enfoques basados en perlas, pero con el beneficio significativo de que los marcadores fiduciarios se organizan en matrices cuadriculadas que permiten el seguimiento de deformación unitaria de material libre de referencias. Esta propiedad libre de referencias ofrece muchas ventajas. En primer lugar, permite la monitorización no intrusiva de los estados de tracción celular (es decir, elude la necesidad de relajar o eliminar células para adquirir posiciones de referencia de marcadores fiduciarios desplazados). Este era nuestro objetivo principal en el diseño de este sistema, ya que pretendíamos incorporar otros métodos analíticos posteriores en conjunto con TFM, que pueden ser difíciles con enfoques destructivos de TFM de punto final. En segundo lugar, el uso de una referencia implícita basada en matrices cuadriculadas permite una automatización casi completa del análisis de desplazamiento. La regularidad de las matrices crea un flujo de trabajo predecible donde la aparición de casos excepcionales (es decir, datos de celda de ejemplo que contienen artefactos imprevistos, como el espaciado de marcadores subóptimo socada o las discrepancias de registro) se pueden mantener como mínimo. En tercer lugar, la falta de adquirir una imagen de referencia proporciona la libertad de supervisar muchas celdas en una sola muestra durante largos períodos de tiempo. Esto contrasta con los enfoques tradicionales basados en perlas, donde, dependiendo de la fidelidad de los movimientos escénicos automatizados del microscopio, se pueden acumular errores en el posicionamiento y aumentar la dificultad de registrar correctamente las imágenes de referencia a la tensión celular Imágenes. En general, esta plataforma facilita un mayor rendimiento en la recopilación de datos de tensión celular.
Con este protocolo, esperamos familiarizar a los lectores con la técnica de litografía de escaneo láser de dos fotones que implementamos para generar esta plataforma TFM libre de referencias para medir los componentes de tracción dentro y fuera del plano generados por las células sembradas en la superficie. No se trata en este protocolo es la síntesis de algunos de los componentes monoméricos. En general, estas reacciones incluyen esquemas de reacción de síntesis casi idénticos "una olla" descritos anteriormente21, y alternativas a estos productos también se pueden comprar. También pretendemos familiarizar a los lectores con las herramientas basadas en software que generamos para promover el uso de microscopios de escaneo láser disponibles comercialmente como herramientas de impresión 3D y facilitar el análisis de desplazamientos de marcadores fiduciarios.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc Syringe Filter, 0.2 &#956;m Supor Membrane, Low Protein Binding</td>
			<td>Pall</td>
			<td>PN 4602</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylate-Silane Functionalized #1.5 Coverslips</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Acrylates allow binding of base hydrogel to the glass surface to immobilize the hydrogels. See reference: 21-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-Observer Z1 w/Apotome</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Widefield microscope with structured illumination module used to capture images for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision ii</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on laser-scanning microscope used for multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td>Binds acrylate-silane functionalized coverslips to Petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexmark90 PFW Liner</td>
			<td>FLEXcon</td>
			<td>FLX000620</td>
			<td>Allows lining of double coated tape enabling feeding of tape into plotter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM-880</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Laser-Scanning microscope used for Multiphoton Lithography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018a</td>
			<td>Runs custom scripts to generate lithography instructions for microscope and for analysis of TFM data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model SC Plotter</td>
			<td>USCutter</td>
			<td>SC631E</td>
			<td>Cuts double coated tape into rings to bind coverslips to petri dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective C-Apochromat 40x/1.20 W Corr M27</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Equipped on both widefield microscope and laser-scanning microscope to be used for both lithography and TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-AF633</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Fluorophore-labeled acrylate PEG variant for creating fiducial markers. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-DA</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>Base material for hydrogels. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-RGDS</td>
			<td>in-house</td>
			<td>in-house</td>
			<td>RGDS peptide-labeled mono-acrylate PEG variant for promoting cell-adhesion. See reference: 21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229638</td>
			<td>8mm holes are cut into the center of each dish using a coring bit to fit base hydrogels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating spacers to control base hydrogel thickness (aka PDMS).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, Leur-Lok, 1 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>Allows for filtering of macromer solutions prior to base gel synthesis and subsequent lithography steps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Lamp</td>
			<td>UVP</td>
			<td>Blak-Ray&#174; B-100AP</td>
			<td>Polymerizes base hydrogel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V3409-5G</td>
			<td>Radical accelerant and co-monomer. Improves pegylated fluorophore incorporation during lithography.</td>
		</tr>
	</tbody>
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fabrication and implementation of a reference-free traction force microscopy platform

La cuantificación de la deformación del material inducida por células proporciona información útil sobre cómo las células detectan y responden a las propiedades físicas de su microambiente. Si bien existen muchos enfoques para medir la tensión de material inducida por las células, aquí proporcionamos una metodología para monitorear la tensión con resolución submicrones de una manera libre de referencia. Mediante un proceso de patrón fotolitográfico activado por dos fotones, demostramos cómo generar sustratos sintéticos mecánica y bioactivamente ajustables que contienen matrices incrustadas de marcadores fiduciarios fluorescentes para medir fácilmente tridimensionales ( 3D) perfiles de deformación del material en respuesta a las tracciones superficiales. Usando estos sustratos, los perfiles de tensión celular se pueden mapear usando una sola pila de imágenes 3D de una celda de interés. Nuestro objetivo con esta metodología es hacer de la microscopía de fuerza de tracción una herramienta más accesible y fácil de implementar para los investigadores que estudian los procesos de mecanotransducción celular, especialmente los recién llegados al campo.

