Name: synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications
Uploaded: 2020-03-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

المؤلفون ممتنون لAlzbeta Magdolenova لمساعدتها في تدفق قياس الخلايا. ويعترف المؤلفون بالدعم المالي المقدم من مشروع GACR Nr. 18-12533S. وقد أُجري الفحص المجهري في مختبر الكونكورت والتنظير المجهري للفلورسينس الذي شارك في تمويله صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي وميزانية الدولة للجمهورية التشيكية، وهي مشاريع رقم 1000.100. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 و CZ.2.16/3.1.00/21515، وبدعم من مشروع جمهورية تحرير جمهورية التشيك-BioImaging الكبيرة LM2015062.

1. إعداد AuNCs شبه الأشعة تحت الحمراء الباعثة (1)
<ol><li>أضف 7.8 ملغ (37.8 ميكرومول) حمض الثيوكتيك (TA) و60 ميكرولتر من 2 M NaOH إلى 23.4 مل من الماء فائق النقاء (المقاومة 18.2 MΟ.cm عند 25 درجة مئوية) وحرك (على الأقل 1000 دورة في الدقيقة) حتى يذوب تمامًا (~ 15-20 دقيقة). لإنحلال أسرع من TA، سونيكات الخليط. للتوليف، ينصح حل TA...

تم تصنيع AuNCs الباعثة للنير باستخدام نهج من أسفل إلى أعلى حيث تم التعامل مع محلول السلائف الذهبية (HAuCl4)مع ليغاند اتيول مناسبة ، تليها تخفيض Au3 +. الحد من الأيونات المعدنية في محلول مائي تميل إلى تجميع والنتائج في الجسيمات النانوية الكبيرة بدلا من NCs صغيرة جدا21. لإعداد ...

في العقد الماضي، ظهرت ultrasmall (≤ 2 نانومتر) photoluminescent الذهب nanoclusters (PL AuNCs) كتحقيقات واعدة لكل من البحوث الأساسية والتطبيقات العملية11،2،,3،,44،5،,6،,7،,8،,9،,10. وتشمل خصائصها العديدة المرغوبة ارتفاع عدم الاستقرار الضوئي، وأقصى قدر من الانبعاثات الغيرقابلة، وأعمار الانبعاثات الطويلة، وتحولات ستوكس الكبيرة، والسمية المنخفضة، والتوافق البيولوجي الجيد، وإزالة الكلى، والاقتران الحيوي السهل. يمكن أن توفر الـ PL AuNCs إضاءة ضوئية من الأزرق إلى المنطقة الطيفية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) ، اعتمادًا على عدد الذرات داخل الكتلة11 وطبيعة الليغاند السطحي12. NIR (650-900 نانومتر) AuNCs الباعثة واعدة بشكل خاص لطويلة الأجل في المختبر وفي الجسم الحي تصوير الخلايا والأنسجة، لأنها توفر نسبة عالية إشارة إلى ضوضاء بسبب الحد الأدنى من التداخل مع الفلور الفلورية الجوهرية، وضعف التشتت والامتصاص، واختراق الأنسجة العالية من ضوء NIR13،14.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت النهج المختلفة التي تستفيد من التفاعلات الكوفة Au-S لإعداد NIR-PL AuNCs توج مع مجموعة متنوعة من الليغاند التي تحتوي على ثيول13،15،16،17. بالنسبة للتطبيقات الطبية الحيوية، يجب أن تكون أوانسياب المكونات الفعالة بمكون بيولوجي لتسهيل التفاعلات الملزمة. وهكذا، AuNCs مع استقرار الغرواني العالية التي هي قابلة للوظائف بسهولة في المذيبات المائية هي مرغوب ة للغاية. الهدف العام للبروتوكول الحالي هو وصف إعداد18 من AuNCs المبلغ عنها سابقًا مع مجموعة حمض كاربوكسيليك قابلة للتشغيل على السطح من خلال استخدام حمض الثيوكتيك وجلايكول البولي إيثيلين (PEG) في بيئة مائية بالتفصيل واقترانها مع جزيئات تحمل أمينًا أساسيًا يتبع طريقة اقتران الحمض الأمين. بسبب سهولة التوليف والتكاثر العالي ، يمكن استخدام هذا البروتوكول وتكييفه من قبل باحثين من خلفيات غير كيميائية.
أحد المتطلبات الرئيسية لتطبيقات AuNCs في البحوث الطبية الحيوية هو القدرة على مراقبة وقياس AuNCs داخل الخلايا. من بين الطرق المتاحة لرصد استيعاب الجسيمات النانوية من قبل الخلايا، والتدفق الخلوي (FCM) والمسح المجهري للأشعة المحورية (CLSM) توفر قوية، وطرق عالية الإنتاجية التي تسمح قياسات سريعة من استيعاب المواد النانوية الفلورية في عدد كبير من الخلايا19. هنا ، تم تقديم طريقة FCM و CLSM للقياس والتحليل المباشرين لـ PL AuNCs داخل الخلايا ، دون الحاجة إلى أصباغ إضافية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>TCI Chemicals</td>
			<td>D1601</td>
			<td>https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15130-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Thioctic acid, 98%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L04711</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 35%</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>19350-11000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36400</td>
			<td>https://www.alfa.com/en/catalog/036400/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-(2-Mercaptoethyl)-O&#8242;-methylpolyethylene glycol 2000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>743127</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&#38;region=CZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16200-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>452882</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&#38;region=CZ&#38;gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>16610-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate dihydrate</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>12330-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide pellets</td>
			<td>PENTA s.r.o.</td>
			<td>15740-31000</td>
			<td>https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>X12223</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of near-infrared emitting gold nanoclusters for biological applications