A lo largo del protocolo, hay una serie de puntos de control que proporcionan retroalimentación para evaluar la calidad del procedimiento de patrón. Para proporcionar información sobre cómo evaluar el progreso en cada uno de estos puntos de control, proporcionamos resultados representativos de un experimento real. Los resultados ponen de relieve la aplicación de este protocolo realizado en un hidrogel fotopatrón preparado para el análisis DeMF de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC). Los resu...

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Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Este protocolo proporciona instrucciones para implementar litografía multifotópica para fabricar matrices tridimensionales de marcadores fiduciarios fluorescentes incrustados en hidrogeles basados en poli(etilenglicol) para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia y de tracción para su uso como microscopía de fuerza de tracción libre de referencia Plataformas. Usando estas instrucciones, la medición de la tensión de material 3D y el cálculo de las tracciones celulares se simplificaparan para promover mediciones de fuerza de tracción de alto rendimiento.

Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

La microscopía de fuerza de tracción se utiliza para medir las fuerzas generadas por las células. Este protocolo simplifica el análisis de recogida de datos de fuerza de tracción, con el fin de hacerlo más accesible a los usuarios inexpertos. La principal ventaja de esta técnica sobre las plataformas de microscopía de fuerza de tracción sin referencia existentes, es que la litografía multifotonal permite un rediseño rápido y fácil de la configuración de modelado de acuerdo con las necesidades experimentales individuales.Hay muchos pasos clave en la fabricación e implementación de esta nueva plataforma de tracción sin referencia que son más fáciles de entender a través de la representación visual en lugar de solo texto. Para la fotopolimerización del hidrogel base, agregue primero tres microlitros de la solución de prepolímero en una lámina delgada y plana de alcanos perfluoroalkoxi, y coloque tiras planas PDMS de 150 micrómetros de espesor que rodean, pero no en contacto con, la gota de solución de prepolímero. Coloque un cubreobjetos silanizados de acrilato en el PDMS, con la gota de prepolimero centrada debajo del cubreobjetos para aplanar la gota de prepolimero al grosor de los espaciadores PDMS.Exponga la solución de prepolimero empareda a la luz UV durante aproximadamente un minuto. Cuando un hidrogel esté completamente formado, separe cuidadosamente el cubreobjetos de los espaciadores PDMS. Utilice adhesivo acrílico de doble cara de alto rendimiento para fijar una placa Petri de fondo abierto al cubreobjetos.Tenga especial cuidado al adherir el cubreobjetos cargado de hidrogel al plato Petri. Un plato húmedo o muy poca presión durante la aplicación permitirá que se formen fugas, arruinando la muestra. Aplique presión a la superficie de contacto adhesiva para crear un sello completo entre el cubreobjetos, el adhesivo y la placa Petri, teniendo cuidado de no romper el vidrio.Utilice PBS filtrado estéril para enjuagar el hidrogel. A continuación, agregue ocho microlitros de NVP a 800 microlitros de la solución de laboratorio preparada para la síntesis de hidrogel. Para convertir una imagen binaria en una máscara digital, abra MATLAB y abra y ejecute el runscript.script m MATLAB. Seleccione el archivo TIF binario para la conversión y seleccione una carpeta para guardar los archivos de la región. Introduzca el tamaño final deseado en micras de la imagen seleccionada.La imagen de entrada se escalará y se acotará para que coincida con estos parámetros. Para crear una matriz de un solo píxel, en Opciones del generador de región de interés, desactive la casilla Quitar tic en Regiones pequeñas/Píxeles únicos, active la casilla de tic Cuadrados y desactive Usar en Líneas de rotura horizontales. A continuación, haga clic en Aceptar. El archivo OVL se encuentra en la carpeta especificada anteriormente.Abra el archivo en el software del microscopio y cargue las regiones deseadas que controlaron el obturador láser durante dos litografías de escaneo láser de fotón. Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones con una luz mínima. Para la fabricación de matrices de marcadores fiduciales en condiciones de poca luz, mezcle a fondo 200 microlitros de la solución de laboratorio NVP previamente preparada con 20 miligramos de Alexa Fluor 633 y retire todo el PBS del plato que contiene el hidrogel.Añadir la mezcla PEG-633 al hidrogel como una gota que engloba completamente el hidrogel base y cargar el plato Petri en el portacuchillas de la etapa del microscopio. A continuación, cubra el plato y deje que la solución de patrón se empape en el hidrogel durante al menos 30 minutos, protegido de la luz. Para configurar el microscopio para la toma de imágenes, seleccione los láseres y filtros adecuados para visualizar Alexa Fluor 488.Localice el hidrogel utilizando la señal PEG-488 y bloquee la recolección de longitudes de onda de emisión más largas del detector. Utilice escaneos de teselas verticales y horizontales para localizar el centro del hidrogel en el plano XY y poner a cero el escenario en esta posición. Utilice escaneos de línea en la función Z-stack para localizar la superficie del hidrogel y poner a cero el foco en esta posición.Nivele el hidrogel repitiendo los escaneos de línea lejos del centro XY para identificar la posición de la superficie, ajustando los tornillos establecidos para la etapa del microscopio, según sea necesario. Dentro del espacio de trabajo del software del microscopio, cree un archivo de experimento independiente para fotopatrón y establezca la potencia de varios fotones en 1,8% y la velocidad de escaneo en seis. Ajuste el tamaño del marco de la imagen y los píxeles para lograr un tamaño de píxel de 0,1 micrómetros por píxel y una relación de aspecto de 100 a uno y cargue el archivo de regiones en la pestaña de la región.Utilice una macro para establecer todas las regiones que se adquirirá y activar la función Z-stack. Establezca el espaciado en 3,5 micrómetros para una profundidad total de 28 micrómetros y el número total de rodajas Z de nueve. A continuación, utilice la función Posiciones para establecer ubicaciones específicas en el hidrogel donde se fotopatrnará las matrices de marcadores fiduciarios.A medida que el tiempo de remojo se acerca a la marca de 30 minutos, adquiera sucesivas exploraciones de línea Z-pila de la superficie del hidrogel cada cinco minutos para comprobar si hay hinchazón en función de los cambios en la ubicación de la superficie en relación con la posición de enfoque a cero. Si no se ha producido ningún cambio en la posición de la superficie durante el intervalo de cinco minutos, ejecute los ajustes de patrón y utilice el láser de 488 nanómetros para verificar que la superficie del hidrogel no se movió durante el patrón. A continuación, retire el hidrogel del microscopio, aspire la solución PEG-633 de la placa Petri y enjuague el plato con PBS filtrado estéril.Para adquirir una celda e imágenes de marcadores fiduciarios, devuelva el plato Petri al portacuchillas para localizar las áreas con patrones. Localice una celda de interés y adquiera una imagen transmitida o fluorescente de la celda. A continuación, adquiera una pila Z de la matriz con patrones debajo de la celda como se ha demostrado y adquiera un segundo conjunto de imágenes transmitidas o fluorescentes de la celda.Al recopilar una pila de imágenes, las imágenes resultantes deben mostrar una matriz regular de entidades con patrones que oscilan en intensidad en función de la posición Z dentro de la pila de imágenes. El rastreo. El script m proporciona varias imágenes de diagnóstico, incluyendo una proyección Z de los marcadores fiduciarios fluorescentes para evaluar la calidad de preprocesamiento, una gráfica de los centroides detectados, color codificado en función de la posición Z para evaluar la calidad de detección de objetos, y una gráfica de las pistas que representan los centroides marcadores detectados que se han vinculado en columnas en la dirección Z para evaluar la calidad de seguimiento del objeto.El script DISP 3D.m proporciona una gráfica de intensidad en función de la posición Z para cada columna de entidades detectadas en una pila de imágenes determinada para evaluar la calidad de los perfiles de intensidad del marcador fiduciario. Ambos DISP 3D.m y disp cizallamiento. m juntos proporcionan histogramas del ruido de desplazamiento medido en cada una de las dimensiones de coordenadas cartesianas, así como mapas de calor interpolados de desplazamiento. Además, el interp final3D_2.m proporciona mapas de calor de las tracciones superficiales calculadas utilizando el código externalizado. Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que las soluciones que contienen LAP son sensibles a la luz y deben protegerse tanto como sea posible de fuentes de luz ambiental. Recuerde que el NVP es un compuesto orgánico volátil y siempre debe ser manejado en una campana de flujo químico.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Un nuevo método para la localización de cuentas fluorescentes Reporter cerca de la superficie de la célula de la cultura para Microscopía de Fuerza de Tracción

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-ÃƒÅ½Ã‚Â² on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

Microscopía de fuerza de tracción de alto rendimiento Mediante PDMS revela efectos dependientes de la dosis de transformar el factor de crecimiento en la transición epitelial a mesenquimal

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Implementación de microscopía de reflexión de interferencias para imágenes de microtúbulos sin etiquetas y de alta velocidad

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...