على مدى العقد الماضي، شهدت مجموعات النانو الذهبية الفلورية (AuNCs) شعبية متزايدة في التطبيقات البيولوجية وكرست جهود هائلة لتطويرها. في هذا البروتوكول، تم وصف طريقة متطورة وسهلة مؤخرًا لإعداد الأونيك القابلة للذوبان في الماء والمتوافقة بيولوجيًا والغروانية القريبة من الأشعة تحت الحمراء الباعثة للأشعة تحت الحمراء. هذا غرفة درجة الحرارة، من أسفل إلى أعلى التركيب الكيميائي يوفر AuNCs وظيفية بسهولة توج مع حمض الثيوتيك والبولي إيثيلين glycol المعدلة ثيول في محلول مائي. النهج الاصطناعية لا يتطلب المذيبات العضوية أو تبادل ليغاند إضافية ولا معرفة واسعة من الكيمياء الاصطناعية للتكاثر. تقدم الـ AuNCs الناتجة أحماض كربوكسيليك سطحية حرة ، والتي يمكن أن تكون وظيفية مع جزيئات بيولوجية مختلفة تحمل مجموعة أمين مجانية دون التأثير سلبًا على خصائص الإضاءة الضوئية للأونيك. كما تم وصف إجراء سريع وموثوق به للقياس الكمي للخلايا المتدفقة والتصوير المجهري المحوري لمن يناب أونك من قبل خلايا HeLa. بسبب التحول ستوكس كبيرة، الإعداد السليم للمرشحات في قياس التدفق الخلوي والمجهر confocal ضروري للكشف الفعال من photoluminescence الأشعة تحت الحمراء القريبة من AuNCs.

تم إعداد NIR PL AuNCs من Au3+ في وجود TA ، ثم تم ربط PEG (MW 2000) على سطح AuNC للحصول على 1 بعد سير العمل المبين في الشكل 1. قدم اقتران أميديك بين 1 و 3-(أمينوبروبيل) ثلاثي الفينيل فوسفونيوم (TPP) بروميد 2. كما هو متوقع ، أشارت أطياف الامتصاص(الشكل 2a)</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications at JoVE.com

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

طريقة موثوقة وسهلة الاستنساخ لإعداد وظيفية، والأشعة تحت الحمراء القريبة تنبعث منها مجموعات نانوية الذهب المنبعث بالضوء والكشف المباشر داخل خلايا هيلا عن طريق تدفق قياس الخلايا والمسح المجهري ليزر بؤري.

تركيب مجموعات نانوية ذهبية قريبة من الأشعة تحت الحمراء للتطبيقات البيولوجية

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

هذا هو بروتوكول بسيط لتوليف وظيفية ، وشبه الأشعة تحت الحمراء التي تنبعث منها الفوتوناتية الذهب الكشف عنها والكشف عنها باستخدام الإعداد التجاري. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أن مرفق من ليجوند ثيول وظيفية واقتران ليغاند أمين وظيفية على سطح نانوقود الذهب لا يؤثر سلبا على خصائص فوتووميينسنت والاستقرار لفائف. ويمكن تصور أن الجمع بين خصائص الإضاءة الضوئية المكثفة والاقتران مع الجزيئات الحيوية سيسمح للكشف في المختبر عن أنيليسيد منخفضة التركيز، والنفس الحيوي، والذوبان، والتصوير الحيوي.إثبات الإجراء سيكون كلوديا كفاكوفا، طالب الدكتوراه بلدي. سيتم إثبات عملية استئصال التدفق من قبل مساعدة الأبحاث ألبيتا ماغدولنوفا. سيتم عرض الجزء المجهري من قبل فاكلاف بوكان، وهو طالب غراد من مختبر لينكا ليبوسوفا.ابدأ بإضافة 7.8 ملليغرام من حمض ثيوكتيك في 60 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم من نوع اثنين من المولار إلى 23.4 ملليلتر من الماء فائق السخ وتحريك الخليط حتى يذوب تماما. أضف التالي 10.2 ميكرولترات من رابع كلوريد الهيدروجين إلى المحلول، وبعد 15 دقيقة، إضافة 480 ميكرولترات من بوروهيدريد الصوديوم الطازجة المعدة أثناء التحريك بقوة. مواصلة اثارة خليط التفاعل بين عشية وضحاها.في اليوم التالي ، قم بتنقية الحل باستخدام ثلاث دورات من الترشيح الفائق مع قطع الوزن الجزيئي من ثلاثة كيلودالون ، ثم إضافة 15.6 ملليغرام من البولي إيثيلين منتهية الغليكول إلى المحلول ، وضبط درجة حُكم الH إلى ما بين 7 و 7.5 ، وحركة الخليط بين عشية وضحاها للحصول على نانوكلستر 1. في اليوم التالي، كرر ثلاث دورات من الطرد المركزي والترشيح لتنقية التشتت. اخلط محلول نانوكستر 1 مع برنامج النقاط التجارية، ثم اضبط درجة PH إلى 4.5 مع كلوريد الهيدروجين المولر الواحد.بدء التفاعل عن طريق إضافة فائض من EDC HCL ورصد درجة ح H من الخليط للساعة الأولى. إذا زاد الـ (PH) فوق ستة، قللي منه بإضافة كلوريد الهيدروجين. يُحرّك خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي، تنفيذ ثلاث دورات من الطرد المركزي والترشيح كما هو موضح سابقا للحصول على نانوكلستر 2. تمييع 2 مع الماء فائقة الخطورة إلى حجم 24 ملليلتر. بذور الخلايا في لوحة 12-جيدا في كثافة 20،000 الخلايا في البئر.احتضان لهم لمدة 48 ساعة، ثم pirate المتوسطة وإضافة 400 ميكرولترات من ثقافة كاملة المتوسطة مع أو بدون 500 ميكروغرام من الجسيمات النانوية في بئر. إعادة الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لاداخلية نانوكلستر. بعد ساعتين، قم بفصل الخلايا باستخدام التربسينية القياسية.جمعها في أنابيب الطرد المجهري البولي بروبلين وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 350 مرات ز وأربع درجات مئوية. إعداد المخزن المؤقت FCM وفقا لاتجاهات المخطوطات واستخدام ملليلتر واحد من العازلة لغسل الكريات الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى، ثم إعادة تعليقها في 500 ميكرولترات من العازل FCM وتخزينها في أربع درجات مئوية.قبل الحصول على العينة، تأكد من أن الصك لديه التكوين البصري المقابلة. ضع 780 أكثر من 60 فلتر bandpass أمام كاشف 405A. تصفية جميع العينات باستخدام أنبوب البوليسترين خمس ملليلتر مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية.تحديد تكوين مقياس السيتات. رسم رسم نقطة معلمتين من FSC-A و SSC-A لإظهار توزيع الخلايا. لاستثناء المضاعفة، قم بإنشاء رسم نقطة ثنائي المعلمة من FSC-H مقابل FSC-A و رسم مدرج مدرج تكراري أحادي المعلمة لمنطقة القناة الفلورية لمراقبة كثافة الفلورس في العينة.الحصول على عينة غير المعالجة بمعدل تدفق منخفض لتقليل الأحداث المتزامنة. أثناء الاستحواذ ، قم بضبط الفولتية PMT للحصول على السكان غير المعالجين على نطاق واسع على مؤامرة FSC مقابل SSC. إذا لزم الأمر، ضبط الفولتية PMT لقناة FL لوضع السكان غير المطهية على الزاوية اليسرى من الرسم البياني.ثم حدد علامة تبويب البوابة المحددة في البرنامج وارسم بوابة مناسبة حول السكان المطلوبين. الخلايا داخل البوابة ستنتقل إلى نقطة التفتيش التالية قم بإعداد التجربة وتسجيل البيانات.في 24 ساعة بعد البذر، إضافة 100 ميكروغرام من 2 إلى كل غرفة طبق تحتوي على 0.5 ملليلتر من المتوسطة مع خلايا هيلا. إعادة الطبق إلى الحاضنة والسماح للخلايا إلى استيعاب نانوتقود، ثم تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع مسبقة الاحتياز، والمتوسطة الطازجة. املأ كل غرفة بـ 800 ميكرولترات من الوسط الطازج، وامضي في التصوير.لتصوير الخلايا، استخدم مجهرًا مشتركًا مع Plan-APOCHROMAT وعدسة هدفية 63x للنفط. قم بتركيب الطبق على المسرح المقلوب مع الغرفة التي تم تسخينها حتى 37 درجة مئوية وزودها بغلاف جوي مرطب 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. الكشف عن جسيمات نانوية ذهبية داخلية باستخدام ليزر 405 نانومتر تعيين إلى 2٪ قوة مع تقسيم شعاع المناسبة، وتحديد نطاق موجات الكشف بين 650 و 760 نانومتر.تعيين دقة الصورة إلى 2048 بواسطة 2048 بكسل. في إعداد سرعة الاستحواذ ، تهدف إلى بكسل يسكن الوقت حول أربعة ميكروثانية والحصول على الصورة مع متوسط مرتين ، ثم تعيين الثقب على وحدة منطقة واحدة ، وحساسية أعلى ، واستخدام وضع العد الفوتون. للإضاءة الصحيحة والضوء المنقول مع DIC استخدام إعداد كوهلر من المكثف ووقف الميدان.للحصول على الضوء المنقول، استخدم ليزر 488 نانومتر بقوة 0.7٪ دون أي جهاز للكشف عن الفلورسينس المخصص، مع التأكد من تعيين تقسيم شعاع مناسب للطول الموجي بالليزر. وأشارت أطياف الامتصاص إلى أن الكتل النانوية الذهبية 1 و2 لا تحتويان على نطاق بلاسمون سطحي مميز وتظهر انبعاثات واسعة من 550 إلى 850 نانومتر. زادت الإضاءة الضوئية بقوة بعد ارتباط برنامج النقاط التجارية على سطح 1.كما كانت الانبعاثات من المجموعات النانوية مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر. كان الانبعاثات مستقرًا وكان طول موجيته مستقلًا عن الطول الموجي للإثارة ولكن كانت الشدة قصوى عندما كانت متحمسة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تم استخدام قياس الخلايا التدفق لتأكيد امتصاص نانوتكستر 2 من قبل خلايا HeLa.كان بالقرب من الفلورا على حد سواء تعتمد على حضانة الوقت وتركيز نانوكلستر 2. تم تصوير الـ nanoclusters الذهب داخل الخلايا بشكل غير تلقائي مع مجهر مسح ليزر مشترك قياسي. كانت الخلايا ملطخة بالنانو كوستر 2 ، وبعد 24 ساعة من الحضانة ، لوحظت الإضاءة الضوئية الحمراء الساطعة داخل الخلايا.عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نتذكر أن إزالة borohydride الصوديوم غير المنقحة والمائية مهم جدا، وإلا ثيولated البولي ايثيلين جلايكول لن ترتبط على سطح نانوكلوستر الذهب. بالإضافة إلى ذلك، يبدأ الضوئية من اللودادات النانوية الذهبية من 560 نانومتر. لتجنب الخلفية autofluorescent في تجارب المجهر confocal ، ينبغي جمع الفوتونات فوق 650 نانومتر.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

التوليف ، والجمعية ، وتوصيف أحادي الطبقة المحمية الجسيمات النانوية الذهبية للأفلام كهربية البروتين أحادي الطبقة

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

الذهب Nanostar التجميعي مع أسلوب بذور فضة النمو وساطة

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

النطاق العريض للكشف عن الموجات فوق الصوتية البصرية للتطبيقات التصوير الطبي

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

التوليف من ألياف نانوية أساس كيراتين للهندسة الطبية الحيوية

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

توليف الذهب الجسيمات النانوية الليبوزومات المتكاملة صور متجاوبة وقياس تلك Microbubble التجويف على نبض الليزر الإثارة

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

انتقائية القضاء خلية من الثقافة 3D المختلطة باستخدام تقنية الأشعة تحت الحمراء بالقرب من Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

إعداد السيليكون أسلاك متناهية الصغر حقل التأثير الترانزستور لتطبيقات كيميائية وBiosensing

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...